Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современного здравоохранения является диагностика и лечение синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), который вызывается вирусом иммунодефицита человека (ВКЧ). Для решения теоретичес-<их и практических вопросов, связанных с ВИЧ-инфекцией, используются клеточные линии, чувствительные к ВИЧ. С помощью клеток, инфицированных ВКЧ in vitro, изучают закономерности репликации ВИЧ и экспрессии вирусных гєное. На основе инфицированных клеток разработаны первые диагностические тест-системы, не потерявшие значение и в насе время. Клетки, чувствительные к ВИЧ, необходимы также для химиотералевтических исследований по поиску новых противовирусных препаратов. Однако в процессе культивирования клетки могут изменять или терять свои свойства, что обусловливает необходимость постоянного контроля их стабильности. Надежным способом контроля стабильности и изменчивости клеточных линий является анализ их хромосомного состава
С другой стороны, серьезным препятствием при работе с клеточными линиями являются широко распространившиеся случаи контаминации культур, смеиивания клеток (Kelson-Rees et al., 1981; Satya-Prakash et al., 1981). Наркологический анализ клеточных линий совместно с методом геномной дактилоскопии (ДНК-фингерпринтинга) позволяют идентифицировать клетки нетолько на уровне вида; но обеспечивают их внутривидовую идентификацию.
Цитогенетическая характеристика больсикства клеточных линий, чувствительных к БИЧ, не проводилась. В связи с этим очевидна необходимость кариологического анализа клеточных линий, используемых в различных лабораториях для.изучения и размножения ВИЧ.
В большинстве клеточных культур ВИЧ репродуцируется с проявлением цитопатического действия (ЦПД) (Koyanagi et al. , 1985; Harada et al. , 1985). Однако в доступной нам литературе отсутствуют работы по анализу действия ВИЧ на хромосомы клеток in vitro. Данные по действию ВИЧ на хромосомы клеток in vivo немногочисленны и нередко противоречивы (Kosmo et al. , 1987; Botti et al. , 1988; Beverstock et al. , 1990). Поэтому актуаль-
ным является изучение влияния ВИЧ на хромосомы клеток высокочувствительных линий человека
Настоящая работа выполнялась как фрагмент исследований, входящих в тему "Разработка иммуноцитогенетических критериев оценки лкмфобластоидных линий человека, пригодных для выделения изолятов и крупномасштабной наработки вирусов иммунодефицита человека", поддержанную грантом Совета по проблеме СПИД РАМН (грант N64). Проведенные исследования являются частью общих плановых тем Института вирусологии N 01.87.0045916, N 01.87.0045882, а также частью работы по Программе ГКНТ "Геном человека" Института цитологии РАН.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось онтогенетическое изучение клеточных линий и клонов, имеющих различную чувствительность к ВИЧ, а также изучение действия ВИЧ на хромосомы человека in vitro.
Для достижения указанной цели последовательно решались следующие задачи:
1. Получение кариотипов и ДНК-фингерпринтингов клеточных линий,
чувствительных к ВИЧ
-
Патогенетический анализ клеточных линий, имеющих различную чувствительность к ВИЧ, с помощью 6-, С- 'И Ag- методов дифференциальной окраски хромосом, гибридизации in situ на специфические центромерние области хромосом и приемов кариотипирования.
-
Сравнительный кариологический анализ клонов линии U-937, имеющих различную чувствительность к ВИЧ.
4. _ Изучение мутагенного действия БИЧ на хромосомы высокочувс
твительных линий мТ-4 и Jurkat tat.
Научная новизна работы. В результате изучения 23 вариантов 9 клеточных линий, чувствительных к ВИЧ, показана принципиальная возможность применения выявленных маркерных хромосом для внутривидовой идентификации клеточных линий, наиболее используемых при работе с ВИЧ. Впервые проведен детальный анализ кариотипов Т-клеточных линий МТ-4, Jurkat tat, СЕМ и моноцито-идной линии U-937 с использованием методов дифференциальной окраски, гибридизации in situ и обобщенного реконструированного кариотипа. Установлено, что' основные хромосомные поврежде-
ния клеточных линий, чувствительных к БИЧ затрагивают сайты локализации генов клеточного деления и клеточной дифференци-ровки. Выявлены хромосомные нарушения в высокочувствительном клоне U937 /16, отличающие его от клонов с низкой и средней чувствительностью. Уточнен район локализации гена рецептора СД4. В линии U-937 он локализуется в районе 12рИ-12. Впервые показано, что ВИЧ-инфекция in vitro оказывает различное действие на хромосомы двух высокочувствительных линий мТ-4 и Jurkat tat. Обнаружено, что максимальное число аберраций хромосом в инфицированных клетках Jurkat tat совпадает по времени с максимальным выявлением белков ВИЧ. Показан неслучайный характер распределения разрывов хромосом в культуре клеток Jurkat tat, инфицированной ВИЧ (штамм BRU).
Практическая значимость исследований. Полученные кариоти-пические характеристики клеточных линий, чувствительных к ВИЧ, являются надежными параметрами для идентификации линий в коллекциях клеточных культур. Описание кариотипов изучаемых линий вошло в "Каталог перевиваемых клеточных линий, чувствительных к инфицированию вирусами иммунодефицита человека". Особое значение эти данные имеют для производственных подразделений, задача которых состоит в длительном крупномасштабном культивировании чувствительных к ВИЧ клеток для получения антигена ВИЧ, используемого в диагностических тест-системах.
Апробация работы: Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной научной конференции "Генетика соматических клеток в культуре" (Звенигород, 1989), на конкурсе молодых ученых Института вирусологии РАМН (Москва,1989), на международных конференциях по СПИДу в США (1990) и в Италии (1991).
Публикации. По материалам исследования опубликовано 6 работ.
Структура и объем работы. Диссератция состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, собственных результатов, обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена Halfft страницах машинописного текста, включая 36 рисунков и 12 таблиц. Список литературы насчитывает Ml названий работ.
