Введение к работе
Актуальность темы: Для разработки научных основ сохранения и рационального использования растительных ресурсов, а также подхода к управлению морфогенезом необходимо изучение нормального протекания репродуктивных процессов и .выявление закономерностей половой и бесполой репродукции. Особую актуальность приобретает изучение эмбриологических осноз семенной репродукции у редких' и исчезающее видов растении, к ним относятся и представители рода Paeonta, являющиеся ценными декоративными и лекарственными растениями, девять видов которого занесены в Красную Книгу. Монотипный порядок Pasoniales, стоящий в основании филогенетического древа, интересен с точки зрения систематики и общей теории эмбриогенеза
В настоящее.время накоплен большой материал по биологии, морфологии, а также по отдельным аспектам эмбриологии пионовых (Sax. 1932; Dark, 1936; Stern, 1946; Яковлев, 1S51, 1958; Яковлев и Иоффе, 1S57, 1960, 1965; Cave et al., 1961; Walters, 1962; Carniel, 1967; Жгенти, 1974, 1978; Батыгина, Бутенко, 1981; Ly Thi Ba, 1981).
Видам рода Равопіа присущ уникальный для покрытосеменных тип эмбриогенеза, который был впервые, описан Ы. С. Яковлевым (1951). Автором было показано, что при этом типе эмбриогенеза деление ядра зиготы не сопровождается заложением клеточных перегородок, в результате чего образуется ценоцитная, а впоследствии ценоцитно-клеточная структура, на которой формируется множество зародышей, но лишь один из них раззивается до зрелого полового зародыша в семени. Согласно концепции Т. Е Ба-тыгиной о системах размножения у цветковых растений (Batygina, 1989, .1990), в зрелом семени пиона формируется соматический, а не половой зародыш. Его 'образование схода о дифференциацией эмбриоида на эмбриональном клеточном комплексе в каллусной культуре in vitro. В связи с этим зародыш пиона является прекрасной моделью для исследования соматического эмбриогенеза in situ, in vivo и in vitro.
Однако в настоящее время практически отсутствуют . детальные данные о генезисе соматического зародыша в семени пиона, дискуссионными остаются вопросы все ли клетки прозмбрио пиона могут быть инициальными клетками эмбриоидов, чем характеризу-
- 4 -ются эти клетки, почему в конечном итоге в семени остается только один зародыш, сходно ли развитие соматических зародышей в условиях in vivo и in vitro.
Дель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явился сравнительный цитоэмбриологический анализ развития соматического зародыша в семени пиона іл vivo и в культуре in vitro. Исходя из этого были определены следующие задачи:
-
Детально изучить развитие зародыша в семени пиона in vivo.
-
Оптимзировать питательную січ'ДУ для получения морфогенеза в культуре in vitro и идентифицировать пути морфогенеза
-
Изучить процесс формирования соматических зародышей (эмбриоидов) в культуре in vitro.
-
Сравнить процесс формирования соматического зародыша, полученного in vitro, с зародышем в семени пиона
Научная новизна Идентифицированы клетки эпидермиса в апикальной части ценоцитно-клеточного проэмбрио, дащие пачало эмбриоидам. Показано, что развитие эмбриоидов в семени пиона in vivo идет в соответствии с эмбриогенезом Asterad-типа Яйлаеа-вариации. Выявлены некоторые морфофизиологические корреляции между накоплением органических веществ (белков, углеводов) и стадиями развития зародыша, эндосперма и окружающих структур при формировании семени пиона
В культуре in vitro получен прямой соматический эмбриогенез из поверхностных слоев гипокотиля и семядолей изолированных зародышей из семени Язеоліа апояаіа и проростков, полученных в культуре in vitro. Определено сходство и различие при формировании эмбриоидов в семени пиона in vivo и в культуре in vitro, что ыокет внести вклад в дальнейшую разработку классификации систем репродукции растений.
Теоретическое и практическое значение работы. Проведанные исследования еще раз подтвердили уникальность развития зародыша у пионоз, идущего в два этапа, с переходом с полового на бесполый путь репродукции. В этой связи особый интерес представляют полученные впервые детальные данные о процессе заложения эмбриоидов на ценоцитно-клеточном предзародыше в семени пиона Сравнительное изучение зародышей пиона in vivo и in vitro (в динамике) расширяет наши знания о развитии соматического зародыша в естественных условиях и в культуре in
- 5 -vitro, что интересно для понимания различных аспектов эмбриогенеза пиона, а также теоретических основ соматического эмбриогенеза (эмбриоидогенеза).
В результате дальнейших работ с культурой ткани на базе наших исследований по соматическому эмбриогенезу пиона in vitro есть реальная возможность разработать технологию масс-клепального размножения этого ценного лекарственного и декоративного растения, а также получить лекарственные препараты пиона.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на IV Конференции молодых ботаников С. -Петербурга (1992 г.), на XII Международном конгрессе по половому размножению растений (Columbus, Ohio, USA, 1992 г.), на молодежной конференции Сотачиков стран СНГ "Актуальные проблемы ботаники" в Апатитах (1993 г.), на III съезде Всероссийского общества физиологов растений в С.-Петербурге (1993 г.). на II Международной конференции "Биология'культивируемых клеток растений и биотехнология" в Алма-Ате (1993 г.) и на научных семинарах отдела эмбриологии и репродуктивной биологии БИЕ
Публикации. Ш теме диссертации опубликовано б печатных работ.
Струїстура и объем работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов, заключения и с :иска цитированной литературы; включает 2 таблицы, 103 иллюстрации. Список литературы содержит 196 библиографических ссылок.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ '
Объектами исследования были два вида пиона - Paeonta anoimla U и Paeonia lacti flora Pall.. растущие в саду Санкт-Петербургского Ботанического института им. В. X Комарова РАЕ Отсчет стадий развития зародыша производили с момента искусственного опыления цветка. Семязачаток и семена изучаемых видов фиксировали темпорально ежедневно до опыления и в течение 45-50 суток со дня опьшения в мае - августе 1991 - 1993 года Экспланты и кусочки каллуса при работе с культурой ткани также фиксировали темпорально через каждые пять дней с момента их высадки на питательную среду. В качестве фиксирующей жид-
- б -
кости использовали смесь ФМ (7:7: 100) и смесь Карнуа (3:6:1).
Обработка материала производилась по общепринятой цитоэм-бриологической методике (Прозина, 1970). Срезы для постоянных препаратов приготовлялись толщиной 12-15 мкм с помощью ротационного микротома. Для окраски постоянных препаратов использовали фуксин-сернистую кислоту по (Еёльгену и сафранин по Кар-тису; для подкраски гематоксилин по Эрлиху. лихт-грш и апциа-новый синий. Окраску проционовыми красителями производили для одновременного обнаружения белков (ярко-синий RS) и нерастворимых углеводов (ярко-красный 2BS) 'Иванов и Литинекая, 1967). Гистохимическое определение содержания полисахаридов клеточных оболочек и вапасног крахмала осуществлялось ШИК-реакцией (Дженсен, 1965).
Материал для исследований с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) был зафиксирован в 2,57. глюгаральдэ-гиде, приготовленном на фосфатном буфере с 27. сахарозы, рН»7.0. обезвожен и переведен в иаоамиловый эфир уксусной кислота Затем материал высушивали методом критической'точки, на него напыляли волото и просматривали на сканирующем электронном микроскопе JSM-35C марки JOEL.
Для работы о ' культурой ткани использовали только вид Paaonia anomala. Эксплантами служили следующие органы: лист, стебель, тычиночная нить, эндосперм и зародыш (эмбриоид) из семени пиона на разных стадиях развития (23-50 дней после опыления). Для стерилизации листьев, стеблей и тычиночных нитей применяли 10% раствор гипохлорита натрия NaOCl; перед вычленением зародышей плоды, содержащие семена, стерилизовали путем опускания в этиловый спирт и легкого обжига на спиртовім.
В качестве основной среды применяли модифицированную питательную среду ыурасиге и Скуга (ИЗ) (Murashige & Skoog, 1S62) . Для улучшения инициации каллусообразования концентрацию макросолей в среде уменьшали вдвое (ДО/2). В качестве регуляторов роста использовали ауксины: индолилуксусиую кислоту (ЛУК), 1-нафтилуксусную кислоту (НУК) и 2,4-дихлорфе-ноксиуксусную кислоту (2,4-Д) и цитокинины: кинетин и 6-бензи-ламинопурин (ВАЛ) в концентрации (0.1-2.0 мг/л) в сочетании друг о другом, либо отдельно. Каллусы поддерживались регулярным ежемесячным пересаживанинем на свежую среду.