Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Возможности применения флавоноидов в решении вопросов таксономии 8
1.2. Классификация, биологические функции, терапевтическое действие флавоноидов 13
1.3. Способы выделения и идентификации флавоноидов 19
1.4. Биохимические исследования некоторых видов рода Astragalus L. Сибири и их лекарственные свойства 23
ГЛАВА 2. Объекты, материалы и методы исследования 37
2.1. Объекты и материалы исследования 37
2.2. Методы исследования 46
ГЛАВА 3. Таксономия, генеалогия, экология и география секци Cenantrum Koch рода Astragalus L. Сибири 51
3.1. Таксономия рода Astragalus L. и секции Cenantrum Koch Сибири 51
3.2. Генетические связи, экология и география 60
ГЛАВА 4. Таксоноспецифичность и изменчивость флавоноидов некоторых сибирских видов рода Astragalus L 63
4.1. Специфичность и изменчивость агликонового и гликозидного состава флавоноидов 63
4.2. Изменчивость содержания флавоноидов 77
ГЛАВА 5. Изменчивость флавоноидного состава A. membranaceus (Fischer) Bunge 80
5.1. Эндогенная и сезонная изменчивость 80
5.2. Онтогенетическая изменчивость 85
5.3. Изменчивость содержания и состава флавоноидов A. membranaceus в разные годы
5.4. Внутривидовая (географическая) изменчивость 91
ГЛАВА 6. Некоторые аспекты использования флавоноидного состава в систематике секции Cenantrum Koch 98
Выводы 110
Список литературы 112
- Классификация, биологические функции, терапевтическое действие флавоноидов
- Методы исследования
- Генетические связи, экология и география
- Специфичность и изменчивость агликонового и гликозидного состава флавоноидов
Классификация, биологические функции, терапевтическое действие флавоноидов
Флавоноиды — производные бензо-ос-пирона, в основе которых находится фенилпропановый скелет, состоящий из Сб-Сз-Сб углеродных единиц. М.Н. Запрометов (1993) подразделяет их на следующие классы: 1. Незамещенные в пирановом ядре флаваны. 2. Катехины (флаван-3-олы). Широко распространены в растениях, особенно (+)-катехин и (-)-эпикатехин. 3. Флаван-4-олы (лютеоферол). Известны лишь два представителя. 4. Лейкоантоцианидины (флаван-3,4-диолы). 5. Дигидрохалконы - весьма малочисленный класс флавоноидных соединений. 6. Халконы - вещества, окрашенные в желтый цвет благодаря хромофорной группировке. 7. Антоцианидины и антоцианы. Наряду с хлорофиллом и каротиноидами, главные красящие вещества растений. Этот класс является одним из наиболее распространенных и многочисленных. Шесть основных антоцианидинов (агликонов антоцианов): пеларгонидин, цианидин, пеонидин, дельфинидин, петунидин, мальвидин. 8. Флаваноны - бесцветны. Известно свыше 40 агликонов. 9. Флаванонолы (дигидрофлавонолы). Наиболее широко распространены дигидрокемпеферол и дигидрокверцетин. Подобно флаванонам, дигидрофлавонолы являются предшественниками в биосинтезе других классов флавоноидов. 10. Флавоны - имеют желтую окраску. Наиболее часто встречаются апигенин и лютеолин. 11. Флавонолы также принадлежат к желтым красящим веществам: кверцетин, кемпферол, изорамнетин, мирицетин. Имеют широкое распространение в растениях. Одним из наиболее известных производных является рутин. 12. Ауроны - ярко желтые пигменты (гиспидол, сульфуретин, ауреузидин).
Вопрос о функциях фенольных соединений и, в частности, флавоноидов до сих пор остаётся недостаточно изученным. Открываются всё новые стороны их функций в растительном мире. И сейчас совершенно ясно лишь одно - разнообразие строения фенольных соединений сопровождается и разнообразием их функций (Высочина, 2002). М.Н. Запрометов (1993) все функции фенольных соединений в растениях, известные к настоящему времени, условно подразделил на две большие группы. Основную часть фенольных соединений составляют флавоноиды, поэтому все эти функции, за некоторым исключением, можно отнести и на счёт флавоноидов: I. Функции широкого плана, выполняемые соединениями простого строения, содержащимися практически во всех растениях: 1. Защита фотосинтетического и генетического аппарата против вредного действия коротковолнового УФ-излучения. 2. Флавоноиды как индукторы (сигнальные вещества) во взаимосвязях растения - микроорганизмы. 3. Флавоноиды как запасные вещества в метаболизме растений. П. Специализированные функции: 1. Компоненты электрон-транспортых цепей митохондрий и хлоропластов; 2. Специфические защитные агенты в патогенезе растений. 3. Разобщители окислительного фосфорилирования. 4. Агенты, регулирующие процессы роста, развития и репродукции. 5. Вещества, играющие определённую роль во взаимоотношениях высших растений друг с другом, растений и микроорганизмов, растений и насекомых, растений и животных, то есть экологический аспект функций флавоноидов. Кроме того, что флавоноиды выполняют определённые функции в растительном мире, они также являются физиологически активными веществами по воздействию на организм человека.
Методы исследования
Состав и содержание флавоноидов исследовали методами хроматографии на бумаге, тонкослойной и колоночной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), хроматоспектрофотометрии, УФ-спектроскопии.
Для изучения качественного состава и содержания гликозидов воздушно-сухое сырьё измельчали, брали точную навеску и сумму флавоноидов исчерпывающе экстрагировали 50% этанолом при нагревании на водяной бане.
Объединённый экстракт выпаривали и наносили оптимальное количество на хроматографическую бумагу FN 3, 5, 12. Каждую пробу наносили в трёх повторностях, одну хроматограмму использовали для проявления, две другие - для количественного анализа. Применяли системы растворителей: изопропанол - муравьиная кислота - вода (2:5:5) (I направление), н-бутанол - уксусная кислота - вода (40:12:28) (И-направление). Полученные двумерной бумажной хроматографией гликозидные профили просматривали в УФ-свете и в парах аммиака до и после проявления 5% спиртовым раствором А1СЬ (Mabry et al., 1970; Клышев и др., 1978; Высочина и др., 1987).
Кроме хроматографии на бумаге с метчиками и проявителями, идентификацию флавоноидов проводили с помощью УФ-спектроскопии с применением ионизирующих добавок и комплексообразователей (Mabry et al., 1970; Маштаков и др., 1971; Литвиненко, 1973; Клышев и др., 1978). Спектры поглощения записывали на спектрофотометре Specord UV-Vis.
Для получения агликонов водно-спиртовый экстракт из надземной части растений гидролизовали 5% раствором серной или соляной кислоты 2 часа на водяной бане. Агликоны извлекали диэтиловым эфиром. Разделяли агликоны на колонках с силикагелем (система растворителей толуол - этилформиат -муравьиная кислота, 5:4:1) и с полиамидным сорбентом (элюция возрастающими концентрациями водно-этанольных или хлороформно-этанольных смесей), а также в тонких слоях сорбента и на бумажных хроматограммах. Для колоночной хроматографии на силикагеле использовали ту же систему, что и для ТСХ, для последней применяли пластины Silufol UV 254 без люминесцентного индикатора.
В хроматографии агликонов использовали бумагу марок FN 3, 5, 8. Для одномерного хроматографирования применяли системы: изопропанол -муравьиная кислота - вода (2:5:5), уксусная кислота - муравьиная кислота -вода (10:2:3), 60 % уксусная кислота, уксусная кислота - соляная кислота -вода (30:3:10), хлороформ - уксусная кислота (3:2) (Высочина, 1969). Лучшие результаты разделения наблюдали в первых трех системах растворителей. При разделении суммы агликонов на двумерной хроматограмме использовали в первом направлении системы растворителей изопропанол - муравьиная
кислота - вода (2:5:5), уксусная кислота - муравьиная кислота - вода (10:2:3), 60 % уксусная кислота. Во втором направлении - н-бутанол - уксусная кислота - вода (40:12:28), 60% уксусная кислота. Агликоны астрагалов хорошо разделились в 60 % уксусной кислоте, используемой в обоих направлениях, а также в системах растворителей: изопропанол - муравьиная кислота - вода (2:5:5) и н-бутанол - уксусная кислота - вода (40:12:28). Идентификацию агликонов проводили аналогично идентификации гликозидов. Для определения агликонового состава гликозидов применили методику кислотного гидролиза на одномерных хроматограммах (Высочина, 1967).
Метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) был применён для идентификации агликонов видов секции Cenantrum. Анализ проводили на приборах «Милихром-2» и «Agilent 1100» (Германия) - аналитических ВЭЖХ-системах, состоящих из жидкостного хроматографа с УФ-спектрофотометрическим детектором и системы для сбора и обработки хроматографических данных. Микроколоночную хроматографию на приборе «Милихром-2» проводили на колонке ProntoSIL-120-5-C18 AQ, размером 75 х 2,0 мм, диаметр частиц 5 мкм; элюент - метанол, скорость потока - 0,15 мл/мин, объем вводимой пробы 1 мкл. Детектирование осуществляли при X 250, 260, 280, 290, 360 нм.
Разделение на приборе фирмы «Agilent 1100» проводили на колонке Diasorb 130 размером 150 х 2,0 мм с октадецилсиликагелем (С18) с диаметром частиц 7 мкм. Подвижная фаза: метанол - ортофосфорная кислота (0,5 %) (48:52). Скорость потока элюента 1,5 мл/мин. Объем вводимой пробы 5 мкл. Детектирование осуществляли при X 360 нм. ВЭЖХ анализ каждого образца проводили в 2-кратной повторности.
Генетические связи, экология и география
Рассмотрим характер распространения, генетические связи и экологию сибирских представителей секции Cencmtrum рода Astragalus.
Как считает А.В. Положий (1964), относительная бедность видового состава, широкий голарктический ареал, а также морфологические признаки свидетельствуют о древности секции Cenantrum. Китайско-гималайские виды этой секции имеют облик описанного Н.Ф. Гончаровым (1944) исходного типа рода - мезофита с рыхло-кистевидными соцветиями и поникающими на длинных ножках крупными, перепончатыми или тонкокожистыми бобами. Но, по мнению А.В. Положий, исходная форма характеризовалась одногнёздными, а не двугнездными бобами, как считал Н.Ф. Гончаров.
Виды секции Cenantrum - мезофиты, мезопсихрофиты, отчасти психрофиты, связанные своим распространением с лесами, главным образом, горными, субальпийским и альпийским поясом и арктической областью. Древний высокогорный вид A. frigidus А.В. Положий (1964) относит к ледниковым или гляциальным реликтам. По её мнению, родиной A. frigidus является высокогорный пояс Алтае-Саян. Однако анатомические данные о наличии ксероморфных структур у этого достаточно влаголюбивого вида и обнаружение ископаемых остатков вида в плейстоценовых отложениях позволили Р.Я. Пленник (1976) предположить, что вид связан своим происхождением с холодным и сухим климатом криоксеротической стадии плейстоцена.
По мнению Н.Ф. Гончарова, А.Г. Борисовой (1946), A saralensis -наиболее близкий к A. umbellatus вид, являющийся исходным типом по отношению к этому чисто арктическому виду, что демонстрирует тесные генетические связи арктической флоры с высокогорной флорой Восточной Сибири.
Наиболее древний представитель, считает А.В. Положий (1964), А. secundus, типичный мезофит, обитает в сырых лесах и кустарниках. Автору на основе эколого-морфологического анализа представляется возможным считать, что A. membranaceus связан общим происхождением с A. secundus. Эти древние виды входили в состав третичной флоры Сибири. А. membranaceus сохранил некоторое габитуальное сходство с неморальными видами, хотя существенно изменился в суровых климатических условиях плейстоцена и голоцена, образовав несколько экологических форм, приспособленных к разным местообитаниям в пределах среднегорного пояса. Так, по мнению автора, A. propinquus - разновидность A. membranaceus.
Эндемик A. cericeocanus - довольно редкий вид, отмеченный на прибрежных песках восточной половины Байкала - между селом Турка и рекой Гремячая и в северной Бурятии - на о. Ярки в устьевой части реки Верхняя Ангара. Хорошо отличается густым опушением от близких степного A. mongholicus и лесостепных A. propinquus и A. membranaceus. A. cericeocanus - вид лесной зоны, является свидетелем степного прошлого Прибайкалья и относится к числу плейстоценовых степных реликтов, сохранившихся в немногих таежных местах Байкальской Сибири. Вероятно, возраст этих видов относительно молодой, постплейстоценовый, хотя общий предок рода, видимо, был широко распространен в степной и лесостепной полосах Байкальской Сибири в плиоцен-плейстоцене (Малышев, Пешкова, 1984).
Ареалы и поясно-зональные группы видов секции определяли, руководствуясь классификацией, разработанной Л.И. Малышевым и Г.А. Пешковой (1984) для флоры Сибири (Предбайкалье и Забайкалье).
Сибирские виды секции Cenantrum относятся к азиатскому типу ареала, равномерно распространены во всех поясно-зональных группах, кроме горной общепоясной и горно-степной: A. frigidus - евроазиатский, гипоарктомонтанный;
A. frigidus subsp. parviflorus - северовосточноазиатский, тундро-высокогорный; A. frigidus subsp. secundus - южносибирский и монгольский, светло-хвойный лесной;
A. membranaceus - маньчжуро-даурский, лесостепной; A. mongholicus - центрально-азиатский, степной; A. propinqms — южносибирский и монгольский, лесостепной; A. saralensis - южносибирский и монгольский, высокогорный (альпийский); A. sericeocanus - эндемик северо-восточной части побережья оз. Байкал, светло-хвойный лесной; A. umbellatus - американо-азиатский, тундро-высокогорный.
Итак, американо-евразийская секция Cenantrum подрода Phaca насчитывает на территории Сибири с учетом A. mongholicus 9 видов и подвидов из 15, произрастающих на территории бывшего СССР. Виды секции на территории Сибири преимущественно азиатского типа ареала, широко распространены в лесном, а также субальпийском и альпийском поясах, в арктической области.
Специфичность и изменчивость агликонового и гликозидного состава флавоноидов
Для выяснения таксоноспецифичности флавоноидного состава видов секции Cenantnim нами были проведены сравнительные исследования ещё 7 сибирских видов рода из 3 подродов и 6 секций: Подрод Phaca Секция Melilotopsis A. tenuis. Подрод Trimeniaeus Секция Heterodontus A. davuricus. Подрод Cercidothrix Секция Euodmus A. uliginosus; Секция Onobrychium A. adsurgens, A. austrosibiricus; Секция Trachycercis A. scaberrimus\ Секция Xiphidium A. suffruticosus. Флавоноидные профили представлены на рис. 3. В секции Onobrychium изучены A. adsurgens (из Восточного Забайкалья) и A. austrosibiricus (две выборки из ценопопуляций Горного Алтая). Гликозидные профили изученных представителей секции имеют существенные различия, что говорит о четкой дифференциации путей биосинтеза флавоноидов в биохимической эволюции этих видов. Ранее Р.Б. Кадыровой (1989) были изучены соотношения агликонов флавоноидов в эктрактах листьев этих видов и спектры энзимограмм эстеразы и малатдегидрогиназы. На основе этих данных и полученных нами результатов можно подтвердить самостоятельность этих видов (Сиднева, 2004 г). Представленные «флавоноидные профили» совершенно различны и поэтому могут служить биохимической характеристикой каждого вида. Таким образом, нами показано, что гликозиды флавоноидов могут являться признаком-маркером на уровне вида. В 8 видах секции Cenantrum изучали агликоновый и гликозидный состав флавоноидов.
Различными авторами приводятся противоречивые сведения о составе агликоновых и гликозидных форм флавоноидов комплекса видов А. membranaceus, A. mongholicus и A. propinquus. Д. Дунгэрдорж (1978) для А. membranaceus приводит только агликоновый состав: кверцетин, кемпферол, рамноцитрин и куматакенин, присутствующий в растении в свободном виде. Для A. mongholicus и A. propinquus этим автором указаны одинаковые агликоны - кверцетин, изорамнетин и рамноцитрин. Из A. mongholicus им выделены гликозиды - два монозида изорамнетина, а из A. propinquus - моно-и биозид изорамнетина, монозид рамноцитрина, биозид кверцетина. А.В. Киселёва и др. (1991) указывают для A. propinquus агликоны кверцетин, изорамнетин и кемпферол, гликозиды - моно- и биозид изорамнетина, монозиды кемпферола и апигенина, биозид кверцетина. Из близких A. frigidus и A frigidus subsp. secundus ранее был изучен только A. frigidus. В нем идентифицированы агликоны: кверцетин и кемпферол (Макбуль, 1980; Киселёва и др., 1991), куматокенин (Макбуль, 1980), три гликозида кверцетина, один - кемпферола (Макбуль, 1980; Киселёва и др., 1991), по одному гликозиду хризериола и куматокенина (Макбуль, 1980).
Методом колоночной хроматографии выделили агликоны из надземной части A. membranaceus. Извлеченную диэтиловым эфиром из гидролизата фракцию разделили на колонках с силикагелем и полиамидом. Нам удалось выделить 4 агликона, которые обозначили как AM-I, АМ-И, АМ-Ш и AM-IV (табл. 7). Положение фенольных гидроксилов устанавливали по данным УФ-спектроскопии с применением ионизирующих и комплексообразующих реагентов. Соотношение интенсивности I и II полос поглощения в УФ-спектрах агликонов является характерным для флавонолов. Батохромный сдвиг максимума I полосы на 55 - 60 нм под воздействием хлористого цирконила во всех веществах указывает на оксигруппу в 3 и 5 положениях.
