Содержание к диссертации
Введение
Глава I . Обзор исследований по кариологии и развитию мужских и женских репродуктивных структур сосны
1. Изучение кариотипа 8
2. Развитие микростробилов сосны 15
3. Развитие женских репродуктивных структур сосны . 21
Глава II . Генезис сосновых лесов центральной тувы. природные условия и лесной фонд балтазын- ского бора З Є<
Глава III. Программа, материал, методы и объекты исследований... 40
Глава ІV. Изучение кариотипа и хромосомньк мутаций
1. Кариотип сосны обыкновенной 55
2. Геномные мутации и структурные перестройки хромосом 65
Выводы . 79
Глава V . Мейоз и качество пыльщ " 82
Выводы
Глава VI Особенности развития женских репродуктивных структур и семенной продуктивности сосны в центральной туве
1. Изучение отдельных этапов развития женских репродуктивных структур 95
2. Изучение пыльцевого режима 107
3. Контролируемые скрещивания 109
Выводы 115
Заключение 117
Выводы 120
Литература 123
- Изучение кариотипа
- Развитие женских репродуктивных структур сосны
- Кариотип сосны обыкновенной
- Геномные мутации и структурные перестройки хромосом
Изучение кариотипа
Сосна обыкновенная относится систематиками к секции Pinus , подсекции Sylvestres , объединяющей около 20 видов ( Little, Critchfieid, 1969 ) . Подсекция в основном соответствует группе Lariciones , Выделенной Шоу ( Shaw,1914 ). В сводке Пильгера (Piiger, 1926 ) все эти виды разобщены по разным секциям и подсекциям, а в обзоре Лендри (Landry, 1974 ) - объединены в секцию Pinus.
Кариотипы видов подсекции Sylvestres специально исследовались Л.И.Сейлором (Sayior, 1964 ), который отметил наличие. у всех видов подсекций 10 пар равноплечих хромосом и 2 пар неравноплечих. Различия между кариотипами большинства видов наблюдаются по числу и локализации вторичных перетяжек.
Сосна обыкновенная является весьма полиморфным видом: У НЄГО ОПИСаНО МНОЖеСТВО раЗНОВИДНОСТеЙ И форм (Svoboda, 1953; Carlisle, 1958; Правдин, 1964; Kirov, 1967; Бобров, 1978 и др.). Некоторые из географических рас и эдафических экоти-пов вбзводятся в ранг самостоятельных видов (например, р. сгеaceae, P. sosnovskii и др.). Кариотип сосны обыкновенной является объектом длительного изучения как в СССР (Правдин, 1964; Бударагин, 1973; 1980; Кириченко, 1977; Абатурова, 1978; Вуторина и др., 1979; Кириченко, Коц, 1981 и др.), так и за -9 рубежом ( Sax, Sax, 1933; Aass, 1957; Yidakovic, 1958; ITata-rajan et al. , 1961; Sarkar, 1963; lfegl, 1965; Pederick, 1970; Mihailesku, Dalu, 1972; Kormutak, 1975; Borzan, Papes, 1978;Borzan, 1981 и др.). В результате проведенных исследований у этого вида выявлены межпопуляционные различия по общей длине хромосом набора, величине отдельных хромосом, числу и локализации вторичных перетяжек, наличию и локализации гетерохрома-тина. При изучении кариотипа P. sylvestris subsp. hamata (Stev) Pomin, произрастающей на Кавказе, выделено три группы хромосомой отмечена тенденция уменьшения числа хромосом со вторичными перетяжками по мере увеличения высоты над уровнем моря (Шишниашвили, 1968).
У СОСНЫ меловой ( P. sylvestris var. cretacea Kalenicz. en Кот)выявлены некоторые отличия в числе и локализации вторичных перетяжек, что дало основание авторам (Машкин и др., 1974) рассматривать ее в качестве подвида или даже вида, а не экологической формы сосны обыкновенной (Правдин, 1964; Бобров, 1978). В исследованиях кариотипа в популяциях p. sylvestris L. в центре и на периферии ее ареала особо отмечены признаки наличия вторичных перетяжек и спирализации хромосом (Абатурова, 1978; Абатурова, Шершукова, 1981). В частности, выявлена тенденция увеличения частоты встречаемости вторичных перетяжек хромосом к окраине ареала вида. Неоднородность индекса спирализации хромосом проявилась как на внутри-, так и межпопуля-ционном уровнях. При этом предполагается, что близкое к одновершинному характеру распределение индексов спирализации свойственно для наиболее древних, изолированных от основного ареала популяций сосны. Двувершинный характер кривых изменчи -10 вости, на примере ширины и толщины хвои у северо-казахстан-ской сосны, отметил Л.Ф.Правдин (1964). Ш высказано предположение, что двувершинность распределения признаков может наблюдаться у форм гибридного происхождения.
Предварительное сообщение о кариотипе кулундинской сосны P. sylvestris subsp. kulundensis Sukacz. ИЗ Тувы (ПрэВДИН, 1964) было существенно дополнено при изучении этого подвида в популяциях казахского мелкосопочника и прилегающих районах Южного Урала. По мнению В.А.Вударагина (1973, 1980), кариотип сосны в указанных популяциях значительно отличается от описанных ранее хромосомных наборов вида из других частей его ареала. В кариотипе кулундинской сосны визуально идентифицируются три пары хромосом (X, XI, ХП), а по наличию вторичных перетяжек гомеоморфные хромосомы разделены на две группы. В X паре хромосом сравнительно часто выделяется смежная вторичная перетяжка. Рассматривая влияние изоляции на межпопуляпи-онную изменчивость кариологических признаков (размеров хромосом, локализации и частоты встречаемости вторичных перетяжек), В.А. ударагин обращает внимание на выявляемые только статистически межпопуляционные различия. Он предполагает, что такой характер изменчивости признаков является следствием генетико-автоматических процессов в изолятах. В восточной части ареала (Амурская область) сосна обыкновенная имеет 3 пары хромосом со вторичными перетяжками, 10 пар равноплечих и 2 пары разноплечих хромосом. В северо-восточной же части ареала (Центральная Якутия) - все хромосомы равноплечие (Ильченко, 1978). Предполагается, что кариотипи-ческий полиморфизм на внутри- и межпопуляционном уровнях является следствием генетической адаптации растений к экологическому разнообразию. Это, в свою очередь, ведет к дивер -11 гентной эволюции кариотипа.
Сравнительный анализ кариотипов отдельных деревьев P. nigra L. ИР. sylvestris , Проведенный на Балканах ( Borzan,1981), показал, что даже в однородных по происхождению тканях эндосперма семян наблюдается дифференциация клеток по частоте и локализации вторичных перетяжек, наличию гетерохроматина. Однако по сходству величины хромосом и локализации вторичных перетяжек у некоторых деревьев сосны черной и сосны обыкновенной можно судить, как полагает автор, о возможности успешной межвидовой гибридизации.
Материалы по дифференциальной окраске хромосом некоторых видов из p. Pinus свидетельствуют об очень малом содержании КОНСТИТУТИВНОГО гетерохроматина (Borzan, Papes, 1978; McPher-son, Pilion, 1981; Borzan, 1981). Тем самым подтвердились данные, полученные ранее на основании пахитенного анализа P. radiata ( Pederick, 1970). Можно предположить, что малое содержание гетерохроматина в хромосомах сосновых обусловливает сравнительное однообразие хромосомных наборов в пределах отдельных родов, а также низкую скорость эволюции кариотипов семейства Pihaceae (Круклис, Муратова, 1980).
Развитие женских репродуктивных структур сосны
Изучение эмбриологии хвойных имеет более чем вековую историю. Начало описательной эмбриологии этой группы растений положено в середине XIX века классическими работами В.Гофмей -22 стера и Э.Страсбургера. В трудах русских эмбриологов П.С.Цен-ковского, И.Н.Горожанкина и В.И.Беляева указанные исследования получили дальнейшее развитие.
Работы по изучению репродуктивного цикла у хвойных, в частности, исследования формирования женских репродуктивных Структур СОСНОВЫХ, Обобщены В ряде Монографий И Обзоров( Chamberlain, 1935; Buchhoiz, 1946; Wardlaw, 1955; Некрасова, 1961, 1972; Chovrdhury, 1962; Schnarf, 1963; Doyle, 1963; Konar, Oberoi, 1963; Machesvari, Singh, 1967; Козубов, 1974, 1982; Mehra, Dogra, 1275; Singh, 1978; Konar, Moitra, 1980 и др.). Состояние отечественных исследований по биологии плодоношения хвойных древесных пород отражено в обзорах Т.П. Некрасовой (1973, 1982).
Реализация в последние десятилетия идеи создания лесосе-менной базы на генетико-селекционной основе потребовало постановки исследований в области цитологии, эмбриологии и регулирования плодоношения древесных пород. В этот период ряд работ был посвящен изучению дифференциации апикальной меристемы, гистогенеза генеративных органов, в частности, развития спорогенных тканей у различных видов сосен, лиственниц и ели (Котелова, 1956; Hakansson, 1956; Giffort, Hirov, I960; Mirov, I960; Некрасова, 1961; 1972, 1983; Михалевская, 1963; Гиргидов и др., 1964; Gustafsson, Mergen, 1964; Chira, 1965; Козубов И др., 1967, 1970; Скупченко, 1970; Chng, Simak, 1971; Артемов, 1972, 1973; Варна, 1972; Совершаев, 1972; Хазова, Ковешникова, 1972; КозубОВ, 1974; Pillai, Pillai, 1974; Baing, Tranquil-lini,I976; Kupiia-Ahvenniemi, 1977; Донская, 1977, 1980; Круклис, 1278; Хазова и др., 1978, 1979; Thomas, IS79; Тренин, 1982; Третьякова, I9 82, 1983 и др.).
Несмотря на активацию эмбриологических исследований, ряд вопросов развития генеративных органов и клеток еще не решены,\ а некоторые хвойные эмбриологически совершенно не изучены (Некрасова, 1973, 1982). Такое положение затрудняет широкое использование эмбриологических признаков при разработке вопросов систематики и филогении голосеменных. Естественно, что в настоящее время идет процесс накопления информации о прохождении эмбриологических процессов у хвойных.
Изучению цитоэмбриологических аспектов плодоношения сосны обыкновенной посвящено значительное число исследований.. Если в первых работах обобщались общие представления о характере протекания морфогенеза женских половых структур в тех или иных экологических условиях (Некрасова, 1961; Котелова, 1965 а,б; Артемов, 1973; Sarvas, 1962; zm, 1976 и др.), то на последующих этапах появились исследования, детально освещающие отдельные фазы гаметогенеза и эмбриогенеза. Так, с начала 70-х годов начали публиковаться работы, сочетающие электронномикро-скопические и гистохимические методы исследования генеративных органов СОСНЫ (КозубОВ И др., 1970; Chesnoy, Thomas, 1971; Miliemse, 197І; Козубов, 1972, 1974, 1982; Pettitt, 1277, 1979; Wanes, 1979; Тренин, 1981, 1982 и др.).
Такой подход позволяет не только описывать тонкие детали строения генеративных органов, но и раскрывать их функциональ-ное значение. Например, по данным, полученным Г.М.Козубовым (1974), зрелые архегонии сосны не имеют собственной оболочки. Однако клетки выстилающего слоя зародышевого мешка имеют структуру» сходную с клетками тапетума в микроспорофиллах, что подтверждает не только филогенетическое родство процессов формирования микро- и макроспор, но и одинаковую функциональную роль тапетума и выстилающего слоя (защитную, питательную).
Интересные результаты получены М.Томасом (Thomas, 1979) при изучении ранних стадий эмбриогенеза. Им показано, что функциональные особенности суспензора и эмбриональных клеток зародыша детерминируются уже на первых стадиях развития про-эмбрио. Это проявляется в особенностях ультраструктуры и химического состава клеток. К сожалению, исследования такого рода не получают широкого распространения вследствие их трудоемко-сти и высокой стоимости аппаратуры. В связи с этим целесообразно, по мнению Г. М. Ко зубова (1973), развивать изучение ультраструктуры различных органов древесных растений на кооперативной основе по скоординированной программе. Определенное развитие эта идея получила в совместных советско-шведских исследованиях плодоношения у ели обыкновенной (Биологические основы..., 1981).
Изучение развития женского гаметофита в различных экологических условиях показало, что популяции сосны обыкновенной обладают различной степенью гетерогенности по представительству рано- и поздноцветущих особей. Это влечет за собой гетерогенность древостоев по урожайности. Во многих случаях на семенную продуктивность оказывает влияние пыльцевой режим в древостоях.
Изучению закономерностей распределения пыльцы в насаждениях посвящена обширная литература ( Dengier, Scamoni, 1944; Ды-лис, 1948; Wright, 1952; Langler, 1953; Silen, 1962; Sarvas, 1962; banner, 1966; Koski, 1970, 1975, 1978; Некрасова,1983 и др.). Дальность перелета пыльцы определяется как с помощью пыльцеулавителей различной конструкции, так и с применением метчиков: радиоактивных изотопов (Семин идр., 1975; Подгорный, и др., 1976), флуорокромов (Ефимов, Косиченко, 1979), солей тяжелых металлов ( Stem, 1972; Koski, 1978). Особенно интенсивно пыльцевой режим в насаждениях исследуется в связи с организацией лесосеменных плантаций
Кариотип сосны обыкновенной
Изучение внутрипопуляционной изменчивости кариотипа сосны важно для познания структуры популяций и микроэволюционных процессов в конкретных условиях среды. Диплоидный набор сосны обыкновенной из Балгазынского бора представлен 24 хромосомами (рис.5). Для кариологического анализа отобраны метафазные пластинки, в которых суммарная длина хромосом варьировала в сравнительно узком интервале -340-370 мкм. Отобранные пластинки использовали при определении параметров хромосом и построения поликариограммы (рис.б).
Анализ поликариограммы показал, что по используемым признакам можно выделить три пары хромосом (I, XI и ХП). Остальные хромосомы сконцентрированы в виде компактного облака точек, в котором трудно выделить отдельные гомологи. ХП и XI пары являются наиболее короткими в наборе. По индексу локализации центромеры эти хромосомы приближаются к субметацентри-ческим. Однако, в соответствии с номенклатурой хромосом растений (Агапова, Гриф, 1982), они не достигают верхнего предела (37,5$) класса субметацентрических хромосом.
Учет встречаемости и локализации вторичных перетяжек позволили внести некоторую определенность в вопрос об идентификации хромосом в гомеоморфной грзгппе. В связи с тем, что у разных гомологов перетяжки отделяют неодинаковые участки плеча, в отдельных наборах эти хромосомы удалось идентифицировать. С помощью этого маркера выделены гомологи, занимающие в ряду хромосом второе, третье, четвертое, девятое и десятое места.
Наиболее высокие значения встречаемости вторичных пере -56-тяжек характерны для І-ІУ и X пар хромосом (60-95$). Значительно реже (до 40$) вторичные перетяжки появляются в IX паре хромосом. На I паре хромосом вторичные перетяжки имеются в обоих плечах. В единичных наборах наблюдалась смежная вторичная перетяжка на X паре хромосом. Последнее явление характерно для сосны обыкновенной в островных борах Казахстана (Дуда-рагин, 1973).
В І-ІУ и IX парах хромосом индексы локализации вторичных перетяжек варьировали в пределах 52-65$, а в X паре 58-62$. В отдельных наборах вторичные перетяжки появлялись на одном или двух гомологах XI и ХП пар. Изменчивость показателей вторичных перетяжек указывает на дифференциальную активность гомологичных хромосом.
По результатам анализа поликариограммы, частоты встречаемости и локализации вторичных перетяжек хромосомы сосны обыкновенной систематизированы (табл.3). По этим же данным составлена идиограмма (рис.7 и). . Кариофонд Pinus syivestris L. Показаны идиограммы следующих популяций: а - Алтай; 6 - Бурятия; в -красноярская; г - якутская; д - Челябинская степная; е - Кокчетау-Мунгантинская; ж - Наурзумская; и -Балгазынский бор; к - юго-западные районы Амурской обл.; л - Ленинградская обл.; ш - Литовская ССР; н - Московская обл.; о - Полтавская обл.; п - Башкирская АССР; а-г (Абатурова,Шершукова,1981); Д-ж (Бу дара гин, 1973); л-п (Абатурова, 1978) Районы вторичных перетяжек хромосом чаще всего являются ядрышкообразущими (Кикнадзе, 1972 и др.). Использование модифицированного метода окраски серебром ( oiert, 1979) позволило установить, что в кончиках корешков проростков семян сосны количество разнообразных по форме и размерам ядрышек (рис.8) может варьировать в значительных пределах (от 2 до 18 на клетку). Число ядрышек, выявляемых в интерфазных клетках, обычно соответствует частоте встречаемости вторичных перетяжек в метафазных клетках (табл.4), хотя средние значения этих признаков не всегда совпадают. Более высокая частота встречаемости вторичных перетяжек характерна для полукарликовых деревьев.
Изменчивость частоты встречаемости вторичных перетяжек и ядрышек в корневой меристеме проростков семян, шт. ( в числителе - лимиты, в знаменателе - среднее ) Различное количество ядрышек в клетках корешков проростков семян сосны (окраска нитратом серебра) б,в - профазные клетки с ядрышками в виде темноокрашенных образований, тесно связанных с хромосомными нитями іслетку) и ядрышек свидетельствует о наличии латентных (скрытых) ядрышковых организаторов, проявляющих свою активность при определенных условиях. Кроме того, причиной выявления клеток с повышенным числом вторичных перетяжек и ядрышек может быть миксоплоидность. Миксоплоидность генеративных тканей (смесь диплоидных и полиплоидных клеток в различном соотношении) отмечена в исследованиях мейоза у особей сосны обыкновенной, различающихся по смолопродуктивности ( уторина и др., 1982). На встречаемость миксоплоидов у хвойных в питомниках и лесных школах указывали Е.Н. Муратова и М.В.Круклис (1982). Несомненно, что этот вопрос заслуживает особого внимания при изучении внутри- и межпопуляционной изменчивости вида.
Сравнительный анализ кариофонда сосны обыкновенной в пределах изученных к настоящему времени популяций (рис.7) свидетельствует как об аналогии общих черт кариотипов ее подвидов, так и уникальности кариологических признаков каждой из популяций. Все они имеют по три пары (редко две) самых маленьких, визуально идентифицируемых хромосом. Гомеоморфная группа с помощью дополнительных маркеров - вторичных перетяжек - подразделяется, что позволяет определить специфичность кариологичес-ких признаков каждой из популяций. Наиболее высокой частотой вторичных перетяжек характеризуются популяции и отдельные особи сосны, находящиеся в экстремальных или близких к ним условиях среды (Абатурова, 1978; Буторина и др., 1979; Кириченко, 1983 и др.). дифференциацию кариотипов в системах популяций можно объяснить, вероятно, локальным давлением экологических и микроклиматических факторов среды.
Определенная стационарность хромосомных вариантов наблюдается в филогенетически и пространственно близких популяциях сосны. Так, в островных борах Казахстана и Южного Урала (By -63-дарагин, 1973) вторичные перетяжки наиболее часто встречаются , в L-ІУ и X парах хромосом. Причем, для всех популяций весьма характерным общим признаком является смежная вторичная перетяжка в X паре хромосом (рис.7 д-ж).
Аналогичная ситуация характерна для Красноярской и Алтайской популяций (Абатурова, Шершунова, 1981), а также Бал-газынского бора (рис.7 а,в,и). В данном случае кариотипы имеют сходство по І-ІУ и X парах хромосом с вторичными перетяжками. При этом в отдельных хромосомных наборах сосны из Бал-газынского бора, как отмечалось выше, на X паре наблюдается смежная вторичная перетяжка, что в определенной мере подтверждает филогенетическую близость Южносибирских и Казахстанских сосняков. Различия, выявляемые на межпопуляционном уровне, обусловлены, вероятно, хромосомными перестройками.
Геномные мутации и структурные перестройки хромосом
Нормальных по габитусу деревьев выявлены геномные мутации и структурные перестройки хромосом. Хромосомные аберрации, обнаруженные в меристеме проростков, являются, в большинстве случаев, мутациями хромосомного типа. Крупные размеры хромосом и большое их количество затрудняет детальный анализ перестроек хромосом. Поэтому при массовом учете регистрировались только крупные, хорошо заметные структурные мутации (кольцевые хромосомы, ацентрические кольца, надетые кольцевые хромосомы, дицентрики).
Среди деревьев, изученных по сборам семян 1978-1980 гг., обнаружены особи, у которых наряду с хромосомными аберрациями (рис.9) отмечены геномные мутации (миксоплоиды -смесь диплоидных и полиплоидных клеток). Наиболее часто ука іа.Кольцевая хромосома в метафазной клетке из ме-ристематических тканей проростка семени (2 =22+ кольцевая хромосома), б.Кольцевая хромосома и фрагмент занные отклонения встречаются в семенном потомстве полукарли-) ковых и карликовых деревьев (табл.5).
Частота встречаемости хромосомных перестроек в пересчете на 100 клеток у полукарликовых и карликовых деревьев выше, чем у нормальных. Следует отметить, что среди карликовых деревьев встречаются особи с очень высокой частотой хромосомных нарушении. Так, у.трех деревьев карликового типа (Ш 24, 69 и 211 а) хромосомные аберрации наблюдаются у 70-100$ семян (табл.5). У двух первых деревьев корневые системы частично обна- жены за счет ветровой эрозии. Возможно, что в данном случае повышению частоты проявления хромосомных мутаций способствовали как неблагоприятные экологические условия, так и изменения гормонального баланса, которые в комплексе привели к нарушению гомеостатических реакций этих особей.
Среди семенного потомства 32 деревьев нормального типа хромосомные перестройки чаще всего отмечаются у старовозрастных деревьев. В слабо изреженных насаждениях у деревьев Ш-ІУ классов возраста хромосомные аберрации в семенном потомстве встречаются редко.
В отношении частоты встречаемости хромосомных аберраций определенный интерес представляют данные о временной изменчивости этого показателя. Среди 54 изученных деревьев только у двух обнаружены проростки, имеющие наряду с указанными выше хромосомными мутациями, клетки-трисомики (2п= 25). Причем, дерево №18 оказалось в этом отношении уникальным. На основании трехлетних наблюдений за его семенным потомством установлено, что в отдельные годы (например, в 1979 г.) у полусибсов параллельно с общим повышением количества клеток с хромосомными аберрациями увеличивается доля клеток-трисомиков (табл.6).
Временная изменчивость частоты встречаемости геномных и хромосомных нарушений зависит, по-видимому, от конкретных экологических условий каждого года. Интересно, что в единичных проростках встречаемость клеток-трисомиков (рис.10) возрастала параллельно с хромосомными мутациями до 97%, Причем, в анеуп-лоидных клетках хромосомные аберрации отмечены лишь в единичных случаях.
Кариологический анализ показал, что."лищняя" хромосома по своим параметрам достоверно не отличается от XII пары хромосом. Ее размеры 9,1 + 0,01 mkm . Появление подобных анеуплоидных клеток в культуре тканей животных при воздействии неблагоприятных условий отмечали различные авторы (Бахтин, 1980; Родионов, Смирнов, Смарагдов, 1981 и др.).
В проростках семян с выявляемыми в метафазах хромосомными нарушениями часто наблюдаются интерфазные клетки (от 0,3 до 1655 на проросток) с ацентрическими кольцами и фрагментами хромосом (рис.11). Наблюдения показали, что интерфазные клетки
