Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние проблемы орфанных заболеваний нервной системы (обзор литературы) 18
1.1. Орфанные заболевания 18
1.2. Орфанные заболевания нервной системы 19
1.2.1. Орфанные заболевания нервной системы с поражением структур головного мозга 19
1.2.2. Орфанные заболевания нервной системы с поражением нервно-мышечной системы 20
1.2.2.1.Спинальные мышечные атрофии 21
1.2.2.2.Мышечная дистрофия Дюшенна 22
1.2.2.3.Наследственные моторные и сенсорные невропатии 24
1.3. Лечение орфанных болезней нервной системы 25
1.3.1. Основные научные направления в лечении мышечной дистрофии Дюшенна 26
1.3.2. Основные научные направления в лечении спинальной мышечной атрофии 28
1.3.3. Разработки генной и клеточной терапии для лечения орфанных нервно-мышечных болезней 31
1.4. Изучение факторов, поддерживающих развитие нейродегенерации при орфанных болезнях нервно-мышечной системы 35
1.5. Эндогенные антиапоптотические механизмы 40
1.5.1. Реиннервация - компенсаторно-приспособительный механизм 43
1.5.2. Электронейромиография и денервационно-реиннервационный процесс 46
1.6. Общая характеристика нейротрофинов 47
1.6.1. Клинические аспекты изучения нейротрофинов 51
1.6.2. Терапевтическое применение нейротрофинов 53
Глава 2. Общая характеристика собственных наблюдений и методов исследования 59
2.1. Характеристика обследованных больных 59
2.2. Методы исследования 63
2.2.1. Клинико-неврологическое исследование 63
2.2.2. Молекулярно-генетическое исследование 64
2.2.3. Нейрофизиологическое исследование 65
2.2.4. Лабораторное исследование 66
2.2.5. Экспериментальное исследование 66
2.2.6. Статистическая обработка данных 79
Глава 3. Результаты собственных исследований 80
3.1. Клинико-неврологическая характеристика больных 80
3.1.1. Клинико-неврологическая и лабораторная характеристика больных первой группы 81
3.1.2. Клинико-неврологическая и лабораторная характеристика больных второй группы 90
3.1.3. Клинико-неврологическая и лабораторная характеристика больных третьей группы 103
3.1.3.1.Данные молекулярно-генетического исследования больных третьей группы 114
3.1.4. Клинико-неврологическая и лабораторная характеристика больных группы сравнения 116
3.2. Сопоставление результатов комплексного обследования больных исследуемых групп 123
3.2.1. Сравнительный анализ клинико-неврологического исследования 123
3.2.2. Сопоставление результатов лабораторного исследования нейротрофинов и белков регулирующих апоптоз в исследуемых группах 126
Глава 4. Результаты нейрофизиологического исследования больных 139
4.1. Результаты электроэнцефалографического исследования у больных первой группы 139
4.2. Электрофизиологическое исследование пациентов второй группы 142
4.3. Электрофизиологическое исследование пациентов с мышечными дистрофиями Дюшенна и первичными миопатиями 155
Глава 5. Результаты экспериментального исследования 158
5.1. Результаты изучения влияния плазмы крови больных в органотипической культуре ткани 158
5.2. Сопоставление экспериментальных и лабораторных данных больных исследуемых групп 163
5.3. Оценка влияния реагентов (фактора роста нерва и протеинкиназы С) на рост нейритов в органотипической культуре ткани 169
Глава 6. Основные направления дифференцированной патогенетической терапии орфанных наследственных нервно-мышечных болезней 173
Заключение 189
Выводы 207
Практические рекомендации 210
Список сокращений и условных обозначений 212
Список терминов 214
Список литературы 215
Приложение 240
- Разработки генной и клеточной терапии для лечения орфанных нервно-мышечных болезней
- Клинико-неврологическая и лабораторная характеристика больных первой группы
- Сопоставление результатов лабораторного исследования нейротрофинов и белков регулирующих апоптоз в исследуемых группах
- Оценка влияния реагентов (фактора роста нерва и протеинкиназы С) на рост нейритов в органотипической культуре ткани
Введение к работе
Актуальность проблемы. По данным Всемирной организации
здравоохранения, общее количество больных с наследственной патологией
составляет 2,5-4% от всего населения планеты. Среди них особое место
занимают заболевания нервной системы, отличающиеся по типам мутаций, с
выраженной генетической детерминацией, приводящей к быстрой
инвалидизации и летальности больных. Большая часть из них относится к так
называемым редким болезням с частотой встречаемости от 0,003 до 10 больных
на 100 000 населения (Баранов А.А. и соавт., 2010). В 2012 году было принято
Постановление Правительства Российской Федерации № 403, в котором
определен перечень редких (орфанных) наследственных заболеваний. К
наиболее распространенным формам орфанных болезней нервной системы
относятся наследственные лейкодистрофии, прогрессирующие амиотрофии
(спинальная мышечная атрофия и наследственная моторная и сенсорная
невропатия) и прогрессирующие миодистрофии (мышечная дистрофия
Дюшенна, Беккерра, врожденные миопатии) (Гусев Е.И. и соавт., 2009; Бочкова
Н.П. и соавт., 2012; Гузева В.И. и соавт., 2016). Эффективных методов лечения
орфанных наследственных заболеваний нервной системы нет. Исследования
последних лет позволяют говорить о возможности замедления
прогрессирования мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) с применением методики пропуска экзонов (Bushby K. et al., 2014), супрессии мутантных стоп-кодонов (Bushby K. et al., 2014) или замещения дистрофина атрофином (Janghra N. et al., 2016). Предложенные препараты, к сожалению, не имеют официальной регистрации и разработаны только для больных с МДД, имеющих мутации в 52 экзоне Х-хромосомы (Kim M.J. et al., 2016), или при нонсенс-мутации, встречающейся чрезвычайно редко (Milic R.V. et al., 2015; Huard J. et al., 2016).
Подобная ситуация наблюдается и с лекарственными препаратами,
разрабатываемыми для лечения спинальной мышечной атрофии (СМА)
(Aartsma-Rus A. et al., 2017; Scoto M. et al., 2017). Одни препараты не
показывают клинических улучшений у больных (комбинация левокарнитина и
вальпроевой кислоты) (Brichta L. et al., 2003; Kissel J.T. et al., 2011; 2013),
другие являются токсичными: ингибитор деацетилаз гистонов (Riessland M. et
al., 2006; Butchbach M.E.R. et al., 2010), фенилбутират (Andreassi C. et al., 2004),
салбутамол (Tiziano F.D. et al., 2010) и не разрешены к применению. По мнению
многих ученых, перспективным направлением является использование «малых
молекул», корректирующих сплайсинг пре-мРНК гена SMN2 (HuaY. et al.,
2010). Однако препарат RG7800 в высоких дозах при долгосрочном
применении больными приводит к атрофии сетчатки глаза (Liang W. et al.,
2016), а препарат Нусинерсен должен вводиться непосредственно в ликворную
систему спинного мозга у больных со СМА с периода новорожденности и на
протяжении всей жизни 3 раза в год (Hach M. et al., 2016; Finkel, R.S. et al.,
2017; Bishop K.M. et al., 2018). В настоящее время не представлено
ретроспективных данных, подтверждающих клинический эффект Нусинерсена.
Лечение наследственных лейкодистрофий и моторных и сенсорных невропатий носит симптоматический характер с использованием препаратов, направленных на улучшение миелинизации (Петрухин А.С., 2012; Гузева В.И. и соавт., 2016).
Степень разработанности темы исследования. Новые подходы к
лечению орфанных наследственных нервно-мышечных болезней (ОННМБ) как
фундаментальные, так и клинические в настоящее время представлены генной
и клеточной терапией. Но ряд нерешенных этических вопросов и большое
количество осложнений, возможных при данных видах терапии, не позволяют
рассчитывать на активное внедрение этих методов в клиническую практику
(Olivn S. et al., 2015; Ramos J. et al., 2016). Общей чертой орфанных нервно-
мышечных заболеваний является механизм гибели клетки (нейрона или
миоцита) путем апоптоза и запуск внутриклеточных и внутриорганных
молекулярных патологических каскадов, поддерживающих развитие
нейродегенерации: оксидативный стресс, нейрональное воспаление,
метаболические расстройства в нейроне, активация микроглии и т.д.
Таким образом, актуальным направлением может быть изучение факторов, способствующих прогрессированию нейродегенерации, и поиск препаратов, стабилизирующих патологические молекулярные каскады. Действие может быть направлено как на снижение активности процесса апоптоза, так и на стимуляцию нейротрофической функции нервной ткани больного. Данные механизмы в большей степени изучены при болезни Альцгеймера (Sopova K. et al., 2013; Shin M.K. et al., 2014; Florencia I.M. et al., 2017), болезни Паркинсона (Коновалова Е.В. и соавт., 2015; Литвиненко И.В. и соавт., 2017; Angelucci F. et al., 2015) и при боковом амиотрофическом склерозе (He Y.Y. et al., 2013). У детей с наследственными заболеваниями нервной системы изучение тонких физиологических механизмов, поддерживающих процесс нейродегенерации, носит единичный и несистематичный характер. Так установлено, что препарат Олесоксим снижает выход цитохрома С, уменьшает активность каспаз 3 и 8 (Bordet T. et al., 2010), но в тоже время снижается контроль за неопластическим ростом клеток, что не позволяет применять его у детей. Апоптотические и антиапоптотические белки наиболее изучены при онкологических заболеваниях (Callagy G. et al., 2006; Bedner E.X. et al., 2008; D'Orsi B. et al., 2015; Frenzel А. et al., 2015). Эти знания могут быть использованы и при выборе методов лечения нейродегенеративных заболеваний.
Исследование физиологических механизмов нейротрофической
регуляции и антиапоптотической защиты у пациентов с редкими наследственными заболеваниями нервной системы может расширить возможности патогенетической терапии, создавая оптимальные условия для восстановления нервной ткани, способствуя замедлению прогрессирования заболевания и, как следствие, повышению качества жизни больного. В настоящее время нейротрофическая гипотеза развития наследственных нервно-мышечных заболеваний у детей не сформулирована. В то же время доказано
участие нейротрофических факторов (НТФ) в регуляции нейропластичности и нейрогенеза (Cai J. et al., 2014). Эти адаптационные механизмы запускаются как в физиологических, так и в патологических состояниях для противостояния прогрессирующей гибели популяции нейронов (Antonelli С. et al., 2002; Franciaetal М. et al., 2004). Все вышеизложенное определяет необходимость поиска новых подходов к патогенетической терапии ОННМБ с позиции изучения тонких физиологических механизмов нейрогенеза и процесса нейродегенерации.
Цель исследования: изучить возможность патогенетической терапии орфанных наследственных нервно-мышечных болезней на основе клинико-экспериментального исследования роли нейротрофических механизмов в процессе прогрессирующей дегенерации нервной системы.
Задачи:
-
Провести клинико-неврологическое, лабораторное и нейрофизиологическое обследование больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями для уточнения патогенеза прогрессирующего нейродегенеративного процесса.
-
Определить качественный состав и концентрацию белков семейства нейротрофинов: цилиарного нейротрофического фактора, фактора роста головного мозга, фактора роста нерва плазмы крови у здоровых людей и у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными болезнями.
3. Исследовать содержание белков, регулирующих апоптоз (белок р53,
каспаза 8, цитохром С) и участвующих в антиапототической защите (белок
Bcl2), в плазме крови здоровых людей и больных орфанными наследственными
нервно-мышечными заболеваниями.
-
Провести сопоставления клинико-лабораторных данных концентрации белков семейства нейротрофинов (цилиарного нейротрофического фактора, фактора роста нерва, фактора роста головного мозга), белков, регулирующих апоптоз (белок р53, каспаза 8, цитохром С) и участвующих в антиапототической защите (белок Bcl2), у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями в зависимости от топического уровня поражения нервной системы.
-
Разработать тест-систему по изучению влияния плазмы крови человека в норме и при наличии установленного диагноза на рост нейритов спинальных ганглиев in vitro.
-
Оценить степень компенсаторной реиннервации у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными болезнями, исследуя влияние плазмы крови пациентов на рост нейритов в органотипической культуре ткани.
-
Изучить роль протеинкиназы С, эндотелиальной NO-синтазы, гамма-аминомасляной кислоты и натрий калиевой аденозинтрифосфатазы (Na+/K+-АТФаза) в денервационно-реиннервационном процессе у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями в
экспериментальном исследовании с использованием органотипической культуры ткани.
8. На основании полученных данных обосновать патогенетическую стратегию и тактику патогенетического лечения орфанных наследственных нервно-мышечных болезней.
Научная новизна. Выявлено, что больные с орфанными
наследственными нервно-мышечными заболеваниями имеют особенности нейротрофической регуляции. Впервые зарегистрировано повышенное содержание нейротрофинов - фактора роста головного мозга и фактора роста нерва - в плазме крови у больных с прогрессирующими амиотрофиями и снижение фактора роста головного мозга у больных с прогрессирующими миодистрофиями. Комплексный анализ данных показал, что в плазме крови больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями концентрация фактора роста головного мозга и фактора роста нерва выше у больных детского возраста. Это может быть объяснено гипотезой нейротрофического нервно-мышечного взаимодействия в процессе онтогенеза, которая была сформулирована в процессе научного исследования.
Разработана методологическая система изучения тонких
физиологических механизмов денервационного и реиннервационного
процессов у больных с орфанными нервно-мышечными заболеваниями с
использованием экспериментального метода органотипического
культивирования в сочетании с лазерной сканирующей микроскопией,
позволяющая оценить активность компенсаторной реиннервации при изучении
влияния плазмы крови больных на рост нейритов спиномозговых ганглиев
10-12-дневных куриных эмбрионов. Впервые установлено, что плазма крови
больных прогрессирующими амиотрофиями оказывает дозозависимое нейрит-
ингибирующее действие на спинальные ганглии через активацию
высокоаффинных тирозинкиназных рецепторов в связи с повышенным
содержанием фактора роста нерва в плазме крови. Впервые определено, что
одним из факторов, препятствующих компенсаторной реиннервации, является
повышенное содержание нейротрофина (фактора роста нерва) в плазме крови.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Разработана
методологическая система изучения тонких физиологических механизмов
нейропластичности у больных с орфанными нервно-мышечными
заболеваниями с использованием экспериментального метода
органотипического культивирования в сочетании с лазерной сканирующей микроскопией, позволяющая оценить активность процесса компенсаторной реиннервации и проводить тестирование фармакологических препаратов для осуществления подбора адресной медикаментозной терапии в условиях in vitro.
Выявлено участие эндотелиальной NO-синтазы, протеинкиназы С, гамма-
аминомасленной кислоты и сигнальной функции Na+/K+-АТФазы в механизмах,
противодействующих нейротоксическому эффекту (ингибирующему рост
нейритов) плазмы крови, которое уточняет патогенез орфанных
наследственных нервно-мышечных болезней и может расширить
терапевтические возможности за счет применения больными с орфанными
наследственными нервно-мышечными заболеваниями лекарственных
препаратов, ранее не использовавшихся в терапии этих болезней.
Установлено, что в модельных опытах in vitro коменовая кислота, РГПУ-260 (композиция мефебута и L-аргинина) и гамма-аминомасленная кислота нивелируют токсическое действие плазмы крови больных с прогрессирующими амиотрофиями в терапевтических дозах.
Сформулирован новый оригинальный подход к лечению орфанных
наследственных нервно-мышечных болезней, который заключается в
использовании поэтапно разработанного комплекса мероприятий: клинико-
неврологический анализ, молекулярно-генетический анализ,
иммуноферментный анализ, электронейромиография, опыты с использованием
тест-системы на основе органотипической культуры спинальных ганглиев и
фармакологический анализ, оценка когнитивных функций, разработка
персонифицированной схемы приема препарата, повторная
электронейромиография. Предлагаемый подход позволяет персонифицировать
лечение, повысить качество жизни пациента, сократить время от установления
диагноза до начала лечения, поскольку доза препарата, действующая на
пациента, подбирается в условиях in vitro. Предлагаемый подход позволяет
выявить компенсаторные механизмы, запускаемые своевременным лечением, и
дает возможность стабилизировать картину заболевания.
Определен алгоритм ведения пациентов с орфанными наследственными
нервно-мышечными заболеваниями с учетом возрастных особенностей
нейротрофической регуляции у больных и в зависимости от первичного
поражения нервной или мышечной систем. Определено, что стимуляция
приспособительных механизмов, направленных на усиление компенсаторной
реиннервации, запускаемых своевременным, дифференцированным лечением,
позволяет стабилизировать картину заболевания, а также снизить
экономические затраты на лечение каждого больного, поскольку сокращает время подбора корректной фармакотерапии, индивидуальной для каждого пациента.
Методология и методы диссертационного исследования. Методология
исследования основана на системном структурно-функциональном и
экспериментальном подходе, целью которого явилось изучение механизмов,
направленных на активизацию компенсаторно-приспособительных процессов в
нервно-мышечной системе у больных с орфанными наследственными нервно-
мышечными заболеваниями. На первом этапе был выполнен анализ данных
литературы, посвященной теме исследования. На втором этапе производился
отбор больных с учетом критериев включения в исследование. На третьем
этапе выполнялось клинико-неврологическое, молекулярно-генетическое и
нейрофизиологическое исследования пациентов с орфанными
наследственными нервно-мышечными болезнями. На четвертом этапе проводилось исследование нейротрофической регуляции (фактора роста
головного мозга, фактора роста нерва, цилиарного нейротрофического фактора)
и активности белков, участвующих в регуляции процесса апоптоза (белок р53,
белок Bcl2, каспаза 8, цитохром С) лабораторным методом с помощью
иммуноферментного анализа крови больных с последующим анализом данных
с учетом топического поражения нервной системы. На пятом этапе
осуществлялась разработка методики изучения компенсаторной реиннервации
с использованием органотипической культуры ткани. Шестой этап включал в
себя изучение влияния плазмы крови больных с орфанными наследственными
нервно-мышечными болезнями в тест-системе для оценки компенсаторной
реиннервации. На седьмом этапе проводилось изучение механизмов,
препятствующих компенсаторной реиннервации в тест-системе, основанной на
использовании органотипической культуры ткани с применением
фармакологического анализа и лазерной сканирующей микроскопии. На восьмом этапе полученные результаты были проанализированы, определены закономерности процесса дегенерации нервно-мышечной системы у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями. Анализ позволил сформулировать стратегию и тактику патогенетического лечения.
Объект исследования – больные орфанными наследственными заболеваниями нервной системы и эксплантаты спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов.
Предмет исследования - клинические, молекулярно-генетические, инструментальные, лабораторные и экспериментальные данные.
Исследование полностью соответствует принципам доказательной
медицины, осуществлено с применением современных критериев
распределения больных, а также современных клинико-диагностических методов исследования и анализа полученных данных.
Положения, выносимые на защиту.
-
Состояние нейротрофической регуляции у больных с орфанными нервно-мышечными заболеваниями имеет различия, связанные как с первичным патологическим объектом (нейрон или миоцит), так и с онтогенетическими особенностями роста и развития организма.
-
Тест-система с использованием органотипической культуры ткани позволяет индивидуализировать подход к лечению пациентов и оценить степень компенсаторной реиннервации у больных с орфанными нервно-мышечными заболеваниями в процессе изучения роста нейритов спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов в присутствии плазмы крови пациентов.
-
Компенсаторная реиннервация у больных прогрессирующими амиотрофиями снижена вследствие высоких концентраций нейротрофинов (фактора роста головного мозга, фактора роста нерва), оказывающих дозозависимое ингибирующее действие на рост нейритов спинальных ганглиев в условиях органотипического культивирования.
-
В механизм, препятствующий развитию компенсаторной реиннервации, у больных с наследственными прогрессирующими
амиотрофиями вовлечены молекулярные процессы, связанные с
функциональной активностью эндотелиальной NO-синтазы; протеинкиназы С; Na+/K+-АТФазы и ГАМК-эргической системы.
-
Снижение концентрации нейротрофина – фактора роста головного мозга у больных прогрессирующими миодистрофиями - является предиктором развития когнитивных расстройств, которое подтверждается ослабленным действием плазмы крови на рост нейритов в органотипической культуре ткани.
-
Совокупность клинических и экспериментальных данных определяет необходимость комплексного дифференцированного подхода к фармакокоррекции механизма апоптоза клетки у больных с орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями, включающего в себя молекулярно-генетическое исследование, иммуноферментный анализ и тест-систему, разработанную на основе органотипической культуры ткани.
Степень достоверности и апробация результатов. Результаты,
полученные в процессе диссертaциoннoго исследoвaния, являются
достoверными и обосновaнными вследствие использования репрезентaтивных выбoрок с сoвременными мaтематическими и стaтистическими метoдами oбрaбoтки дaнных.
Материалы исследований доложены и обсуждены на научных
мероприятиях всероссийского, регионального и международного уровня: на
Конгрессе неврологов России с международным участием «Спинной мозг»
(Санкт-Петербург, Россия, 2013); IX, X, XI, XII Всероссийских научно-
практических конференциях с международным участием «Здоровье - основа
человеческого потенциала: проблемы и пути их решения» (Санкт-Петербург,
Россия, 2014, 2015, 2016, 2017); XIII, XIV Всероссийских научно-практических
конференциях с международным участием «Поленовские чтения» (Санкт-
Петербург, Россия, 2014, 2015, 2016); VII, VIII Международных научно-
практических конференция «Высокие технологии, фундаментальные и
прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург,
Россия, 2014, 2015); VIII Московском международном конгрессе
«Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2015);
Международной научной конференции «Механизмы функционирования
нервной, эндокринной и висцеральных систем в процессе онтогенеза» (Майкоп,
Россия, 2015); III Российском конгрессе с международным участием
«Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное»
(Санкт-Петербург, Россия, 2015); научно-практической конференции общества
специалистов по нервно-мышечным болезням «Новые технологии в
диагностике и лечении болезней нервно-мышечной системы» (Москва, Россия, 2015); Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 90-летию со дня основания Института физиологии им. И. П. Павлова РАН «Современные проблемы физиологии высшей нервной деятельности, сенсорных и висцеральных систем» (Санкт-Петербург, Россия, 2015); 20-й Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы неврологии», посвящённой смежным вопросам
неврологии и клинической фармакологии (г. Томск, 2016); 11-й
Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и
психологии» (Судак, Крым, Россия, 2015); XII Международном
междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии»
(Судак, Крым, Россия, 2016); Всероссийской научно-практической
конференции с международным участием «Ежегодные Давиденковские чтения»
(Санкт-Петербург, Россия, 2013, 2014, 2015, 2016); II Всероссийской
конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные
проблемы нейронаук: функциональная асимметрия, нейропластичность и
нейродегенерация» (Москва, Россия, 2016); I Международном неврологическом
конгрессе (EAN) (Берлин, Германия, 2015); II Международном
неврологическом конгрессе (EAN) (Копенгаген, Дания, 2016); Международном
конгрессе по миологии (MCO Congrе Myology) (Лион, Франция, 2016); на
Международном IX симпозиуме по нейропротекции и нейрорепарации (9th
International Symposiumon Neuroprotection and Neurorepair) (Лейпциг, Германия,
2016); Второй Международной (русскоязычной) неврологической Школе в
Судаке «Инновации в клинической неврологии» (Судак, Крым, Россия, 2016);
Санкт-Петербургском научном форуме, посвященном 100-летию
Физиологического общества им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, Россия,
2017); III Международном неврологическом конгрессе (EAN) (Амстердам,
Нидерланды, 2017); III конгрессе по регенеративной медицине (Москва,
Россия, 2017); Международной научной конференции «Клиническая протеомика. Постгеномная медицина» (Москва, Россия, 2017); Международной 5-й конференции по редким болезням (Париж, Франция, 2017).
Публикации. По материалам исследования опубликовано 86 научных
работ, в том числе 20 статей в научных изданиях, рекомендованных Высшей
аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ для
опубликования результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора
медицинских наук. Диссертационное исследование выполнялось в рамках 2
плановых научно-исследовательских работ: № VMA.03.12.02.1618/009
(ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова»
Министерства обороны Российской Федерации) и «Разработка и
усовершенствование подходов к диагностике и лечению орфанных болезней нервной системы (гепато-лентикулярной дегенерации, миастении и других нервно-мышечных заболеваний)» (ФГБОУ ВО СЗГМУ имени И.И. Мечникова Министерства здравоохранения Российской Федерации).
Внедрение результатов исследования. Основные положения
диссертации используются в лечебной работе ГАУЗ «Хоспис (детский)» Санкт-Петербурга, в научно-исследовательской и педагогической работе кафедры неврологии имени академика С.Н. Давиденкова ФГБОУ ВО СЗГМУ имени И.И. Мечникова Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Личный вклад автора. Автор самостоятельно разработала план и программу работы, сформулировала цель и задачи, критерии отбора больных в проведенном исследовании. Лично производила клинико-неврологическое,
нейрофизиологическое, нейропсихологическое обследование всех больных,
участвовала в выполнении части экспериментальной работы, проводила
оценку лабораторных и экспериментальных данных с последующей статистической обработкой и анализом полученных результатов. Личный вклад автора в проведенное исследование составляет более 90%. Автором написан текст диссертации и автореферата, подготовлены слайды для апробации и защиты.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 240 страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего в себя 52 отечественных и 169 иностранных источников, одно приложение. Работа содержит 29 таблиц и 96 рисунков.
Разработки генной и клеточной терапии для лечения орфанных нервно-мышечных болезней
Создание генно-инженерных конструкций было начато в 80-х годах, когда была создана ретровирусная система переноса генов в клетки. За последние 10 лет генная терапия шагнула от создания концепции до экспериментальных и клинических исследований, в том числе и при МДД [Баранов А.Н. и др., 2007; Ramos J. et al., 2015]. Тем не менее, убедительной клинической эффективности пока не продемонстрировано. Лидером среди стран, ведущих клинические исследования в области генной терапии, являются США, но исследования, в основном, посвящены злокачественным заболеваниям. Так, наряду с этим в настоящее время число зарегистрированных клинических исследований в области онкологии составляет 871, а наследственным нервным моногенным болезням посвящено 15 работ. Это связано с дороговизной приготовления молекулярно-генетических конструкций и трудностью доставки их в клетки-мишени; проведение генной терапии имеет ряд сложностей, которые невозможно предугадать. Под действием вектора будет происходить функциональная перестройка всего органа, а не только отдельных клеток, это может привести к нарушению взаимодействия различных клеточных популяций, участвующих в работе этой системы [Kulbatski I. et al., 2009; Wang Y. et al., 2012]. Поэтому следует учитывать все патофизиологические характеристики наследственного нервно-мышечного заболевания. При лечении наследственных болезней существуют риски, которые нельзя сбрасывать со счетов, возможно развитие патологического иммунного ответа на введенный ген с аденовирусным вектором и инсерционный мутагенез, приводящий к развитию злокачественных новообразований [Olivn S. et al., 2016]. Также следует отметить, что достигнуты реальные успехи в генной терапии единичных моногенных заболеваний, среди которых нет ОННМБ.
Клеточная терапия – это способ лечения и профилактики болезней путем трансплантации клеток. Существуют три основные группы клеточных технологий, которые активно изучаются в контексте регенеративной медицины: клетки, выделенные из организма и не подвергавшиеся никаким культуральным процедурам, дифференцированные в культуре клетки и стволовые клетки. Каждая группа состоит из клеток разного происхождения. Несомненно, для эффективного и безопасного для пациента применения клеточной терапии необходимо научиться размножать гомогенную популяцию нейрональных или глиальных стволовых клеток, а также изучить механизмы интеграции стволовых клеток в пораженные участки нервной системы. Эффективность генной и клеточной терапии в настоящее время не очень высока (5–8% от исходного уровня), и терапевтический эффект сохраняется лишь первые 6–12 месяцев, поэтому данные виды лечения можно рассматривать пока только как дополнительные.
Интересное и перспективное направление – использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Суть этой методики состоит в том, что соматические клетки пациента (фибробласты с поверхности кожи) подвергаются действию определенных генов (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, Klf4, c-Myc) и в ответ на это клетки дедифференцируются до эмбрионального состояния и затем могут превращаться в нейроны, хондроциты или остеобласты. Уникальность этой методики в том, что полученные клетки несут в себе генотип данного пациента и в случае с СМА или МДД можно получить -мотонейроны или миоциты, которые в дальнейшем можно изучать в контексте подбора терапии на индивидуальном уровне. Проводятся исследования СМА с использованием стволовых клеток на животных моделях: «изучаются» крысы с поврежденным нижним отделом спинного мозга инфекционно-вирусными агентами. Хотя эти крысы являются неполной моделью СМA, данные опыты позволяют продемонстрировать, что в поврежденном спинном мозге возможно частичное восстановление нейронной связи с миоцитами [Musgrave T. et al., 2011]. К сожалению, при проведении исследования необходимо использовать разнообразные сильнодействующие препараты, которые не могут использоваться у людей.
Кроме того были предприняты попытки выращивания моторных нейронов из зародышевых стволовых клеток SMN-поврежденных мышей для изучения функции аксонов. В результате эксперимента было выявлено, что моторные нейроны развивались в питательной среде хорошо, но аксональный рост у исследуемых -мотонейронов был незначительным по сравнению с контрольной группой.
При попытке приблизить -мотонейроны друг к другу было зафиксировано образование дендро-аксональных синапсов, но через двое суток все установленные связи были утрачены. Неудачи в серии экспериментов ученые объясняют отсутствием клеточного сопровождения, которое играет большую роль в физиологическом функционировании мотонейронов со стороны олигодендроглиальных клеток. Проводится изучение моторных нейронов человека из зародышевых стволовых клеток, полученных при процедуре оплодотворения in vitro. Эти эксперименты направленны на создание концентрированной массы -мотонейронов (приблизительно 95%) из стволовых клеток человека [Wyatt T.J. et al., 2011]. Считается, что появление такой жизнеспособной массы -мотонейронов будет способствовать более быстрому продвижению исследований данной патологии.
В 2010 году было продемонстрировано что, выращенная популяция моторных нейронов могла функционировать и устанавливать контакты с клетками-мишенями [Keirstead С., 2010]. Возможно, в будущем производство клеточной популяции мотонейронов может быть использовано в терапевтических целях для лечения СМА путем замены мотонейронов у больных. Но, по-нашему мнению, остаются нерешенными многие вопросы и противоречия на пути трансплантации здоровых -мотонейронов больным со СМА: во-первых, это отторжение чужеродных клеток и тканей, во-вторых, насколько хорошо будут функционировать здоровых -мотонейронов в среде нервной ткани, которая находится в состоянии постоянного усиленного апоптотического процесса.
Первые результаты пересадки миобластов от здоровых доноров больным с МДД были обнародованы в 1990 году. Пересадка нормальных миобластов обеспечивает мышечные волокна больного миодистрофином и тем самым уменьшается активность некроза и атрофии в дистрофичных мышцах. Считается, что трансплантация миобластов способствует внедрению нормальных ядер клеток в мышечные волокна больного и это способствует «заместительному» функционированию. Экспрессия нормального гена в пересаженных мышечных ядрах противодействует геному мышечных ядер больного, содержащих дефектный ген. Но до настоящего времени трансплантация миобластов имеет исключительно научное значение.
Установлено, что в мышцах больного после трансплантации обнаруживается белок-дистрофин, но улучшения функции мышцы не наблюдалось [Raiput B.S. et al., 2015]. Возможно, что это связано с рядом нерешенных вопросов: гистосовместимость, низкая выживаемость миобластов при пересадке, активность фибробластов, дисперсия и т. д.
Важно отметить, что в настоящее время в мире проводится большое количество исследований, направленных на поиск специфической терапии с использованием клеточных технологий, фармакологических препаратов и биотрансплантологии для лечения ОННМБ, однако все исследования находятся или в стадии доклинических исследований, или в стадии экспериментальных испытаний. Поэтому можно с уверенностью сказать, что эффективная патогенетическая медикаментозная терапия орфанных наследственных болезней нервной системы в настоящее время отсутствует.
Также многие ученые отмечают, что клеточная и генная терапия должна быть составной частью комплексного лечения нейродегенеративных заболеваний. Это делает актуальным разработку новых подходов симптоматической терапии, которая может быть использована для предотвращения каскада патологических реакций, повреждающих нейроны вторично, т. е. осуществлять борьбу с факторами, способствующими дальнейшему прогрессированию нейродегенеративного заболевания.
Клинико-неврологическая и лабораторная характеристика больных первой группы
При неврологическом осмотре у детей 1-й группы были выявлены симптомы поражения черепных нервов: частичная атрофия зрительных нервов (78%), внутренняя офтальмоплегия (23%), наружная офтальмоплегия (18%), анизокория (21%), миоз (14%), нистагм (36%), слабость жевательной мускулатуры (21%), анартрия (41%), дизартрия (25%), дисфагия (77%). Наблюдались симптомы поражения центрального двигательного нейрона в виде тетрапареза, который сочетался у 26% с гиперкинетическим синдромом, у 58% детей с псевдобульбарным синдромом и у 22% с гипертензионно гидроцефальным синдромом, 15% детей были шунтированы. У 87% детей имел место синдром локально обусловленной эпилепсии, подтвержденной ЭЭГ исследованием, больные находились на противосудорожной терапии.
Чувствительные расстройства и мозжечковые симптомы оценить было невозможно из-за тяжелого состояния больных. Были выявлены контрактуры крупных суставов различной степени выраженности и костные деформации: эквиноварусная установка стоп (72%), сколиоз (58%), кифо-сколиоз (25%). Отмечены вегетативные расстройства у 34% детей в виде дистального гипергидроза на ногах и руках, мраморного рисунка на коже, вазомоторных нарушений.
В 92% случаев имели место нарушения функций тазовых органов по центральному типу. Все дети в 1-й группе имели выраженную задержку речевого и психомоторного развития. По шкале (EDSS) 93% больных имели высокую степень инвалидизации (9,5 баллов). У 23% детей была установлена трахеостома, в 8% использовалась ИВЛ. Провести нейропсихологическое исследование у больных данной группы было невозможно вследствие того, что в 88% случаев продуктивный контакт с ребенком носил сомнительный характер.
Клиническое наблюдение № 1. Больная В., 2 года. Родители предъявляют жалобы на задержку психического и двигательного развития ребенка. Известно, что родители здоровы (матери 26 лет, отцу 28 лет, оба по национальности евреи, первый ребенок 4-х лет, сын, здоров), от второй беременности, протекавшей с токсикозом в 1-м триместре, дважды за беременность мать болела ОРВИ, была выявлена анемия. Роды 2-е срочные, без осложнений. По шкале Апгар 8/9 баллов, м = 3150 г, длина 51 см. Новорожденная закричала сразу, к груди приложили на 1-е сутки. Мать и ребенок были выписаны из роддома домой в срок. С периода новорожденности родители отмечали у ребенка общее беспокойство, частые срыгивания, нарушение сна, плохую прибавку массы тела.
С раннего возраста ребенок наблюдался по месту жительства у невролога с диагнозом: синдром мышечной дистонии, задержка психо-моторного развития. Учитывая данные, что в семье по линии отца есть случай заболевания Gм2 ганглиозидом, ребенок был направлен на медико-генетическое консультирование. В 6 месяцев было проведено инструментальное обследование: МРТ головного мозга, ультразвуковое исследование внутренних органов, офтальмоскопия, компьютерная электроэнцефалография. Данные офтальмологического исследования: подвижность глазных яблок полная, нистагм в крайних отведениях. Глазное дно имеет бледные диски зрительных нервов с четкими контурами, вены нормального калибра, артерии узкие. Макулярная и периферическая зона без особенностей, частичная атрофия зрительных нервов. УЗИ внутренних органов – без патологических изменений.
Видео-ЭЭГ-мониторинг: альфа-ритм представлен единичными редуцированными элементами, регистрируемыми в сочетании с бета и тета волнами. Отмечается преобладание амплитудных значений тета-волн в затылочных отведениях. В затылочных отведениях регистрировались высокоамплитудные патологические формы активности. В передне-, средне-лобных отведениях отмечались высокоамплитудные группы синхронных тета-волн. Данные ЭЭГ указывают на умеренные диффузные изменения с элементами судорожной активности в левом полушарии и вовлечение в патологический процесс подкорковых образований и ствола головного мозга на диэнцефальном уровне. МРТ головного мозга в стандартных импульсных последовательностях SE, FSE и FLAIR в T1 и T2 взвешенном изображении показало тотальное поражение белого вещества обеих гемисфер, мозжечка и ствола. Обследование в медико-генетическом научном центре в лаборатории наследственных болезней обмена веществ (Москва) выявило наследственное нейро-дегенеративное заболевание (лейкодистрофия Канавана) - мутация А305Е в 6-м экзоне гена (ASPA) аспартоацилазы в гетерозиготном состоянии.
Было проведено клинико-неврологическое обследование в возрасте 2-х лет.
В неврологическом статусе: ребенок в сознании, на осмотр реагирует спокойно. Со стороны черепной иннервации: глазные щели OD = OS, зрачки OD = OS, фотореакция ослаблена, взор кратковременно фиксирует при приближении предмета, прослеживает фрагментарно, лицо симметричное, слух снижен, глотание не нарушено. В рефлекторно-двигательной сфере отмечается снижение двигательной активности: голову не держит, поднимает ее кратковременно, при положении на животе опора на предплечья, не поворачивается на бок, не ходит, не сидит, кисти сжаты в кулачках. Опора на руки не сформирована. При вертикализации – опора на эквиноварусный стопы, выноса ноги нет. Мышечный тонус - гипертонус по спастическому типу. Сухожильные рефлексы высокие D = S, с расширенной рефлексогенной зоной D = S, клонус стоп D = S. Патологические кистевые (рефлекс Гоффмана, рефлекс Россолимо верхний, рефлекс Бехтерева) D = S, стопные рефлексы (рефлекс Бабинского, рефлекс Гордона, рефлекс Шеффера) D = S. Имеются «стартл-рефлексы» на неожиданный звук. Отмечается резкое вздрагивание на прикосновение. Отмечено грубое нарушение психического развития – эмоциональные реакции мало дифференцированы, контакт формальный, мало интересуется окружающим, вложенную в руку игрушку держит кратковременно, к игрушкам не тянется, сохранен ритм сна и бодрствования, редко гуление. Ребенок находится на симптоматической терапии (ноотропная, вазоактивная, жирорастворимые витамины и витамины группы В, антиэпилептическая). Провести у ребенка нейропсихологического тестирования было невозможно вследствие тяжести состояния и выраженной задержки психомоторного и речевого развития.
Проведенное лабораторное исследование плазмы крови больных 1-й группы выявило, что уровень содержания ФРГМ у обследуемых детей не имел достоверных различий в сравнение с контрольной группой (группа 5) (Рисунок 12).
Уровень содержания нейротрофинов (ФРН, ЦНТФ) в плазме крови имел достоверные различия у больных 1-й группы в сравнении с контрольной группой (р = 0,03) (Рисунок 13, Рисунок 14). При сопоставлении данных уровня нейротрофинов (ФРГМ, ФРН, ЦНТФ) внутри группы по гендерному признаку достоверных различий не выявлено (р = 0,50).
Данные лабораторного исследования плазмы крови больных 1-й группы на содержание белков, регулирующих и участвующих в процессе апоптоза, выявили, что уровень белка р53, белка Bcl2, цитохрома С и каспазы 8 имел достоверные различия в концентрациях исследуемых веществ в сравнении с контрольной группой (группа 5) (р = 0,001) (Таблица 9).
Сопоставление результатов лабораторного исследования нейротрофинов и белков регулирующих апоптоз в исследуемых группах
Анализ данных проведенного лабораторного исследования уровней нейротрофинов в сыворотке крови больных выявил сложность пептидной регуляции нервной системы на фоне текущего патологического процесса (Таблица 21).
Концентрация ФРГМ имела наибольшие значения в группе больных с поражением периферического двигательного нейрона, в то время как у больных 3-й группы содержание в крови этого фактора были на уровне сопоставимом с контрольными данными, причем у части больных концентрация ФРГМ была ниже нормы (Рисунок 48).
Концентрация ФРН имела наибольшие значения в группе больных с поражением центрального и периферического двигательного нейрона (1-я и 2-я группы), в то время как у больных 3-й группы содержание в крови этого фактора было на уровне, сопоставимом с контрольными данными концентрации ФРН (Рисунок 49).
Концентрация ЦНТФ имела наибольшие значения в группе больных с поражением центрального двигательного нейрона (1-я группа), в то время как у больных 2-й и 3-й группы содержание в крови этого фактора были на уровне, сопоставимом с контрольными данными концентрации ЦНТФ (Рисунок 50).
Повышенный уровень содержания ФРН и ЦНТФ в сыворотке крови больных 1-й группы может свидетельствовать о более активных процессах деструкции и репарации нервной ткани, так как в 87% случаев в этой группе у детей имела место эпилептиформная активность биопотенциалов головного мозга. У больных с эпилепсией была выявлена повышенная экспрессия рецепторов к НТФ [Battaglia G., et al. 2013]. Возможно, что выявленный высокий уровень содержания ФРН можно рассматривать, как компенсаторный механизм.
Однако активация нейротрофических факторов (ФРН, ЦНТФ), с одной стороны, обеспечивает трофическую поддержку поврежденным нейронам, с другой стороны – усиливает процесс дифференцировки глиальных клеток. Вследствие глиоза происходит частичное замещение нейрональных клеток на глиальные элементы, что приводит к структурно-морфологическим изменениям в головном мозге с утратой отдельных функций. Это, безусловно, тормозит развитие нервной системы больного ребенка, утяжеляет его состояние и увеличивает неврологический дефицит. Это подтверждается и более тяжелой степенью неврологических расстройств, которые выявляются у детей с рождения и данными электроэнцефалографии, указывающими на наличие выраженных диффузных, ирритативных изменений биопотенциалов с явлениями эпилептиформной активности.
Значительное увеличение концентрации ФРН и ФРГМ в сыворотке крови больных 2-й группы также отражает степень выраженности патологического процесса, но имеет кроме этого и свои внутригрупповые особенности. Вследствие того, что в 2-й и 3-й группах были больные в возрасте от 1 года до 43 лет, проведено изучение особенностей течения патологического процесса у больных орфанными заболеваниями в разных возрастных группах: до 18 лет и старше 18 лет. Больные этих групп (n = 97) были разделены на две подгруппы по возрастному критерию – младше 18 лет (n = 79) и старше 18 лет (n = 18). Числовые характеристики показателей, результаты оценки значимости различия показателей в зависимости от возрастной группы у больных и в группе контроля, а также результаты оценки значимости различия концентрации нейротрофинов в одинаковых возрастных группах в зависимости от наличия либо отсутствия заболевания приведены в таблице 22.
Уровень ФРГМ в контрольной группе при разделении ее по возрастному критерию у здоровых лиц до 18 лет имеет значения, статистически значимо (p 0,05) превышающие таковые у лиц старше 18 лет (Рисунок 53).
Сопоставление значений концентраций ФРН в контрольной и исследуемой группах, разделенных по возрастному критерию, показывает, что в группе больных (2-я и 3-я группа) младше 18 лет имело место статистически значимое (p 0,001) превышение концентрации ФРН (3680 ± 936 пг/мл; контроль 625 ± 444 пг/мл). Для концентрации ФРГМ выявлена такая же закономерность.
При сравнении концентрации нейротрофинов в возрастной группе старше 18 лет выявлено, что в группе больных (2-я и 3-я группа) концентрация ФРН и ЦНТФ статистически значимо (p 0,001) превышает таковые значения в контрольной группе: 1196 ± 448 против 668 ± 385 пг/мл – для ФРН, 28,1 ± 12,5 против 15,7 ± 6,4 пг/мл – для ЦНТФ. Значения концентраций НТФ у больных группы сравнения также подтверждают гипотезу о роли возрастного фактора в гиперэкспрессии ФРН у больных с тяжелым поражением нервной системы. Так у детей больных тяжелыми формами ДЦП выявлен высокий уровень ФРН - 2733 [1883; 4375] пг/мл.
Результаты проведенного исследования показали, что у больных 2-й группы имеет место повышенный уровень содержания нейротрофинов ФРГМ и ФРН в зависимости от возрастного фактора. Это можно объяснить тем, что у детей наиболее интенсивно работают процессы роста и дифференцировки нервной ткани, синаптогенеза [Gibon J., Barker P.A., 2017]. Однако можно рассматривать усиление синтеза нейротрофинов в контексте активизации компенсаторно приспособительных процессов, направленных на усиление репаративной функции нервной ткани. Компенсаторно-приспособительные механизмы запускаются и в физиологических, и в патологических условиях вследствие того, что физиологическая цель нейротрофической регуляции – сохранение жизнеспособной популяции нейронов для реализации генетически запрограммированной функции.
Клинико-патогенетические особенности обследуемого контингента не позволяют провести сравнение результатов проведенного нейропсихологического тестирования между больными разных групп. Все больные 1-й группы имели выраженную задержку психомоторного развития, в большинстве случаев были недоступны продуктивному контакту, имели симптомы псевдобульбарного паралича с явлениями дизартрии или анартрии, поэтому проведение нейропсихологического теста у детей данной группы было невозможно.
Во 2-й группе у 2 детей отмечена невыраженная задержка психомоторного развития, в большей степени имели место нарушения речи. Однако оба ребенка с диагнозом СМА I типа с первого года жизни находились на ИВЛ, у них была установлена трахеостома, которая препятствовала развитию активного навыка говорения. Среди больных 3-й группы по результатам нейропсихологического тестирования были выявлены в 31% случаев выраженные когнитивные расстройства, в 17% – умеренные нарушения когнитивной сферы.
Для уточнения роли генетических и биохимических факторов в развитии когнитивных расстройств у больных 3-й группы было проведено сопоставление клинико-неврологических, молекулярно-генетических и лабораторных данных с результатами нейропсихологического тестирования. Больные с диагнозом МДД (n = 36) были разделены на подгруппы по наличию когнитивных расстройств: больные МДД с умеренными и выраженными когнитивными расстройствами – группа (n = 19) и больные МДД без когнитивного дефицита – группа (n = 17). В дальнейшем для уточнения роли расположения мутации в гене МДД больные с подтвержденной мутацией были разделены на две группы по принципу расположения мутации в проксимальном отделе гена МДД Х-хромосомы (с 1 по 40 экзон) (n = 8) или дистальном отделе с 41 по 79 экзон (n = 16). Такое распределение было продиктовано данными о роли изоформ белка дистрофина, экспрессируемых с дистальной части гена Dp140 и Dp71 в развитии когнитивных расстройств у больных с МДД [Benabdesselam R. et al., 2012]. Было выявлено, что имеет место достоверное снижение концентрации нейротрофина ФРГМ в группе больных МДД с умеренными и выраженными когнитивными расстройствами.
Оценка влияния реагентов (фактора роста нерва и протеинкиназы С) на рост нейритов в органотипической культуре ткани
При добавлении в органотипическую культуру ткани в присутствие плазмы крови больных 1-й группы в разведении 1 : 70 реагента ФРН, данные ИП не изменялись в сравнении с образцами без реагента, т.е. сохранялся нейритингибирующий эффект. В присутствии ингибитора протеинкиназы С (ИПКС) - Тамоксифена (10-5 М) - нейрит-ингибирующий эффект плазмы крови устранялся (Pисунок 74).
При добавлении в органотипическую культуру ткани в присутствии плазмы крови больных 3-й группы в разведении 1 : 70 реагента ФРН был отмечен рост нейритов, сопоставимый с контролем, в присутствии ИПКС (10-5 М) индекс площади практически не отличался от значений индекса площади в контрольной группе (Рисунок 76)
Анализ данных показал, что нейрит-ингибирующий эффект, наблюдаемый в 1-й и 2-й группе, устранялся добавлением в органотипическую культуру ткани ИПКС, а добавление реагента ФРН в тест-систему в присутствии плазмы крови больных 3-й группы усиливало рост нейритов (Рисунок 77).
В таблице 28 представлены числовые показатели ИП эксплантата в исследуемых группах, выявлено статистически достоверное увеличение ИП в эксплантатах, содержащих ПК больных 1-й и 2-й группы на фоне присутствия ИПКС (Тамоксифена).
Терапия (др. – греч. – «врачебный уход, лечение») – процесс, целью которого является облегчение, снятие или устранение симптомов и проявлений того или иного заболевания, патологического состояния или иного нарушения жизнедеятельности, нормализация нарушенных процессов жизнедеятельности и выздоровление, восстановление здоровья. К сожалению, для больных орфанными наследственными нервно-мышечными заболеваниями проводить врачебные мероприятия в полном объеме невозможно, вследствие непреодолимых в настоящее время проблем, которые связаны с нарушенным геномом у больных.
Целью дальнейшего этапа исследования был поиск препаратов, способных снимать нейриингибирующий эффект в органотипической культуре ткани и приводить к росту нейритов исследуемых эксплантатов. На основе проведенных исследований нельзя рекомендовать больным с ОННМБ прием препаратов, направленных на стимуляцию тирозинкиназных рецепторов. Во-первых, больные 1-й и 2-й групп имели высокие уровни содержания нейротрофинов в плазме крови. Во-вторых, в экспериментах с органотипической культурой ткани плазма крови этих больных имела нейритингибирующий эффект на рост нейритов. В-третьих, при введении в тест-систему, содержащую ПК больных 1-й и 2-й групп, Тамоксефена (10-5) наблюдали усиление роста нейритов, что указывает на связь нейритингибирующего действия с системой G-белка, через которую запускают процессы нейротрофины, активизируя каскад с участием протеинкиназы С.
Таким образом был проведен поиск лекарственных препаратов, которые могли воздействовать на нейрон через другие рецепторы, и было проведено их фармакологическое тестирование в органотипической культуре ткани в присутствии ПК больных исследуемых групп. Было предложено воздействовать на нейрон через ионотропные рецепторы. Они являются мембранными каналами, которые открываются или закрываются при связывании с лигандом. Ионные токи вызывают изменения разности мембранного потенциала, и вследствие этого, меняется возбудимость клетки, что может вторично приводитъ к активации внутриклеточных посредников.
Многочисленные исследования последних лет показали, что возникновение патологических состояний в нервной системе сопровождается активацией процессов свободнорадикального окисления молекул биологических мембран. В качестве антиоксиданта в экспериментальном исследовании на органотипической культуре ткани была использована коменовая кислота, так как имеются данные о нормализующем влиянии коменовой кислоты и коменатов натрия на гиппокампальную пластичность и свободнорадикальное окисление в условиях стресса. Было установлено, что коменовая кислота обладает антирадикальными свойствами и подавляет генерацию активных форм кислорода.