Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Химическая характеристика группы фторхинолонов 13
1.2. Фармакологическая характеристика группы фторхинолонов 13
1.3. Левофлоксацин как представитель группы фторхинолонов. Химическая и фармакологическая характеристика
1.4. Методы фармацевтического анализа препаратов группы фторхинолонов
1.4.1. Спектральные методы анализа. Флюориметрия 20
1.4.2. Химические и электрохимические методы анализа 23
1.4.3. Хроматографические методы анализа 25
1.4.4. Методы анализа оптической и энантиомерной чистоты фторхинолонов
1.5. Методы анализа левофлоксацина 37
1.6. Технологические подходы к разработке лекарственных 42
препаратов группы фторхинолонов
1.6.1. Роль вспомогательных веществ в производстве таблеток фторхинолонов
1.6.2. Роль пленочных покрытий в технологии таблеток 45
фторхинолонов Заключение 47
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 49
2.1. Объекты исследований 49
2.2. Методы исследования 53
2.2.1. Методы контроля качества субстанции и лекарственной формы левофлоксацина 53
2.2.2. Методики определения технологических характеристик порошков и гранулятов 56
2.2.3. Методики оценки технологических показателей таблеток левофлоксацина 60
ГЛАВА 3. Изучение физико-химических свойств и разработка методик анализа субстанции левофлоксацина 61
3.1. Изучение физико-химических свойств субстанции левофлоксацина 61
3.1.1. Внешний вид и температура плавления субстанции левофлоксацина 61
3.1.2. Растворимость субстанции левофлоксацина 61
3.1.3. Определение удельного вращения субстанции левофлоксацина. 62
3.1.4. Определение потери в массе при высушивании образцов субстанции 62
3.1.5. Изучение спектральных характеристик левофлоксацина 63
3.1.5.1. УФ-спектроскопия 64
3.1.5.2. ИК-спектроскопия 65
3.1.5.3. ПМР-спектроскопия 66
3.2. Хроматографические методы в анализе субстанции левофлоксацина 67
3.2.1. Разработка методики определения посторонних примесей в субстанции левофлоксацина 68
3.2.2. Определение содержания R-офлоксацина в субстанции левофлоксацина 77
3.2.3. Газо-жидкостная хроматография в анализе субстанции левофлоксацина 82
3.3. Разработка методики количественного определения субстанции левофлоксацина 87
3.3.1. Метод неводного титрования 87
3.3.2. Метод ВЭЖХ 89
3.4. Определение стабильности субстанции левофлоксацина и 93
определение сроков годности
3.5. Установление норм качества субстанции левофлоксацина 93
Выводы 98
ГЛАВА 4. Разработка и создание твердой лекарственной формы левофлоксацина и ее стандартизация 99
4.1. Изучение технологических характеристик субстанции левофлоксацина 99
4.2. Разработка состава и технологии таблеток 100
4.2.1. Подбор оптимальной технологии для получения таблеток левофлоксацина 101
4.2.2. Разработка состава таблетированной формы левофлоксацина... 102
4.2.3 Изучение влияния вспомогательных веществ на технологические характеристики модельных смесей и таблеток
левофлоксацина с применением дисперсионного анализа 103
4.2.4 Определение зависимости времени распадаемости таблеток левофлоксацина от типа и количества дезинтегрантов, влияние увлажняющего агента на распадаемость таблеток левофлоксацина, полученных методом влажной грануляции 108
4.2.5. Влияние влажности гранулята и давления прессования на качество таблеток левофлоксацина, полученных методом влажной грануляции 116
4.2.6. Аргументирование выбора пленочных покрытий 118
4.2.7. Определение эквивалентности профилей растворения разработанных таблеток левофлоксацина и препарата сравнения «Таваник» 120
4.3. Технологическая схема производства таблеток левофлоксацина... 121
4.4. Разработка методик анализа и установление норм качества таблеток левофлоксацина 124
4.4.1. Внешний вид 124
4.4.2.Подлинность 125
4.4.3. Средняя масса и отклонения от средней массы 129
4.4.4. Распадаемость 129
4.4.5.Посторонние примеси 129
4.4.6 Количественное определение 133
4.4.7.Разработка методики определения показателя «Растворение»... 138
4.4.8 Установление сроков годности таблеток левофлоксацина 140
4.4.9 Установление норм качества таблеток левофлоксацина 142
Выводы 143
Общие выводы 144
Список литературы
- Левофлоксацин как представитель группы фторхинолонов. Химическая и фармакологическая характеристика
- Методики определения технологических характеристик порошков и гранулятов
- Изучение спектральных характеристик левофлоксацина
- Влияние влажности гранулята и давления прессования на качество таблеток левофлоксацина, полученных методом влажной грануляции
Левофлоксацин как представитель группы фторхинолонов. Химическая и фармакологическая характеристика
Нами был проведен анализ литературы, касающейся методов качественного и количественного анализа фторхинолонов (в частности, левофлоксацина) в виде субстанций, лекарственных препаратов, а также в биологических объектах.
В основном, для качественного и количественного анализа фторхинолонов и в биологических объектах, и в лекарственных формах, в настоящее время используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с различными способами детектирования -спектрофотометрическим [43, 149, 169], флюориметрическим [103, 63 и др.], масс-спектрометрическим [54].
Однако имеются данные по применению и других методов анализа, таких как УФ-, ИК-, ПМР-спектроскопия, флюориметрия, химические и электрохимические методы, а также тонкослойная хроматография и капиллярный электрофорез. Для анализа фторхинолонов были также предложены методы ИК-спектроскопии [158, 159 и др.], ЯМР !Н -спектроскопии [112], электрохимические и химические методы [42,47, 81, 96, 109, 136], хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ и ВЭТСХ) [44, 150, 142], капиллярный электрофорез [48, 82, 43, 181, 182]. 1.4.1. Спектральные методы анализа. Флюориметрия
Для анализа фторхинолонов применяются методы спектрофотометрии в ультрафиолетовой [131.] и в видимой области спектра после образования окрашенных продуктов: комплексов с ионами металлов, например, железа III в сернокислой среде [86] или рейнекатом аммония [47, 136], ионных ассоциатов с индикаторами (метиловым оранжевым, бромкрезоловым зеленым, бромкрезоловым пурпуровым, бромтимоловым синим, тропеолином 00 и др. в кислых средах [46, 116, 141], путем косвенного определения по окрашенным продуктам окисления, например, по реакции с перманганатом калия [119] или с ванадатом аммония в сернокислой среде [136].
Анализ фторхинолонов также проводят методом флюориметрии, основанной на собственной флюоресценции фторхинолонов под действием возбуждающего электромагнитного излучения [85, 137, 136] и флюоресценции комплексов фторхинолонов с лантаноидами, например, с тербием ТЬ (III) [64, 124], европием Ей (III) [65, 87] и иттрием [52, 189].Была показана возможность применения реакции образования комплексов ципрофлоксацина с тербием (III) для постколоночной дериватизации при определении ципрофлоксацина методом обращено-фазной ВЭЖХ [77, 79, 140].
Описаны методики количественного анализа, основанные на измерении поглощения или флюоресценции комплексов с переносом заряда фторхинолонов с органическими реагентами - 2,3,5,6-тетрабром-1,4-бензохиноном [80, 177], 2,3,5,6-тетрахлор-пара-бензохиноном [84, 173], 7,7,8,8-тетрацианохинодиметаном [72], хлоранилиновой кислотой, тетрацианоэтиленом, 2,3-дихлор-5,6-дициано-пара-бензохиноном [71, 115] и др. Подавляющее большинство описанных выше методик спектрофотометрии и флюориметрии разработаны для количественного анализа фторхинолонов в биологических объектах, но некоторые из них также можно применять и для анализа лекарственных препаратов.
В фармацевтической практике наиболее часто применяется метод прямой спектро фотометрии, основанной на собственном поглощении химических соединений в растворах электромагнитного излучения в УФ-области спектра.
Метод прямой УФ-спектро фотометрии применяется для подтверждения подлинности субстанции оксолиновой кислоты (по наличию максимумов поглощения при 260, 322 и 336 нм и соотношению поглощения при максимумах 269 и 336 нм от 4,9 до 5,2), субстанции норфлоксацина [73, 151] и глазных капель норфлоксацина (по соответствию максимумов и минимумов испытуемого раствора и раствора стандартного образца) [56, 75, 151], для идентификации офлоксацина в субстанции [151].
Была показана возможность применения УФ-спектрофотометрии при подтверждении подлинности субстанций норфлоксацина, пефлоксацина, ципрофлоксацина гидрохлорида, ципрофлоксацина, моксифлоксацина гидрохлорида, офлоксацина, левофлоксацинагемигидрата, ломефлоксацина гидрохлорида, спарфлоксацина, а также таблеток, содержащих норфлоксацин (нолицин) и ципрофлоксацина гидрохлорид (ципробай) [93, 165]. Для растворения субстанций и извлечения действующих веществ из таблеток использовали воду, 0,01М растворы хлористоводородной кислоты и натрия гидроксида, этиловый спирт 96%.
Согласно данным, представленным в Британской и Европейской фармакопеях, для количественного определения фторхинолонов в субстанциях и таблетированных лекарственных формах метод УФ-спектрофотометрии не используется. Однако Дорофеевым В.Л. и соавт. было показано, что метод можно применять для количественного определения спарфлоксацина и моксифлоксацина в таблетках. Для извлечения действующих веществ использовали 0,01М раствор кислоты хлористоводородной [19-23, 155].
Для количественного определения спарфлоксацина в таблетках также был предложен метод УФ-спектрофотометрии, действующее вещество извлекали из таблеток метанолом, растворы до нужной концентрации разбавляли дистиллированной водой [91].
Метод УФ-спектрофотометрии был предложен и для количественного определения гатифлоксацина в таблетках [97, 146, 175]. В качестве растворителей были использованы ОДМ фосфатный буфер (рН 7,4) и ОДМ раствор хлористоводородной кислоты.
Кроме того, метод УФ-спектрофотометрии применяется для количественного анализа фторхинолонов при проведении теста «Растворение» таблетированных лекарственных форм. Так, метод используется для оценки высвобождения действующих веществ из таблеток ципрофлоксацина, норфлоксацина [143-145, 151], налидиксовой кислоты [151]. Были проведены исследования по разработке методик теста «Растворение» для препаратов-дженериков, содержащих ципрофлоксацин [156] и офлоксацин [147, 157].
Для анализа фторхинолонов были также предложены методы ИК-спектроскопии [158, 159 и др.]. Согласно данным литературы, метод ИК-спектроскопии в анализе фторхинолонов применяется, в основном, в фармацевтической практике для подтверждения подлинности субстанций [151, 158, 159]. Имеются данные по определению подлинности таблеток фторхинолонов (нолицин, норилет, абактал, ципробай, ципролет, таривид, таваник и др.) с помощью ИК-спектроскопии [152, 176].
Методики определения технологических характеристик порошков и гранулятов
Исследования проводили при помощи методов ИК-, УФ-, ЯМР1! -спектроскопии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), газовой хроматографии (ГХ), поляриметрии, потенциометрии, титриметрических методов.
Для изучения спектральных характеристик субстанции использовано следующее оборудование: УФ-спектрофотометр Shimadzu UV-1700 (Япония), ИК-спектрометр Bruker Vertex 70 (Германия), ЯМР-спектрометр Bruker АС - 250 (Германия).
Хроматографический анализ методом ВЭЖХ проведен на жидкостных хроматографах: LC-10AT («Shimadzu», Япония), со спектрофотометрическим детектором UV-VIS SPD-10A и System Gold («Beckman Coulter», США) с градиентным насосом solvent module 127 и спектрофотометрическим детектором UV detector 166; программное обеспечение - «Мультихром 1.5». Для разделения исследуемых соединений использовали стальные колонки внутренним диаметром 4,6 мм и длиной 250 мм, сорбент С18 с размером частиц 5 мкм.
Анализ с помощью ГЖХ проводили на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором Chrom-5 («Лабораторные приборы», ЧССР); программное обеспечение - «Экохром» («ООО Прибор», Россия), стеклянная колонка, длиной 2,4 м, внутренним диаметром 3 мм, заполненная сорбентом 15% Carbowax 1500 на Chromaton W-AW-DMCS (0,200 - 0,250 мм).
Значения угла вращения определены на автоматическом поляриметре ADP 410 (Bellingham + Stanley, Великобритания). Определение температуры плавления проведено на приборах ПТП Клинского стекольного завода и Opti Melt МРА 100 (Stanford Research Systems, США).
Определение значений рН испытуемых растворов, а также потенциометрическое титрование, проведено на иономере ЭВ-74 (Гомель, СССР) и рН-метре Seven-easy S20 (Mettler Toledo, Швейцария).
Определение воды в субстанции по методу К. Фишера выполнено в ФГУ «Центр контроля качества лекарственных средств и медицинских измерений» Управления делами Президента Российской Федерации.
Разработку теста «Растворение» проводили на приборе Pharma Test DT 70 («Vitek», Германия), тип «лопастная мешалка».
Изучение фармакопейных показателей качества лекарственных форм препаратов и разработка методик анализа проведена в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи СССР XI издания вып. 1 и 2, Государственной фармакопеи РФ XII издания, часть 1, и в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00 [17].
При проведении анализа методом ВЭЖХ были использованы следующие химические вещества и растворители: вода бидистиллированная, и «для ВЭЖХ» (Lab-Scan), ацетонитрил (для ВЭЖХ, «сорт 0» (Криохром)), ортофосфорная кислота (хч), аммония ацетат 99,99+ (Aldrich), натрия перхлорат моногидрат 99+ (Acros Organics), метанол (для ВЭЖХ, Lab-Scan analytical sciences), калия гидрофосфат (99+ (Acros Organics) или чда), калия дигидрофосфат ( 99,0% (Sigma) или чда), меди сульфат пятиводный (чда), L-фенилаланин (USP 28, Xiamen fine).
Количественное определение субстанции левофлоксацина методом неводного титрования проведено с использованием следующих реактивов: кислота ледяная уксусная (хч), уксусный ангидрид (хч), кислота муравьиная (хч), кислота хлорная 65% (хч), кристаллический фиолетовый (чда). Изучение стабильность субстанции и лекарственной формы левофлоксацина при хранении и определение их сроков годности проведено в соответствии с требованиями документа «Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенной температуре» (И 42-8-82, Минздрав СССР, 1982 г)
Статистическая обработка проведена в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи XI издания, вып. 1. стр.199 [17].
Методики определения технологических характеристик порошков и гранулятов На выбор методов изготовления таблеток и подборе вспомогательных веществ в значительной степени влияют технологические свойства порошкообразных лекарственных субстанций, зависящие от физико-химических свойств этих субстанций [16, 24]. К таким свойствам относятся: сыпучесть, угол естественного откоса, насыпная плотность, форма и размер частиц, удельная поверхность, прессуемость и др. [12, 25, 40].
Нами использованы различные физико-химические методы исследования, результаты экспериментов обрабатывались статистически [13].
На практике оценка степени сыпучести порошков определяется по одному, реже двум критериям. Наиболее распространенными испытаниями являются определение сыпучести (скорости протекания порошка через отверстие) и определение насыпного объема [24, 111]. Сыпучесть определяется как время, в течение которого определенная масса вещества проходит (протекает) через отверстие определенного размера. Оборудование. В зависимости от сыпучести испытуемых материалов используют воронки различных конструкций: - без выходного ствола (типа «бункер»), с различными размерами внутреннего угла и диаметрами выходных отверстий; - с выходным стволом. Воронка поддерживается в вертикальном положении при помощи специального устройства. Вся конструкция должна быть защищена от вибраций. Методика. В сухую воронку с закрытым выходным отверстием помещают без уплотнения навеску испытуемого материала, взятую с точностью ±0,5 %. Количество испытуемого материала зависит от его насыпного объема и от используемого оборудования, но должно занимать не менее 80-90 % от объема воронки.
Открывают выходное отверстие воронки и определяют время, за которое через отверстие пройдет весь образец. Проводят не менее трех определений. Если при использовании воронки без выходного ствола, скорость высыпания 100 г порошка через насадку 1 менее 25 с, рекомендуется использовать воронку с выходным стволом.
Изучение спектральных характеристик левофлоксацина
Этанол относится к растворителям третьего класса токсичности. Согласно требованиям ОФС «Остаточные органические растворители» ГФ XII издания содержание такого растворителя в препаратах не должно превышать 0,5% (5000 ррм). Испытуемые растворы готовили следующим образом: Приготовление раствора внутреннего стандарта: около 0,5 г (точная навеска) н-бутанола (хч, для хроматографии) помещали в мерную колбу вместимостью 100,0 мл и доводили объем содержимого колбы водой очищенной до метки, перемешивали. 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили объем колбы водой очищенной до метки, перемешивали (концентрация около 0,05 мг/мл).
Испытуемый раствор: около 0,1 г (точная навеска) препарата помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяли в растворе внутреннего стандарта, доводили до метки тем же растворителем, тщательно перемешивали.
Приготовление калибровочных растворов н-бутанола и этанола: по 0,5 г (точные навески) н-бутанола (хч, для хроматографии) и этанола 95% помещали в мерную колбу вместимостью 100,0 мл и доводили объем колбы водой очищенной до метки, перемешивали. 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили объем колбы водой очищенной до метки, перемешивали (калибровочный раствор, концентрация каждого компонента около 0,05 мг/мл). Полученные растворы хроматографировали, получая не менее 5 хроматограмм испытуемого раствора и не менее 7 хроматограмм калибровочного раствора.
Поправочный коэффициент рассчитывали по результатам хроматографирования калибровочного раствора по приведенной выше формуле. Содержание этилового спирта в образцах субстанции рассчитывали следующей формуле: Сст- концентрация н-бутанола в растворе внутреннего стандарта, %; Спр- концентрация препарата в испытуемом растворе, %; Кх - поправочный коэффициент чувствительности детектора к этиловому спирту относительно внутреннего стандарта (н-бутанола); Sx - площадь пика этилового спирта; SCT- площадь пика н-бутанола. Для проверки пригодности хроматографический системы использовали следующе критерии: Количественное определение субстанции левофлоксацина методом неводного титрования было проведено в среде ледяной уксусной кислоты с потенциометрическим определением точки эквивалентности, титрант - 0,1М раствор кислоты хлорной.
В указанных условиях в конечной точке титрования наблюдался четкий скачок потенциала (около 120 мВ).
Кривые потенциометрического титрования трех навесок одной серии субстанции левофлоксацина представлены на рисунке 3.14. 1400
Около 0,2 г (точная навеска) субстанции левофлоксацина растворяли в 50 мл ледяной уксусной кислоты и титровали 0,1М раствором кислоты хлорной. Конечную точку титрования определяли потенциометрически. Параллельно проводили контрольный опыт. 1 мл 0,1М раствора кислоты хлорной соответствуют 0,03614 г левофлоксацина (C18H20FN3O4).
Содержание левофлоксацина в субстанции определяли в пересчете на сухое безводное вещество.
По указанной методике было определено количественное содержание субстанции левофлоксацина в образцах субстанции (табл. 3.11). Как видно из таблицы, количественное содержание составляло от 99,04 до 99,89% при относительной ошибке среднего результата, не превышающей 0,5%.
Для количественного определения субстанции левофлоксацина методом ВЭЖХ была использована модифицированная методика анализа посторонних примесей. Условия хроматографирования мы сохранили, за исключением режима элюирования. Поскольку все присутствующие в образцах субстанции примеси подвергаются элюированию в течение 15 мин, мы сократили время анализа за счет увеличения содержания раствора А в элюенте до 100 % уже с 15 минуты анализа (см. табл.3.12). На селективность методики анализа изменение режима элюирования не повлияло.
Как уже было показано, прямолинейная зависимость площадей примесей пиков левофлоксацина наблюдалась в пределах интервала от 0,0002 до 0,05 мг/мл. Коэффициент корреляции 0,999. В качестве рабочей была выбрана концентрация 0,02 мг/мл.
В качестве стандарта нами был использован стандартный образец левофлоксацина USP RS.
Испытуемые растворы и раствор стандарта готовили следующим образом: около 0,02 г (точная навеска) левофлоксацина помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 2 мл ацетонитрила и доводили объем раствора до метки смесью ацетонитрил - вода (1:10), перемешивали. 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили объем раствора до метки смесью ацетонитрил - вода (1:10), перемешивали. По 20 мкл испытуемого раствора и раствора стандарта хроматографировали, получая не менее 5 хроматограмм каждого раствора. Проверку пригодности хроматографической системы проводили так же, как и при определении посторонних примесей.
Влияние влажности гранулята и давления прессования на качество таблеток левофлоксацина, полученных методом влажной грануляции
Положение максимумов УФ-спектров извлечений из таблеточной массы и таблеток левофлоксацина совпадали с положением максимумов УФ-спектров раствора субстанции левофлоксацина. Наиболее выраженный максимум находился в пределах 294 ± 1 нм.
Извлечение из плацебо, приготовленное так же, как и извлечения из таблеточной массы и таблеток, в УФ-области спектра электромагнитное излучение практически не поглощало (рис. 4.1 а), следовательно, плацебо качественному и количественному анализу левофлоксацина в таблетках не мешает. УФ-спектры извлечений из всех серийных образцов таблеток в области длин волн от 260 до 350 нм имели один максимум при 294 і 2 нм (фактически 294 ± 1 нм).
При определении удельного вращения для извлечения левофлоксацина из таблеток использовали метанол, как и при анализе субстанции.
Для определения удельного вращения 10 таблеток измельчали до получения однородной массы. Около 0,640 г порошка таблеток переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли около 70 мл метанола и подвергали действию ультразвука в течение 10 мин, доводили содержимое мерной колбы до метки метанолом, перемешивали. Затем отбирали около 15 мл, фильтровали через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм.
Измеряли угол вращения полученного раствора при длине волны линии D спектра натрия (589,3 нм). Толщина слоя - 10 см. Угол вращения раствора левофлоксацина корректировали по углу вращения растворителя (метанола).
Удельное вращение таблеток левофлоксацина составило - 99. Извлечение из плацебо, приготовленное так же, как и извлечение из таблеточной массы, оптической активностью не обладало. Вспомогательные вещества не мешали определению угла вращения левофлоксацина в таблетках.
Удельное вращение всех образцов таблеток составляло от -90 до -111 ()мл/(дм х г).
Идентификацию левофлоксацина методом ВЭЖХ мы проводили в условиях определения посторонних примесей по соответствию времени удерживания пика левофлоксацина на хроматограмме испытуемого раствора времени удерживания пика левофлоксацина на хроматограмме раствора стандарта.
Приготовление испытуемого раствора: 1 мл испытуемого раствора, приготовленного для определения посторонних примесей (концентрация левофлоксацина 0,4 мг/мл) помещали в мерную колбу вместимостью 20 мл и доводили объем раствора в колбе до метки смесью ацетонитрил - вода (1:10), тщательно перемешивали (концентрация левофлоксацина 0,02 мг/мл).
Приготовление раствора сравнения: 1 мл раствора А СО левофлоксацина (концентрация левофлоксацина 0,4 мг/мл) помещали в мерную колбу вместимостью 20 мл и доводили объем раствора в колбе до метки смесью ацетонитрил - вода (1:10), тщательно перемешивали (концентрация левофлоксацина 0,02 мг/мл).
Испытуемый раствор и раствор сравнения хроматографировали в условиях определения посторонних примесей, получая по 5 хроматограмм каждого раствора. Средняя масса и отклонения от средней массы всех образцов таблеток составляли от 0,613 г до 0,678 г (0,645 г ± 5%). Отклонения от средней массы соответствовали требованиям Государственной фармакопеи. Определение распадаемости проводили на лабораторном идентификаторе процесса распадаемости согласно требованиям ГФ СССР XI издания, том 2. Время рападаемости всех образцов таблеток не превышало 30 мин и фактически составляло не более 20 мин.
Определение посторонних примесей в таблетках левофлоксацина было проведено методом ВЭЖХ в условиях, выбранных для субстанции левофлоксацина (см. главу 3, п. 3.2.1). Для извлечения левофлоксацина и примесей из таблеток использовали смесь ацетонитрил - вода (1:10), рабочая концентрация левофлоксацина в растворе - 0,4 мг/мл, аналитическая длина волны - 280 нм. Ранее нами было показано, что в выбранных хроматографических условиях наблюдается разделение левофлоксацина и его основных технологических, а также некоторых неидентифицированных примесей (см. главу 3, п.3.2.1). Были определены диапазоны линейности и пределы обнаружения идентифицированных примесей и левофлоксацина.
Также нами показано, что в выбранных условиях плацебо не мешает определению левофлоксацина, поскольку его компоненты практически не поглощают УФ-излучение при 280 нм (рис.4.2).
Нами была проведена оценка правильности и прецизионности методики на модельных смесях свидетелей технологических примесей, плацебо и субстанции левофлоксацина. Поскольку единственной технологической примесью, обнаруженной в субстанции, является примесь А, модельные смеси были приготовлены только с этой примесью. Концентрация левофлоксацина в модельных смесях составляла около 0,4 мг/мл, примеси А - 0,004 и 0,002 мг/мл, плацебо прибавляли в количестве, эквивалентном содержанию в таблетке.
С помощью разработанной методики нами было определено содержание посторонних примесей в серийных образцах таблеток левофлоксацина.
Приготовление испытуемого раствора проводили следующим образом: около 0,026 г (точная навеска) растертых таблеток левофлоксацина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют около 30 мл смеси ацетонитрил - вода (1:10), помещают на ультразвуковую баню на 10 мин, доводят до метки тем же растворителем, перемешивают, фильтруют через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм (концентрация левофлоксацина около 0,4 мг/мл).
Приготовление раствора сравнения: около 0,01 г стандартного образца (СО) левофлоксацина (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 2 мл ацетонитрила, доводят объем раствора до метки смесью ацетонитрил - вода (1:10), перемешивают (раствор А СО). 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки смесью ацетонитрил - вода (1:10), перемешивают (раствор Б СО).