Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Эмбриогенез хвойных растений in vivo и создание нового растительного организма in vitro 10
1.1. Процессы формирования гаметофита и спорофита хвойных растений in vivo 10
1.1.1. Микроспорогенез у хвойных растений 10
1.1.2. Зиготический эмбриогенез хвойных растений на примере рода Larix 13
1.2. Регуляторы роста растений 17
1.2.1. Фитогормоны: история открытия, механизмы действия и физиологическая роль 17
1.2.2. Действие регуляторов роста в культуре клеток и тканей древесных организмов 23
1.3. Микроклональное размножение растений 26
1.3.1. Соматический эмбриогенез хвойных растений 27
1.3.2. Гаплоидный эмбриогенез покрытосеменных и голосеменных растений 35
ГЛАВА 2. Характеристика условий произрастания объектов исследования, материалы и методы 43
2.1 Объекты исследования и места их расположения 43
2.1.1. Общая характеристика лиственницы сибирской 43
2.1.2.Характеристика исследуемых деревьев 49
2.1.3 Характеристика условий произрастания объектов исследования 50
2.2. Методы микроклонального размножения in vitro 52
2.2.1. Материалы исследований 52
2.2.2. Стерилизация помещений, посуды иэксплантов 54
2.2.3. Получение соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей лиственницы сибирской 54
2.2.4. Получение соматического эмбриогенеза из сегментов вегетативных побегов лиственницы сибирской 56
2.2.5. Получения андроклинных культур лиственницы сибирской in vitro .57
2.3. Получение и обработка данных 59
2.3.1. Цитологический анализ эмбриональных процессов 59
2.3.2. Морфометрический анализ 60
2.3.3. Статистическая обработка данных 61
ГЛАВА 3. Особенности зиготического и соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской 62
3.1. Эмбриогенез лиственницы сибирской in vivo 62
3.2. Соматический эмбриогенез из зиготических зародышей лиственницы сибирской 65
3.2.1. Влияние стадии развития экспланта на индукцию соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской 65
3.2.2. Пролиферация эмбриогенных культур лиственницы сибирской 68
3.2.3. Влияние состава питательной среды на формирование ЭСМи соматических зародышей лиственницы сибирской 70
3.2.4. Влияние донорного растения на протекание соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской 72
3.2.5. Цитоэмбриологическая характеристика протекания соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской 74
3.2.6. Созревание соматических зародышей и получение растений-регенерантов 80
3.2. Соматический эмбриогенез из сегментов вегетативных побегов лиственницы сибирской 84
3.3.1. Влияние состава питательных сред на индукцию эмбрионально-суспензорной массы из сегментов вегетативных побегов 84
3.3.2. Влияние растения-донора на формирование эмбриональной массы из сегментов вегетативных побегов 85
3.3.3. Цитоэмбриологическая характеристика эмбрионально-суспензорной массы полученной из сегментов вегетативных побегов 90
ГЛАВА 4. Андроклинные культуры лиственницы сибирской 93
4.1. Влияние стадии развития эксплантов на индукцию андроклинных культур 93
4.2. Влияние состава питательных сред и условий культивирования на андроклинныию лиственницы сибирской 96
4.3. Влияние растения-донора на формирование андроклинных культур лиственницы сибирской 102
4.4. Цитологическая характеристика андроклинии у лиственницы сибирской 106
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов 116
5.1. Предпосылки появления бесполого размножения у голосеменных растений 116
5.2. Формирование морфогенных каллусов и развитие зародышей лиственницы сибирской de novo 118
5.3. Роль компонентов питательной среды в микроклональном размножении лиственницы сибирской 123
5.4. Влияние растения-донора на протекание соматического эмбриогенеза и андроклинии 128
Заключение 132
Выводы 136
Список литературы 138
Приложения 159
- Зиготический эмбриогенез хвойных растений на примере рода Larix
- Характеристика условий произрастания объектов исследования
- Влияние стадии развития экспланта на индукцию соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской
- Влияние состава питательных сред и условий культивирования на андроклинныию лиственницы сибирской
Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Высшие растения обладают высоким потенциалом тотипотентности (многовариантности развития) клеток. Фактически, каждая дифференцированная клетка растения, имеющая ядро, способна переходить в эмбриогенное состояние и продуцировать новое растение. Это свойство наиболее ярко проявляется при культивировании клеток и тканей растений в условиях in vitro.
Тотипотентность клеток лежит в основе таких уникальных явлений в биотехнологии микроклонального размножения растений как соматический эмбриогенез и андроклиния, приводящих к возникновению нового растительного организма из соматической или спорогенной клетки в условиях культуры in vitro. Эти феномены открывают большие перспективы в познании процесса клеточной дифференцировки и реализации морфогенетического потенциала растительного организма. Применение подобных инновационных технологий, в сочетании с криоконсервацией и различными селекционными программами, дает возможность для получения, раннего отбора и испытания ценных генотипов, их быстрого распространения, что способствует массовому получению улучшенных высокопродуктивных клонов и чистых линий хвойных растений для клонального лесоводства [Hogberg, et al., 1998; Klimaszewska, Суг, 2002; Campbell et al., 2003].
Исследования по соматическому эмбриогенезу и андроклинии в культуре in vitro проводятся, как правило, на покрытосеменных растениях [Батыгина, 1978; 1994; 1999; Круглова, Горбунова, 1997; Batygina, 2005 и др.]. У хвойных растений семейства Pinaceae изучение соматического эмбриогенеза интенсивно проводится в течение последних двадцати лет за рубежом [Lelu et al., 1994; Klimaszewska, Суг, 2002; Stasolla, Yeung, 2003], однако, несмотря на активные исследования в данной области, регенерация растений путем соматического эмбриогенеза все еще остается проблематичной для ряда видов. Данные по андроклинии у этого семейства растений до сих пор отсутствуют.
Исследования соматического эмбриогенеза у сибирских видов хвойных растений, в том числе и у лиственниц, до сих пор не проводились. Между тем, лиственница сибирская является основным лесообразователем хвойных лесов Сибири. Однако во многих случаях она имеет низкое качество семян и подвержена сильному воздействию биогенных факторов, негативно сказывающихся на росте и семеношении данного вида, и практически полностью исключающих возможность целевого использования его лесосеменных участков [Исаев и др., 2001]. Применение и разработка современных биотехнологий, и особенно, таких как соматический и микроспориальный эмбриогенез, позволит выращивать быстрорастущие, высокопродуктивные, устойчивые к абиотическому и биотическому стрессу особи лиственницы сибирской.
Цели и задачи исследования. Цель работы - выявление эмбриолого-физиологических закономерностей соматического эмбриогенеза и андроклинии у лиственницы сибирской {Larix sibirica Ledeb.), в том числе изучение процессов трансформации соматических и спорогенных клеток данного вида в эмбриональные структуры в контролируемых условиях культуры in vitro.
Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:
- провести цитоэмбриологические исследования зиготического эмбриогенеза у
лиственницы сибирской in vivo;
разработать технологию получения эмбрионально-суспензорной массы (ЭСМ), способной пролиферировать и продуцировать соматические зародыши и растения-регенеранты из эксплантов лиственницы сибирской различного генетического и онтогенетического происхождения;
разработать технологию получения андроклинных культур лиственницы сибирской;
выявить цитоэмбриологические сходства и различия в развитии половых (зиготических) зародышей лиственницы сибирской, и зародышей возникающих в культуре in vitro асексуально, из соматических и спорогенных клеток.
Научная новизна исследования заключается в том, что впервые для лиственницы сибирской различного генетического происхождения были разработаны современные методы микроклонального размножения, такие как соматический эмбриогенез и андроклиния в культуре in vitro. Выявлены основные факторы, влияющие на процессы микроклонального размножения лиственницы сибирской. Изучены сходства и различия эмбриональных процессов данного вида in vivo и в культуре in vitro.
Теоретическая и практическая ценность полученных результатов. Полученные результаты по соматическому эмбриогенезу и андроклинии у лиственницы сибирской вносят вклад в познание клеточной дедифференцировки: способности диплоидных и гаплоидных клеток данного вида переходить в эмбриогенное состояние и формировать растения de novo. Настоящие исследования интересны еще и тем, что данные по микроспориальному эмбриогенезу в культуре in vitro у хвойных растений отсутствуют.
На основании проведенных исследований созданы коллекции эмбриогенных культур, полученных из изолированных зиготических зародышей и микроспор лиственницы сибирской. Разработанные в ходе исследований методы соматического эмбриогенеза могут быть использованы для массового тиражирования ценных генотипов лиственницы сибирской, обладающих повышенным репродуктивным потенциалом, устойчивых к абиотическому и биотическому стрессу, и в частности к поражению лиственничной почковой галлицей.
Положения, выдвигаемые на защиту:
Пролиферация эмбрионально-суспензорной массы и формирование зародышей de novo в культуре in vitro зависит от растения-донора, стадии развития экспланта и гормонального состава питательной среды.
Соматический эмбриогенез - асексуальный способ размножения лиственницы сибирской, повторяет основные этапы развития половых
зародышей данного вида и приводит к формированию нового растительного организма de novo.
3. Использование ауксина при индукции андроклинии in vitro у лиственницы сибирской вызывает образование эмбриоидов микроспориального происхождения, имеющих сходство с зиготическими зародышами покрытосеменных растений.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на X Всероссийской студенческой конференции «Экология и проблемы окружающей среды» (Красноярск, 2003г.), на V Съезде общества физиологов растений России (Пенза, 2003г.), на Всероссийской конференции «Структурно-функциональная организация и динамика лесов» (Красноярск, 2004г.), на Всероссийской конференции ВОГиС III «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004г.), на Международном симпозиуме IUFRO «Larix 2004» (Киото, 2004г.), на Конференции молодых ученых «Studies on components of Siberian forest ecosystem» (Красноярск, 2005г.), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва), на Конференции молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2005г.), на I Международной школе-конференции для молодых учёных «Эмбриология и биотехнология» (Санкт-Петербург, 2005 г.), на Четвертой российской конференции «Чтения памяти Л.М. Черепнина» (Красноярск, 2006г.), на XV Конгрессе Союза Европейского общества по биологии растений (Лион, 2006г.), на IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006г.), на X Междунар. научной школе-конференции «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2006г.).
Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 23 печатных работах; три из них - в реферируемых научных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация содержит введение, 5 глав, заключение, выводы, список литературы и шесть приложений. Библиографический список включает 212 источников, в том числе 152 на
иностранных языках. Текст иллюстрирован 47 рисунками и включает 7 таблиц. Общий объем диссертации составляет 165 страниц.
Личный вклад соискателя. Представленные в диссертации экспериментальные данные получены непосредственно автором.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н., профессору Третьяковой Ираиде Николаевне, а также к.б.н. Баранникову Юрию Николаевичу за всестороннюю помощь во время работы над диссертацией и ценные советы. Автор благодарит члена-корр. РАН, д.б.н., профессора Татьяну Борисовну Батыгину (Ботанический институт РАН) и д.б.н. Наталью Николаевну Круглову (Институт биологии УНЦ РАН) за консультации в области андроклинии in vitro, а также Dr. Marie-Anne Lelu-Walter (INRA) и Dr. Claudio Stasolla (University of Manitoba) за рекомендации в области соматического эмбриогенеза хвойных растений. Отдельная благодарность Dr. Herve Van De Syp (INRA) за помощь в осуществлении стажировки в INRA.
Благодарю к.б.н. В.А. Осколкова и А.П. Барченкова за предоставление семенного материала лиственницы сибирской.
Зиготический эмбриогенез хвойных растений на примере рода Larix
Основным достижением семенных растений является обеспечение зародыша определенной защитой, помогающей ему переживать неблагоприятные условия окружающей среды. Такую защиту у голосеменных растений осуществляет мегагаметофит - гаплоидное образование, которое по своим функциям является аналогом эндосперма покрытосеменных.
Женский гаметофит хвойных, как и прочих голосеменных, развивается внутри мегаспоры, которая остается заключенной внутри мегаспорангия. Мегаспорангий (или нуцеллус) окружен интегументом. Таким образом, основной план строения семязачатка хвойных сходен с остальными семенными растениями: он состоит из двух основных частей - нуцеллуса (мегаспорангия) и интегумента [Тренин, 1986].
Протекание зиготического эмбриогенеза у хвойных растений неоднократно описывалось в литературе [Schopf, 1943; Singh, 1978; Тренин, 1986; Третьякова, 1990; Misra, 1994 и др.]. Наиболее полное и подробное описание эмбриональных процессов протекающих в семени хвойных после оплодотворения, было сделано Сингом и Шопфом [Schopf, 1943; Singh, 1978].
Эмбриологические исследования Шопфа в основном были посвящены роду Larix, ему удалось провести детальное изучение эмбриогенеза лиственницы на примере Larix decidua [Schopf, 1943]. В развитии зародыша лиственницы Шопф выделил про-, мета-, ана- и телостадии. Однако термины, предложенные этим автором, не получили широкого распространения среди эмбриологов и, поэтому, будет удобнее придерживаться общепринятой классификации, предложенной Сингом [Singh, 1978].
По особенностям эмбриогенеза лиственница относится к типу хвойных {Conifer тип), разновидности сосновых. Зиготический эмбриогенез у лиственницы, как и у других хвойных, после оплодотворения зиготы может быть разделен на три основные фазы [Singh, 1978]. Проэмбриогенез - включает все стадии до удлинения суспензора, ранний эмбриогенез - включает все стадии после удлинения суспензора и до заложения меристемы корня, поздний эмбриогенез - включает заложение меристем корня и побега, и все последующие события до формирования зрелого зародыша с хорошо развитыми семядолями [Singh, 1978; Третьякова, 1990].
Проэмбриогенез. Процесс проэмбриогнеза протекает в пределах архегония. После оплодотворения ядро яйцеклетки подвергается митотическому делению, в результате чего формируются четыре свободных ядра. Эти ядра опускаются в основание архегония и располагаются в одной плоскости. Их дальнейшее синхронное вертикальное деление приводит к формированию двух слоев (или этажей), каждый из которых состоит из 4-х ядер. Важно отметить, что эти ядра не разделены клеточными перегородками, что является одним из главных отличий начальных этапов эмбриогенеза голосеменных растений. Эти два слоя были названы «первичным верхним слоем» и «первичным эмбриональным слоем». Далее происходит формирование вторичного веретена деления, и между ядрами возникают клеточные перегородки, за исключением одной стороны верхнего ряда [Круклис, 1978]. Каждый из этих слоев еще раз делится и продуцирует четыре этажа: два эмбриональных, суспензорный и верхний. Одной из отличительных особенностей всех хвойных является их замечательно развитая подвесочная (суспензорная) система. Она значительно более развита, чем у всех низших голосеменных и папоротников. Подвески не только проталкивают зародышевые клетки в глубь ткани гаметофита и служат гаусториальным органом для последних, но являются, вероятно, секреторными органами, разрушающими посредством ферментов клетки гаметофита. В процессе дальнейшего развития два последних этажа дегенерируют. Суспензорный слой в дальнейшем не будет участвовать в увеличении суспензора, и поэтому он был назван нефункционирующим суспензором. Клетки первичного суспензора дают начало группе меристематических клеток, так называемому «розеточному зародышу», который у лиственницы никогда не превращается в настоящий зародыш [Johansen, 1950; Von Aderkas et al., 1991]. Формирование подобных кластеров клеток было так же обнаружено на клетках нефункционирующего суспензора у различных представителей семейства Pinaceae, но никогда не отмечалось в роде Larix.
У большинства представителей семейства Pinaceae клетки, которые функционируют в качестве суспензора, берут свое начало от эмбрионального слоя, и слагают первый ряд эмбрионального суспензора (первичный суспензор). Увеличение числа клеток эмбрионального суспензора вызывает продвижение зародыша в коррозийную полость, что служит сигналом окончания фазы проэмбриогенеза и переходом к раннему эмбриогенезу [Von Aderkas et al., 1991].
Ранний эмбриогенез. В процессе раннего эмбриогенеза происходят деления в эмбриональном слое, в результате чего формируются клетки одного типа. У Larix одна из этих клеток, обычно имеющая большую степень вакуолизации по сравнению с остальными, становиться доминирующей, и опережает в росте другие клетки [Круклис, 1978; Тренин, 1986]. В результате происходит расщепление полярных единиц и формируется несколько зародышей вместо одного. Это явление, характерное для всех хвойных растений, было названо полиэмбрионией [Singh, 1978]. Полиэмбриония - это процесс формирования множества зародышей в семени in vivo. Гупта и Гроб описали два типа полиэмбрион ии: простую полиэмбрионию, которая происходит в результате оплодотворения нескольких яйцеклеток в женском гаметофите, и кливажную полиэмбрионию - процесс посредством которого один зародыш расщепляется и формирует несколько генетически идентичных эмбрио [Gupta, Grob, 1995]. В ходе полиэмбрионии происходит конкуренция между зародышами, в результате чего выживает только наиболее развитый зародыш, который оказался в наилучшем физиологическом состоянии и наиболее благоприятных условиях. Остальные зародыши, как правило, дегенерируют, и лишь в редких случаях отмечается одновременное развитие двух зародышей в семени лиственницы [Круклис, 1978]. Тип полиэмбрионии, характерный для лиственниц, по терминологии Шопфа называется замедленной кливажнои полиэмбрионией, т.к. он качественно сходен с кливажнои полиэмбрионией, но проявляется на более поздней стадии развития [Тренин, 1986]. По данным М.В. Круклис, для лиственниц Забайкалья характерна полиэмбриония с доминированием отдельных групп клеток в апикальной или периферической части зародыша [Круклис, 1978].
Характеристика условий произрастания объектов исследования
В настоящее время для выделения и культивирования микроспор применяют в основном два метода: механическое выделение микроспор (гомогенизация, фракционирование) и самопроизвольный выход микроспор при культивировании пыльников на жидких питательных средах. При этом отмечается, что самопроизвольный выход микроспор в питательную среду является предпочтительным из-за более интенсивного формирования андроклинного каллуса [Анапияев, 2001].
Микроспоры, способные к переходу на спорофитный путь развития и дальнейшему формированию андроклинного каллуса и/или растений-регенерантов, были названы морфогенными. Характеристика морфогенной микроспоры как инициальной клетки - важный момент в понимании путей морфогенеза и способов формирования андроклинных структур. Отмечается, что морфогенная микроспора покрытосеменных должна быть схожа по структуре с яйцеклеткой, клетками зародышевого мешка, нуцеллуса и интегумента, образующими адвентивные зародыши в случае апомиксиса [Круглова,2001].
Согласно данным Кругл овой и Зайнутдиновой [2001] высокая морфогенетическая лабильность андроклинного каллуса пшеницы обусловлена наличием в этой структуре уже начиная с самых ранних стадий развития разнообразных клеток с разной способностью к морфогенезу in vitro. Благодаря наличию разветвленной сосудистой системы в каллусе создаются самые разные трофические и гормональные ситуации и клетки могут быть индуцированы к различным путям морфогенеза in vitro.
Уже несколько десятилетий предпринимаются попытки изучения генетической регуляции андроклинии у покрытосеменных растений. Исследования в данной области базируются на двух основных подходах. Первый из подходов основывается на выделении в процессе формирования эмбриоидов микроспориального или пыльцевого происхождения продуктов генов, участвующих в зиготическом эмбриогенезе. Использование данной методики позволило выделить один из первых маркеров андроклинии у Brassica napus - 12S гликопротеин. Этот белок является важным молекулярным маркером, поскольку он обнаруживается как у зиготических, так и у андроклинных зародышей данного вида после перехода к глобулярной стадии развития, и, таким образом, он сигнализирует, что незиготический зародыш перешел к накоплению белков, характерных для зародышей зиготических [Crouch, 1982].
Второй подход основан на сравнении экспрессии генов во время микрогаметогенеза и андроклинии. Используя эти два метода, ученым удалось обнаружить еще около 14-ти белков, служащих маркерами формирования андроклинных зародышей [Reynolds, 1997].
В целом, к настоящему времени накоплен достаточно обширный фактический материал по изучению различных аспектов андроклинии у покрытосеменных растений. Тем не менее, многие авторы отмечают, что необходима разработка методологических основ изучения этого интереснейшего феномена с привлечением эмбриологической информации, поскольку в сфере внимания эмбриологии находятся проблемы индивидуального развития растительного организма, познания формообразовательных процессов в процессе эмбриогенеза как in vivo, так и in vitro [Батыгина, 1987; Горбунова, Круглова, 1988; Горбунова и др., 1992, 1993; Круглова, 2001]. Возможность управления различными этапами развития спорогенных клеток in vitro напрямую зависит от знаний морфогенетических процессов, которые протекают в них in vivo [Круглова, 2001].
Андроклиния у древесных растений. Исследования микроспориального и пыльцевого эмбриогенеза у древесных видов растений долгое время оставались безуспешными, поскольку развитие андроклинных культур останавливалось на стадии формирования каллусов [Winton, Stettler, 1974]. Наиболее пригодными для проведения исследований в области андроклинии у древесных растений, за исключением гевеи (род Heved) и конского каштана (род Aesculus), оказались представители рода Populus. Поэтому основные достижения в области андроклинии были сделаны у представителей этого рода [Wu, Xu, 1984; Но, Raj, 1985; Baldursson et al., 1993; Deutsch et al., 2004].
В последние годы германским ученым удалось разработать технологию получения андроклинных культур и гаплоидных растений-регенерантов для ряда видов рода Populus, таких как P. nigra L. и P. balsamifera L., а также гибридов - P. tremula х tremuloides [Deutsch et al., 2004]. В этих экспериментах для получения эмбриоидов использовались изолированные пыльцевые зерна, которые культивировались на жидкой среде К99 с цитокинином и ауксином. Для успешного получения растений-регенерантов использовалась среда WPM, также содержащая ауксины и цитокинины. Помимо этого было обнаружено, что переход на спорофитный путь развития происходил как при стрессовой обработке низкими положительными температурами, так и без нее.
Однако, к сожалению, в этой работе уделено очень мало внимания этапам формирования эмбриоидов из пыльцевых зерен. Исходя из результатов, приведенных авторами, можно лишь сделать вывод, что они являлись результатом непрямой андроклинии, т.е. формировались в андроклинном каллусе [Deutsch et al., 2004].
Влияние стадии развития экспланта на индукцию соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской
ЭСМ, полученная из зиготических зародышей лиственницы сибирской на стадии позднего эмбриогенеза, могла длительный период поддерживаться на пролиферационной среде MSGn без потери пролиферационной активности. На рис. 11. представлено изменение в интенсивности прироста ЭСМ, полученной из зиготических зародышей на стадии инициации семядолей (стадия III): в течение первых пяти месяцев культивирования на пролиферационной среде, происходил интенсивный прирост ЭСМ, в этот период объем эксплантов в среднем составил 743,0 ± 40,6 мм . Небольшой спад в интенсивности прироста ЭСМ, наблюдался на 5-7 мес. культивирования. На 10 мес. культивирования прирост ЭСМ практически приостанавливался. В этот период средний объем ЭСМ, составил 1070,0 ± 58,0 мм (т = 3; п=10). Необходимо отметить, что для поддержания интенсивности прироста ЭСМ требовались регулярные пересадки на свежую среду того же состава через каждые 10-14 сут.
Таким образом, пролиферирующая ЭСМ лиственницы сибирской может находиться в культуре 1-2 года и, при этом продуцировать соматические зародыши, которые при необходимости можно использовать для манипуляций по созреванию и выращиванию растений-регенерантов.
В экспериментах по соматическому эмбриогенезу из зиготических зародышей лиственницы сибирской использовались близкие по составу базальные среды MS и MSG, различающиеся концентрацией макросолей (см. приложение 1). Помимо этого состав сред варьировал по наличию L-глютамина (таблица 1). Проведенные исследования показали, что введение L-глютамина в среду значительно стимулировало образование ЭСМ и дальнейшее развитие соматических зародышей. На средах MS и MSG без L-глютамина формирование ЭСМ из зиготических зародышей не происходило. В этих случаях формировался неэмбриогенный каллус темно коричневого цвета, обладавший низкой пролиферационной активностью. Спустя 2-3 мес. культивирования такой каллус деградировал и погибал. В случае культивирования зиготических зародышей на среде MSG содержащей L-глютамин, происходило нормальное развитие соматических зародышей, их строение было аналогичным строению зиготических зародышей данного вида (см. ниже). Культивирование зиготических зародышей на среде MS с L-глютамином, приводило к формированию аномально развитых соматических зародышей. Их размеры значительно превышали размеры как зиготических, так и соматических зародышей лиственницы сибирской. Такие зародыши имели массивный суспензор, достигающий 230,0 ±3,6 мкм в ширину и крупное тело зародыша 470,0 ± 12,5 мкм (т = 2; n = 8) (рис. 12). Кроме того, на этой среде у 2,5 % эксплантов, на поверхности каллуса было отмечено формирование структур, напоминающих почки адвентивного типа (рис. 13). Вероятно, такой каллус справедливо называть органогенным. Помимо стадии развития зиготических зародышей и состава питательной среды, на формирование эмбриональной массы лиственницы сибирской оказывал влияние и генотип растения-донора. Так, из тридцати исследованных деревьев из различных мест обитания 13,3 % особей (Дб„ь Дбпз, Дб7 Дбіг) были не способны формировать каллус или ЭСМ из зиготических зародышей (среда MSG). Большая часть деревьев (66,7 %) наряду с ЭСМ формировала каллус неэмбриогенного типа (таблица 4). Лишь 20 % из исследуемых генотипов (ДНП1, ДнпЗ, Днпу, Днп4) были способны формировать только ЭСМ. Необходимо также отметить, что при переходе ЭСМ к пролиферации у 20 % особей число эксплантов переходящих от стадии инициации ЭСМ к пролиферации снижалось, а ЭСМ у 6,7 % особей была не способна к пролиферации (таблица 4). Наиболее интенсивное формирование ЭСМ из зародышей находящихся на стадии заложения семядолей (группа III) было отмечено у дерева ДП2, а наименьшее у дерева Унп3. Различная способность формирования ЭСМ была обнаружена у зиготических зародышей лиственницы сибирской на всех стадиях развития. Таким образом, очевидно, что не все генотипы лиственницы сибирской способны к соматическому эмбриогенезу. Выявление генотипов лиственницы сибирской способных к формированию ЭСМ и соматических зародышей чрезвычайно важно в экспериментах по соматическому эмбриогенезу исследуемого вида.
Влияние состава питательных сред и условий культивирования на андроклинныию лиственницы сибирской
Формирование ЭСМ и образование соматических зародышей у лиственницы сибирской укладывается в схему, предложенную Арнольд с соавторами для ели [Von Arnold et al., 2002]. Полученные соматические зародыши у лиственницы сибирской имели ярко-выраженную полярную структуру и морфологически были идентичны зиготическим зародышам данного вида. Необходимо подчеркнуть, что в исследованиях по соматическому эмбриогенезу у других представителей рода Larix (Larix leptolepis, L. decidua, L. occidentaiis и L. x eurolepis), было обнаружено иное протекание процессов формирования соматических зародышей. ЭСМ у них также включала клетки двух типов, однако они имели строгую организацию: на периферии скопления клеток эмбриональных трубок формировалось большое количество меристематических центров, из которых в дальнейшем и выделялись соматические зародыши [Von Aderkas et al., 1991].
Согласно классификации типов зародышей голосеменных растений [Singh, 1978] возникновение проэмбрио и степень его участия в образовании основных частей зародыша у сосновых происходит однообразно.
У зиготических зародышей лиственницы сибирской проэмбриогенез происходит до удлинения первичного суспензора, ранний эмбриогенез начинается после удлинения суспензора и идет до заложения меристемы корня, поздний эмбриогенез характеризуется интенсивным гистогенезом, и формированием биполярной структуры [Singh, 1978; Третьякова, 1990]. Проэмбриогенез у лиственницы in vivo начинается со свободноядерной стадии развития, также как у других представителей семейства Pinaceae. Образующийся 16-клеточный проэмбрио, состоит из одинаковых клеток, отличающихся местом их расположения в системе проэмбрио. Однако, способностью к растяжению обладают лишь клетки предпоследнего яруса, которые берут на себя функции первичного суспензора (внешне же не отличающиеся от эмбриональных трубок соматического зародыша) и выталкивают эмбриональные инициали в ткань женского гаметофита.
При инициации соматического эмбриогенеза у незрелых зиготических зародышей лиственницы in vitro под влиянием гормонов соматические клетки периколюмна зародыша начинают интенсивно растягиваться и образуют «эмбриональные трубки». Эмбриональные трубки делятся асимметрично с отчленением эмбриональной клетки, из которой и формируется эмбриональная масса будущего соматического зародыша. Следовательно, если у зиготического зародыша образуются морфологически одинаковые клетки 16-ти клеточного проэмбрио, выполняющие разные функции, т.е. формирование первичного суспензора (эмбриональных трубок) и эмбриональных инициалей предопределено их положением в системе проэмбрио, то при соматическом эмбриогенезе все структуры соматического зародыша возникают из одной и той же клетки, путем ее удлинения, а затем - неравного деления. Дальнейшее эмбриональное развитие клеток у соматических и зиготических зародышей идет одинаково. У тех и других формируются две группы клеток: эмбриональные клетки и эмбриональные трубки. Из эмбриональных клеток формируются эмбриональные глобулы, а из эмбриональных трубок -дополнительные эмбриональные трубки и, затем, клетки суспензора.
При зиготическом эмбриогенезе продвижение эмбриональных глобул в ткань мегагаметофита происходит за счет деления и отмирания эмбриональных трубок; при этом старая эмбриональная трубка дегенерирует, и на ее месте появляется новая. Если у большинства представителей семейства Pinaceae на данной стадии развития происходит кливаж, то у лиственницы сибирской типичного кливажа мы не наблюдали. Отчленение частей зародыша у лиственницы сибирской in vivo происходит, вероятно, на более поздних этапах развития. Не исключено, что этот феномен и есть проявление так называемой замедленной кливажной полиэмбрионии, описанной у ряда видов лиственниц [Schopf, 1943; Тренин, 1986].
При соматическом эмбриогенезе вокруг увеличивающихся эмбриональных глобул также идет образование эмбриональных трубок, а затем их отмирание и образования новых. То есть, как у зиготических, так и у соматических зародышей различаются две структурные единицы, одна из которых образует зародыш, а другая эмбриональные трубки и, в последствии, клетки суспензора. Однако при соматическом эмбриогенезе, рост эмбриональных трубок происходит беспорядочно вокруг эмбриональных глобул, что вероятно связано с поглощением питательных веществ из питательной среды. При зиготическом эмбриогенезе образование клеток суспензора, отвечающего за питание зародыша, идет упорядоченно в области будущего зародышевого корешка.
Как уже указывалось ранее, различия в протекании андроклинии у лиственницы сибирской были обусловлены содержанием гормонов в питательной среде. Так, использование только ауксина (2,4-Д или ИУК) вызывало разрастание микроспорофиллов, внутри которых происходил переход морфогенных микроспор, с гаметофитного путь развития на спорофитный, сопровождающийся равным делением их ядер. В результате происходило формирование зародышей непосредственно из микроспоры: наблюдалось выпячивание цитоплазмы микроспоры, миграция одного из ядер к противоположному полюсу клетки и формирование межклеточной перегородки. За этим следовали деления двух сформированных клеток, одна из которых в дальнейшем давала начало собственно эмбриоиду, а вторая -суспензороподобной структуре. Интересно отметить, что полученные в результате прямой андроклинии эмбриоиды микроспориального происхождения были схожи с зародышами покрытосеменных растений. Они последовательно проходили стадии развития, характерные для зародышей покрытосеменных растений, и останавливали свое развитие на стадии соответствующей ранней глобулярной стадии покрытосеменных растений [Berleth, Chatfield, 2002]. Основным морфологическим отличием таких эмбриоидов является наличие менее развитого «подвеска», в то время как зиготические и соматические зародыши голосеменных растений имеют массивный, хорошо развитый суспензор.
