Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 9
1.1 Свойства шелка тутового шелкопряда bombyx mori 9
1.2 Виды скаффолдов 12
1.3 Регенерация тканей
1.3.1 Регенерация кожных покровов 26
1.3.2 Регенерация кишки 30
2 Материалы и методы 48
2.1 Материалы 48
2.2 Клеточные линии 48
2.3 Лабораторные животные 49
2.4 Изготовление скаффолдов на основе фиброина шелка 49
2.5 Изучение структуры поверхности скаффолдов 53
2.6 Исследование деструкции скаффолдов в нейтральных и окисляющих условиях в модельных системах in vitro 54
2.7 Исследование механических характеристик скаффолдов 54
2.8 Выделение первичной культуры мышиных эмбриональных фибробластов (мэф) 55
2.9 Выделение первичной культуры макрофагов мыши из костного мозга 55
2.10 Выделение первичной культуры эпидермальных кератиноцитов мыши 56
2.11 Исследование скорости миграции фибробластов мыши 3т3 на полимерных пленках 57
2.12 Культивирование мэф на скаффолдах в виде губок из фиброина и желатина 57
2.13 Исследование биосовместимости скаффолдов на основе фиброиновых волокон 58
2.14 МТТ-тест 58
2.15 Статистический анализ данных 59
2.16 Исследование регенерации кожи в модели полнослойной раны кожи мыши 59
2.17 Изучение динамики экспрессии генов
провоспалительных хемокинов и цитокинов 60
2.18 Исследование регенерации стенки тощей кишки при использовании скаффолдов на основе фиброиновых волокон, витализированных клетками костного мозга 61
2.19 Гистологические исследования 63
3 Результаты 65
3.1 Получение различных видов скаффолдов 65
3.2 Исследование механических характеристик скаффолдов и скорости деградации 72
3.3 Исследование биосовместимости полученных скаффолдов 77
3.4 Трехмерное культивирование иммортализованных клеточных линий на фиброиновых и фиброин желатиновых микроносителях 82
3.5 Регенерация кожи 84
3.6 Регенерация стенки тощей кишки 99
4 Обсуждение 111
4.1 Структура и свойства созданных скаффолдов 111
4.2 Исследование биосовместимости полученных скаффолдов 116
4.3 Регенерация кожи 119
4.4 Регенерация кишечника 124
5 Заключение 130
Список сокращений и обозначений 133
Благодарности 135
Список литературы 136
- Виды скаффолдов
- Исследование деструкции скаффолдов в нейтральных и окисляющих условиях в модельных системах in vitro
- Исследование регенерации стенки тощей кишки при использовании скаффолдов на основе фиброиновых волокон, витализированных клетками костного мозга
- Трехмерное культивирование иммортализованных клеточных линий на фиброиновых и фиброин желатиновых микроносителях
Виды скаффолдов
Нетканые фиброиновые скаффолды из природных шелковых волокон интересны в качестве биоинженерных матриксов в связи с формой поверхностей и топографией, привлекательной для клеточной адгезии. Нетканые скаффолды готовятся путем частичной солюбилизации нативных шелковых волокон, обычно в муравьиной кислоте и растворе хлорида кальция. Шелковые волокна также могут быть предварительно механически гомогенизированы, а затем частично солюбилизированы [28]. Фиброиновые маты, полученные таким образом, изучались в контакте с различными типами клеток, включая кератиноциты, фибробласты, остеобласты и клеточные линии из эпителия легких, толстой кишки и карциномы шейки матки. Обнаружена низкая степень деградации шелковых волокон, что, возможно, связано с низкой плотностью контакта клеток с матриксом. Клетки эндотелия (как первичные, так и иммортализованные) прикреплялись к нетканым фиброиновым матам и пролиферировали. Адгезия и пролиферация улучшались при покрытии фиброиновой основы коллагеном I и фибронектином, что принято связывать с присутствием в коллагене RGD-последовательностей, обеспечивающих прикрепление клеток [29].
Волокна фиброина, полученные электроспиннингом создаются из фиброина шелка, предварительно растворенного в различных комбинациях растворителей. Они имеют широкий диапазон диаметров от нескольких нанометров до нескольких микрон [30]. Электроспиннинг в водных растворах фиброина в смеси с полиэтиленоксидом обеспечивает получение волокон диаметром менее 0.8 нм. Полученные на основе таких волокон скаффолды были пригодны для культивирования МСК человека [31].
Фиброиновые пленки получают из органических и водных растворов фиброина [32,33]. Отличия в структуре шелка вызваны разницей в продолжительности обработки 50%-ным раствором метанола. Это приводит к различию в механических свойствах и степени разлагаемости пленок [33]. Ультратонкие фиброиновые пленки также формируются из водных растворов, при этом используется техника послойного синтеза [34]. Эти ультратонкие пленки стабилизируются гидрофобными взаимодействиями, толщина пленки регулируется концентрацией фиброина в растворе. Пленки поддерживают адгезию и пролиферацию МСК [34]. Микроструктуры в пленках, обеспечивающие шероховатость поверхности для клеточной адгезии, формируются при смешивании шелка с полиэтиленоксидом. Шероховатость строго коррелирует с соотношением фиброина к полиэтиленоксиду, использованному в процессе синтеза [35]. Шелковые пленки, используемые в экспериментальных моделях кожных ран у крыс, ускоряют заживление и дают меньшее воспаление, чем при использовании традиционных материалов [36]. Шелковые пленки также могут обеспечивать основу для формирования костей, в частности, когда они модифицируются RGD-последовательностями [18]. Прозрачные пленки, созданные из смеси шелка и целлюлозы, демонстрируют более высокие механические показатели, чем просто пленки из шелка [37]. Композитные пленки из шелка и рекомбинантных коллагенов, сходных с таковыми у человека, обеспечивают большую жизнеспособность гепатоцитов, чем пленки из чистого шелка [38]. Раствор фиброина, нанесенный на пленки из полиуретана и поликарбонатов, повышает адгезию и пролиферацию фибробластов человека [39,40].
Фиброиновые гидрогели. Гидрогели – это трёхмерные полимерные сети, набухающие, но не растворяющиеся в водных растворах. Гелеобразные биоматериалы проницаемы для цитокинов и продуктов метаболизма, что важно для культивирования клеток. Фиброиновые гидрогели, приготовленные из водных растворов шелка, формируют -слоистые структуры [41], [42]. рН раствора фиброина влияет на скорость гелизации раствора. Гелизация 3% раствора происходит в течение 2 дней при рН 3-4, при этом при рН 5-12 это происходит уже за 8 дней [42]. Важны и другие факторы, например, концентрации самого полимера и ионов Ca2+. Так, скорость формирования геля растёт при повышении концентрации фиброина и кальция, температуры, и при понижении рН. Размер пор в гидрогеле контролируется концентрацией фиброина и температурой [41]. Остеобластоподобные клетки хорошо прикрепляются к 2% гидрогелям, подтверждая тем самым биосовместимость материала. Добавление 30% глицерина к гидрогелю повышает их пролиферацию [43]. Фиброиновые гидрогели, введенные в дефекты критических размеров бедренной кости кролика, способствовали восстановлению костной ткани, а также ускоряли минерализацию по сравнению с полилактоглицеридом [44].
Фиброиновые пористые губки. Трехмерные пористые скаффолды являются идеальными основами для разработки тканеинженерных конструкций, поскольку они наиболее близки по структуре к внеклеточному матриксу. Существуют различные методы создания трехмерных скаффолдов: замораживание высушивание, выщелачивание, замораживание-оттаивание, вспенивание [45], [46], [47]. Скаффолды, полученные методом замораживания-высушивания, имеют пористую структуру с диаметром пор менее 100 мкм, размер пор можно варьировать, регулируя температуру замерзания, pH среды, а также тип и количество органических растворителей. При понижении температуры замораживания уменьшается средний диаметр пор, а фиброин формирует поверхность сложной формы. При понижении pH до 4 фиброин переходит в структуру волокна, а размер пор уменьшается. Добавление метанола к раствору шелка приводит к значительному снижению среднего размера пор и вследствие высокой плотности упаковки молекул фиброина повышает прочность материала. Изделия из фиброина шелка, полученные в таких условиях, имеют типичное волокнистое строение [46]. Повторное замораживание-оттаивание скаффолдов, полученных замораживанием-высушиванием, приводит к увеличению размеров пор с 67 до 120 мкм, при этом плотность стенки поры уменьшается почти в 3 раза, а коэффициент сжатия и проницаемость повышается [45].
Исследование деструкции скаффолдов в нейтральных и окисляющих условиях в модельных системах in vitro
Выделение клеток МЭФ проводили из GFP+ эмбрионов на 13.5 день внутриутробного развития. Датированную беременность получали, подсаживая двух самок C57BL/6N к GFP+ самцу на ночь, утром проверяли наличие копулятивной пробки у самок. Момент обнаружения копулятивнои пробки считали 0.5-м днем беременности. На 13.5 день беременности мышь эвтаназировали и извлекали матку. Наличие экспрессии GFP проверяли на УФ-трансиллюминаторе. Удаляли голову и внутренние органы у эмбрионов, а оставшиеся ткани измельчали глазными ножницами в стерильных условиях, диссоциировали в 0.05%-ном растворе трипсин-ЭДТА и осаждали 5 минут при 200g. Полученную клеточную суспензию переносили во флакон в среду ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и помещали в СО2-инкубатор на 37С с содержанием СО2 в атмосфере 5%.
Макрофаги получали из костного мозга. Для выделения костного мозга мышей линии C57BL/6N подвергали эвтаназии путем дислокации шейного позвонка, после чего асептически извлекали бедренные кости. Кости очищали от соединительной ткани и отрезали от них эпифизы. Шприц на 10 мл (игла 23-G) вставляли в один конец кости и с помощью 5 мл среды ДМЕМ вымывали костный мозг в пробирку. После этого костный мозг помещали в среду ДМЕМ с L-глютамином, 30% супернатанта фибробластов линии L929 (в качестве источника фактора M-CSF), 20% лошадиной сыворотки (40 мл среды на костный мозг одной мыши), пипетировали и помещали на чашки Петри в примерном расчете 6-8 мл среды с клетками на чашку. Чашки инкубировали в термостате (37С, 5% CO2) в течение 7 дней. Через 7 дней клетки промывали ФСБ, снимали с чашек Петри путем охлаждения до 4С в течение 20 минут, и пересаживали на новые чашки Петри в свежей среде. После чего клетки инкубировали в термостате (37С, 5% СО2) в течение еще трех дней. Через три дня клетки рассаживали на 96-луночный планшет в концентрации 5 104 клеток на лунку.
Первичную культуру мышиных кератиноцитов получали из новорожденных мышей C57BL/6N на 0-3 день развития. Фрагмент кожи обеззараживали антибиотиком/антимикотиком (Gibco) следующего состава: 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стептомицина и 0.25 мкг/мл амфотерицина в ФСБ в течение 5 минут. Далее в течение ночи при +4С обрабатывали 0.025%-ным раствором трипсин/ЭДТА. Затем дерму удаляли, а эпидермис измельчали и центрифугировали при 200g в среде FAD следующего состава: DMEM/Ham s F12 (Lonza, Швейцария) в соотношении 3.5: 1.1 с добавлением 10% ЭТС, 0.18 мМ аденина, 0.5 мкг/мл гидрокортизона, 5 мкг/мл инсулина, 0.1 нМ холерного токсина, 10 нг/мл EGF, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата, с последующим ресуспендированием. Характеристику полученной из суспензии первичной культуры кератиноцитов проводили путем выявления цитокератинов 5 и 14 на поверхности клеток посредством непрямой иммунофлуоресценции с использованием мышиных моноклональных антител к цитокератину 5 с поликлональными козьими антителами против иммуноглобулина G мыши, меченных CF 555 и кроличьих моноклональных антител к цитокератину 14 с поликлональными козьими антителами против иммуноглобулина G кролика, меченных CF 633. Использовали антитела производства Sigma-Aldrich, США. 2.11
Скорость миграции фибробластов мыши 3Т3 исследовали в модельной системе «рана». Для этого полимерные пленки, полученные из водного раствора фиброина шелка и рекомбинантного аналога спидроина 1, стерилизовали 70% этанолом в течение 12 часов. Из спирта стерильно переносили пленки в культуральную среду ДМЕМ и инкубировали 1 час, затем среду заменяли на свежую, через 1 час удаляли ее и вносили полную среду для культивирования фибробластов 3Т3. Через 1 час помещали пленки в чашки Петри диаметром 35 мм и вносили 2 мл суспензии клеток с концентрацией 24 000 в 1 мл. В качестве контроля использовали культуральные стекла диаметром 24 мм. Культивировали фибробласты на пленках и стеклах в течение 3 суток в СО2-инкубаторе при 37С с содержанием СО2 в атмосфере 5%. На третьи сутки, когда клетки на пленках достигали плотности близкой к монослою, часть клеток удаляли с носителя посредством нанесения «раны» с помощью наконечника для автоматической пипетки на 1 мл. Сразу после нанесения «раны», а также через 12 и 24 часа клетки на пленках и стеклах фиксировали 4% параформальдегидом, ядра клеток выявляли SYTOX Green. Анализ проводили на конфокальном микроскопе Axiovert 200M LSM 510 Meta следующим образом: получали по 10 изображений области «раны» с каждого образца и с использованием программного обеспечения 3D for LSM проводили подсчет количества ядер фибробластов, мигрировавших в область «раны».
Исследование регенерации стенки тощей кишки при использовании скаффолдов на основе фиброиновых волокон, витализированных клетками костного мозга
Для пористых скаффолдов, выполненных выщелачиванием частиц хлорида натрия и замораживанием-оттаиванием водного раствора фиброина, измеряли жесткость при сжатии.
К верхней поверхности образца подводили плиту и оказывали давление на скаффолд, проводили измерения зависимости силы, действующей на плиту, от ее смещения. При подводе плиты в определенный момент на нее начинает действовать капиллярная сила, которая тянет ее в сторону образца. Это приводит к возникновению участка отрицательных значений на кривой «напряжение – деформация» (Рисунок 6). Рисунок 6– Измерение модуля Юнга образцов А – кривая нагрузки влажного образца, Б – кривая нагрузки образца в воде. В экспериментах монотонный участок кривой «напряжение – деформация», соответствующий сжатию скаффолда, как на влажном, так и на полностью погруженном в жидкость образце оказывался нелинейным. Модуль Юнга оценивали по кривым, полученным на влажных образцах (в присутствии капиллярной силы), как тангенс угла наклона линейного участка после того, как сила, действующая на плиту, станет положительной. Полученные значения представлены в таблице 1.
Исследование показало, что внесение с структуру скаффолдов желатина делает их жестче. Исследование скорости гидролитической деградации скаффолдов in vitro проводилось по анализу изменения массы образцов в фосфатно-солевом буфере в течение 55 дней. Скаффолды из фиброина, выполненные замораживанием-оттаиванием, оказались более стабильными в нейтральных условиях, чем скаффолды, модифицированные желатином. Значимое изменение массы фиброиновых образцов скаффолдов в течение 55 дней не наблюдалось, в то время, как модифицированные скаффолды потеряли в весе почти 20%, при этом уже через 5 дней их масса снизилась на 10% (Рисунок 7). Тем не менее, скаффолды как из фиброина, так и модифицированные, были устойчивы к гидролизу в нейтральных условиях.
Гидролитическая деструкция пористых скаффолдов, полученных замораживанием-оттаиванием водного раствора фиброина (Ф) и смеси фиброина и желатина в соотношении 7:3 (ФЖ) Пористые скаффолды на основе фиброина устойчивы к гидролизу в нейтральных средах. pO.OOl. Исследование скорости деградации пористых скаффолдов, выполненных выщелачиванием, показало, что в ФСБ данные образцы также стабильны в течение 55 дней. Однако в отличие от скаффолдов, полученных замораживанием 75 оттаиванием, масса скаффолдов остается неизменной первые 25 дней, а затем незначительно снижается. На 30-й день масса образцов снизилась на 13%, а на 35-й день потеря веса составила 25% (Рисунок 8).
Пористые скаффолды на основе фиброина устойчивы к гидролизу в нейтральных средах и разрушаются в присутствии 1мМ H2O2 и 100 мкМ Fe2+. - p 0.001.
Была изучена скорость биодеградации полученных скаффолдов в модельной системе in vitro, имитирующей окислительную деградацию, с использованием реактива Фентона. Скаффолды из фиброина, полученные выщелачиванием, быстро деградировали в окисляющих условиях. Уже через 5 дней вес образцов уменьшился более чем на 50%, а к 55 дню масса составила всего около 10%. При этом скаффолды, выполненные замораживанием-оттаиванием, оказались устойчивее к окислительной деградации – масса данных образцов изменилась менее чем на 10% за 55 дней (Рисунок 9).
Окислительная деградация пористых скаффолдов, полученных замораживанием-оттаиванием водного раствора фиброина (Ф) и смеси фиброина и желатина в соотношении 7:3 (ФЖ). - p 0.001 Пористые скаффолды на основе фиброина медленно разрушаются в окисляющих условиях, внесение в состав скаффолда желатина приводит к снижению устойчивости к деградации в присутствии 1мМ H2O2 и 100 мкМ соли Fe2+. Модификация желатином скаффолдов, полученных методом замораживания-оттаивания, приводила к ускорению окислительной деградации: образцы потеряли в весе около 30% за 55 дней.
Для выбора оптимального соотношения фиброина-желатина в составе скаффолда использовали матриксы на основе фиброина, содержащие разное количество желатина: 10%, 20%, 30%, 40%, и 50% (Рисунок 10). Для исследования адгезии и пролиферации клеток использовали линию мышиных эмбриональных фибробластов, конститутивно экспрессирующих GFP (МЭФ-GFP). Через сутки культивирования количество клеток на поверхности образцов композитных матриксов с 20% содержанием желатина было в 2 раза выше, чем на поверхности матриксов из фиброина. Кроме того, обнаружено значительное количество клеток, имеющих характерную для фибробластов морфологию, в то время как на матриксах на основе фиброина были обнаружены лишь единичные фибробластоподобные клетки (Рисунок 10). Количество клеток на матриксах из фиброина на 4 день культивирования уменьшалось. Наибольшее количество клеток на 4 день было на матриксах, содержащих 30%, 40% и 50% желатина. При этом, на образцах, в состав которых входило 40% и 50% данного полимера, наблюдалось затруднение миграции МЭФ в глубокие слои матриксов. Большая часть клеток на данных образцах была сосредоточена в поверхностных слоях матрикса (до 100 мкм), и лишь единичные обнаруживались в более глубоких слоях матрикса (до 200 мкм). На остальных образцах распределение клеток было более однородным.
Трехмерное культивирование иммортализованных клеточных линий на фиброиновых и фиброин желатиновых микроносителях
В ходе выполнения работы были созданы четыре вида скаффолдов – в виде пленок, губчатые, гибридные и микроносители.
Методом кастинга были созданы скаффолды в виде пленок. Поверхность скаффолда в виде пленки обладала рельефом и субмикронными отверстиями. Рельеф необходим для клеточной адгезии и миграции [35], а субмикронные отверстия обеспечивают газообмен, диффузию ростовых факторов и метаболитов. Композитная фиброин-желатиновая пленка обладала более выраженным рельефом. Структурно фиброиновые пленки имитируют базальные мембраны из коллагена IV, которые служат местом прикрепления поляризованных клеток: эпителиальных или эндотелиальных [153], что раскрывает перспективы использования фиброиновых пленок в составе гибридных скаффолдов, имитирующих структуру ВКМ кожи. Структура губчатых скаффолдов, изготовленных из водного раствора фиброина методом замораживания-оттаивания, характеризовалась формированием сложной незамкнутой поверхности, образованной вокруг кристаллов льда при замораживании. Стенки пор скаффолдов, сформированных при замораживании-оттаивании водного раствора фиброина, обладали микрорельефом, однако характер микрорельефа значительно отличался от микрорельефа стенок пор скаффолдов, изготовленных выщелачиванием. Элементы рельефа были значительно меньше, чем на поверхности скаффолдов, выполненных выщелачиванием. Полученный результат противоречит утверждению, что губки из водного раствора фиброина имеют более шероховатую поверхность по сравнению с образующимися в органических растворителях методом выщелачивания [154], но это расхождение, видимо, связано с вариациями технологий.
Гибридный скаффолд являлся более усовершенствованным вариантом фиброинового изделия. Пористый матрикс формировался на фиброиновой пленке, что приводило к образованию сложной гибридной структуры, сочетающей в себе пленку и губчатый слоистый матрикс. В таком варианте при использовании гибридных матриксов в качестве раневых покрытий, подлежащий под плохо проницаемой для воды и бактерий пленкой, губчатый матрикс не будет усыхать и превращается в корку, а, напротив, создаст необходимый функциональный белковый каркас для миграции клеток, задействованных в репарации кожной раны – фибробластов, макрофагов, мезенхимальных стволовых клеток и пр. В гибридном скаффолде, как и в организме, сочетаются два типа подложек: 2D и 3D. В организме 2D структуры представлены базальными мембранами из коллагена IV, которые служат местом прикрепления поляризованных клеток: эпителиальных или эндотелиальных [153]. В гибридном скаффолде роль 2D субстрата выполняет фиброиновая пленка, на которой могут расти кератиноциты. Напротив, фиброиновый губчатый слоистый матрикс напоминает подлежащие под базальной мембраной соединительные ткани дермы, в которых создаются 3D условия, наиболее благоприятные для развития фибробластоподобных клеток.
Исследование механических характеристик скаффолдов. Основу внеклеточного матрикса соединительных тканей составляют фибриллярные белки, в основном коллагены различных типов и эластин, гликопротеины и гликозаминогликаны. Механические характеристики ткани зависят от соотношения этих компонентов в составе матрикса. Так, коллаген образует фибриллы и придает матриксу жесткость, а также упорядочивает его, а эластин обеспечивает упругость [155]. Гликопротеины и гликозаминогликаны склонны к гелеобразованию, заполняя внеклеточное пространство и оказывая дополнительное сопротивление силам сжатия [156]. Фиброин является одним из наиболее прочных и одновременно эластичных биорезорбируемых полимеров. Скаффолды в виде пленок, полученные методом кастинга из водных растворов, исследовали на растяжение. Обнаружено, что пленка из регенерированного фиброина шелка при испытаниях на растяжение тянется как типичная полимерная пленка, имеющая плато текучести. Добавление желатина приводило к исчезновению участка текучести и снижало основные механические характеристики: модуль Юнга, предел прочности и удлинение при максимальном напряжении. Эти результаты ожидаемы, т.к. желатин более мягкий и менее эластичный материал, чем фиброин [157]. В то же время, при изготовлении пленок методом электроспиннинга, а не кастинга, добавка желатина к фиброину улучшала механические свойства: максимальное напряжение и максимальное удлинение пленок, полученных из фиброина с желатином, выше, чем у пленок из чистого фиброина [158].
Для пористых скаффолдов, выполненных выщелачиванием с частицами хлорида натрия и замораживанием-оттаиванием водного раствора фиброина, измеряли жесткость при сжатии. К верхней поверхности образца подводили плиту и оказывали давление на скаффолд, проводили измерения зависимости силы, действующей на плиту, от ее смещения. При подводе плиты в определенный момент на нее начинает действовать капиллярная сила, которая тянет ее в сторону образца, что приводило к возникновению участка отрицательных значений на кривой «напряжение-деформация» Такой эффект наблюдали, например, при исследовании образцов из полидиметилсилоксана и желатина [159], а также децеллюляризованной печени [160]. В экспериментах монотонный участок кривой «напряжение-деформация», соответствующий сжатию скаффолда, как на влажном, так и на полностью погруженном в жидкость образце оказывался нелинейным. Это связано с нелинейными свойствами пористых скаффолдов и неровной верхней поверхностью [161]. Неровность верхней поверхности приводит к тому, что при подводе плиты контакт возникает не на всей верхней площадке единовременно, а постепенно распространяется от наиболее выступающего дефекта. Таким образом, отрицательный участок на Рисунке 6, по-видимому, соответствует одновременному действию двух сил: капиллярной и упругости.
Модуль Юнга оценивали по кривым, полученным на влажных образцах (в присутствии капиллярной силы), как тангенс угла наклона линейного участка после того, как сила, действующая на плиту, станет положительной. Такой способ использовали, например, для измерения механических свойств децеллюляризованной печени [162]. Получаемые значения показывают не модуль Юнга, а эффективный модуль Юнга, т.к. не учитывают вязкоупругих свойств образца [160]. Обнаружено, что внесение в структуру скаффолдов желатина делает их жестче. Аналогичный результат был ранее получен при исследовании скаффолдов, синтезированных методом замораживания-оттаивания с использованием лиофильной сушки [163].