Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 10
2.1. Генетические перестройки в онтогенезе эукариот 10
2.1.1. Особенности структуры генома и его изменчивость 10
2.1.2. РОЛЬ мобильных генетических элементов в изменчивости генома 13
2.1.3. Изменения генома в генеративных и соматических клетках, необходимые для нормального онтогенеза 14
2.1.4. Генетические перестройки, имеющие значение в адаптации и видообразовании 17
2.1.5. Изменения в генетическом аппарате клетки при наследственных и спорадических заболеваниях 18
2.2. ПЦР-фингерпринт как метод для изучения геномного полиморфизма. Варианты метода 21
2.2.1. IRS-ПЦР 22
2.2.2. АР-ПЦР 24
2.2.3. RAPD-ПЦР 26
2.3. Особенности канцерогенеза, изучаемые с помощью ПЦР-фингерпринта 29
2.3.1. Молекулярно-генетические маркеры злокачественного роста 30
2.3.2. Прогрессия опухолей и прижизненный анализ 31
2.3.3. Выявление активности онкогенов 33 2.3.4.Генные и хромосомные перестройки 33 2.3.5.Выявление потери гетерозиготности генов-супрессоров опухолевого роста 34
2.3.6. Идентификация генов 35
2.3.7. Неспецифические геномные перестройки. Микросателлитная нестабильность 36
2.4. Сохранение способности опухолевых клеток к дифференцировке при разных условиях их пролиферации 38
2.5. Роль апоптоза при злокачественной трансформации клетки и прогрессии опухолей 41
2.5.1. Апоптоз при нормальном развитии организма 41
2.5.2. Апоптоз при злокачественном росте и генетическая вариабельность опухолевых клеток 45
2.5.3. Фунционирование системы Fas-peuemop при взаимодействии опухолевых клеток с иммунной системой 47
3. Материал и методы 50
3.1.Материал 50
3.1.1. Опухолевые клеточные линии 50
3.1.2. Линейные мыши 50
3.2. Методы 51
3.2.1. Выделение высокомолекулярной ДНК 51
3.2.2. RAPD-ПЦР 51
3.2.3. Индукция дифференцировки опухолевых клеток и морфологическое исследование опухолей 52
3.2.4. Взаимоиндукция апоптоза опухолевыми клетками и лимфоцитами 53
3.2.5. Выявление апоптоза опухолевых клеток и спленоцитов 53
3.2.6. Выделение тотальной РНК 55
3.2.7. Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция 56
3.2.8. Секвенирование ПЦР-фрагментов 59
4. Результаты 60
4.1. Полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК в клетках клонов гепатомы мыши МГ-22а, выявленный методом RAPD-ПЦР 60
4.2. Характеристика генетической структуры популяции опухолевых гепатоцитов МГ-22а 61
4.3. Жизнеспособность клонов гепатомы МГ-22а с разной степенью генетической изменчивости 64
4.4. Морфологические характеристики опухолей, выросших в ПСТ и ПКГ 66
4.5. Полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК в клетках клонов гепатомы мыши МГ-22а, выявленный методом RAPD-ПЦР, при разных условиях культивирования in vivo 70
4.6. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента ДНК 77
4.7. Взаимоиндукция апоптоза в клоповых линиях гепатомы МГ-22а и саркомы J-774 мыши и сингенными спленоцитами 79
4.8. Генетическая гетерогенность и взаимоиндукция апоптоза опухолевых гепатоцитов МГ-22а и спленоцитов 82
4.9. Экспрессия Fas и FasL в популяциях и клонах клеточных линий МГ-22а и J-774 мыши in vitro 83
4.10. Экспрессия Fas и FasL в опухолевых гепатоцитах МГ-22а, гистиоцитах J-774 и сингенных спленоцитах при их пассировании in vivo 86
4.11. Экспрессия Fas и FasL в опухолевых гепатоцитах МГ-22а, гистиоцитах J-774 и сингенных спленоцитах при их совместном культивировании in vitro 89
4.12. Способность к апопотозу и экспрессия Fas и FasL в опухолевых клетках МГ-22а и J-774 и сингенных спленоцитах при их совместном культивировании in vitm 93
5. Обсуждение 94
Выводы 127
Литература 128
- Изменения генома в генеративных и соматических клетках, необходимые для нормального онтогенеза
- Сохранение способности опухолевых клеток к дифференцировке при разных условиях их пролиферации
- Индукция дифференцировки опухолевых клеток и морфологическое исследование опухолей
- Взаимоиндукция апоптоза в клоповых линиях гепатомы МГ-22а и саркомы J-774 мыши и сингенными спленоцитами
Введение к работе
Актуальность проблемы
Известно, что кодирующие последовательности ДНК занимают не более 10-15% всего генома (Li et а!., 2001). Эти последовательности наиболее консервативны в процессе эволюции, так как мутации в них подвержены давлению жесткого естественного отбора. Функции же остальной ДНК еще не ясны, известно, однако, что эта часть ДНК обладает высоким полиморфизмом (Алтухов, Салменкова, 2002). Наиболее хорошо изучены два варианта генетического полиморфизма: количественные изменения в области локализации мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и качественные замены отдельных нуклеотидов (Salisbury et al., 2003; Никитина, Назаренко, 2004), Также большой вклад в геномную изменчивость как генеративных, так и соматических клеток вносят мобильные элементы (Smit, 1999). Изучение генетического полиморфизма показало важность и актуальность исследований этого явления в нормальной жизнедеятельности клеток и организмов, при патологии, в частности, при злокачественном росте, а также в процессе эволюции (Алтухов, Салменкова, 2002; Брага и др., 2004). Одним из наиболее перспективных методов изучения генетического полиморфизма являются разные варианты ПЦР-фингерпринта, в частности, RAPD-ПЦР (Caetano-Anolles, 1996; Гречко, 2002).
С появлением методов ПЦР-фингерпринта геномной ДНК расширились знания об опухолевом росте, так как с помощью этих методов были выявлены не только специфические изменения генома, связанные с функционированием генов, участвующих в канцерогенезе, но и неспецифические, являющиеся результатом дестабилизации генома вследствие множества мутаций в различных частях генома (lonov et al., 1993; Luo et al., 2003). Степень геномных изменений, выявляемых этими методами, коррелирует с генотипическими, фенотипическими и клиническими признаками при прогрессии опухолей и может быть полезна для прогностических оценок (Arribas et al., 1997; Papadopulus et al., 2002).
Одним из критериев злокачественности клеток является их способность к дифференцировке (Lotem, Sachs, 2002). Поэтому большое значение
приобретает изучение зависимости способности опухолевых клеток к дифференцировке от степени генетической изменчивости, в частности, от перестроек генетического аппарата клетки, выявляемых методом RAPD-ПЦР.
Особое место в исследованиях взаимодействия опухоль-организм занимает способность опухолей не только уходить от иммунологического надзора организма, но и активно подавлять защитную иммунную реакцию, тем самым обеспечивая себе иммунологическую привилегированность (Weller et al., 1997; O'Connell et al., 1999). Иммунологическая привилегированность опухолей, образующаяся благодаря способности опухолевых клеток вызывать апоптотическую гибель лимфоцитов, показана в ряде работ (Rabinowich et al., 1998; Bennett et al., 1999; Pinkoski, Green, 2000). Представляет интерес изучение влияния генетической изменчивости опухолевых клеток на их способность вызывать апоптоз у клеток иммунной системы, а также на их чувствительность к индукции апоптоза лимфоцитами. Изучение генетического полиморфизма в опухолевых клетках имеет важное значение для оценки степени злокачественности опухолей и прогнозировании течения заболевания.
Последнее десятилетие ознаменовалось бурным изучением молекулярных механизмов апоптоза как в физиологических условиях, так и при злокачественном росте. В результате этих исследований было выявлено большое значение в апоптозе системы Fas-рецептора и Fas-лиганда (Fas/FasL) (Барышников, Шишкин, 2002). Имеются данные, что именно от экспрессии FasL в опухолевых клетках зависит сопротивление опухолей иммунной системе организма и, следовательно, само развитие и течение заболевания (Houston et al., 2003). Однако до настоящего времени нет данных о гетерогенности популяции опухолевых клеток по экспрессии Fas и FasL. Поэтому важное значение имеет проведенное в работе выявление гетерогенности опухолей и по экспрессии Fas, и по экспрессии FasL с помощью клонального анализа для исследования злокачественных опухолей и прогнозирования их взаимоотношений с иммунной системой организма.
Цели и задачи исследования
Цель настоящей работы заключалась в изучении динамики генетического полиморфизма, выявляемого методом RAPD-ПЦР, в гепатоме МГ-22а и
гистиоцитарной саркоме J-774 мыши и в их клоновых линиях при их пассировании in vitro и in vivo.
В работе были поставлены следующие задачи:
Изучить генетическую структуру гепатомы Мг-22а мыши методом RAPD-ПЦР in vitro,
Изучить зависимость жизнеспособности клеток клонов гепатомы МГ-22а мыши in vitro от числа выявленных методом RAPD-ПЦР генетических изменений.
Изучить зависимость между генетическим полиморфизмом в клоновых линиях гепатомы МГ-22а мыши при их трансплантации в подкожную соединительную ткань (ПСТ) и переднюю камеру глаза (ПКГ) и уровнем дифференцировки.
Выявить влияние генетической вариабельности на способность к индукции апоптоза у опухолевых клеток гепатомы МГ-22а мыши и сингенных спленоцитов при их совместном культивировании in vitro.
Выявить зависимость индукции апоптоза у опухолевых клеток гепатомы МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 мыши с разным уровнем генетического полиморфизма и сингенных спленоцитов от экспрессии Fas и FasL
Основные положения, выносимые на защиту:
В генетической структуре популяции клеток гепатомы МГ-22а мыши, основанной на числе перестроек на фингерпринтах клонов, полученных методом RAPD-ПЦР, выделены стволовая, вариабельная и аберрантная части популяции. Наибольшей жизнеспособностью обладают клоны с наименьшей генетической изменчивостью.
Клетки клонов гепатомы МГ-22а мыши сохраняют способность к дифференцировке при пролиферации в передней камере глаза, несмотря на высокие значения индекса генетической вариабельности.
Клоновые линии гепатомы МГ-22а мыши с высоким уровнем генетической вариабельности устойчивы к апоптозу, вызываемому спленоцитами, и обладают способностью индуцировать апоптоз спленоцитов.
Опухолевые клетки гепатомы МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 мыши с разным уровнем генетического полиморфизма могут влиять на
экспрессию FasL в спленоцитах при их совместном культивировании, что приводит к разной интенсивности индуцированного спленоцитами апоптоза у опухолевых клеток.
Научная новизна полученных результатов
Впервые был изучен генетический полиморфизм в клеточной популяции и клоновых линиях гепатомы МГ-22а мыши методом RAPD-ПЦР и показана широкая вариабельность клоновых линий по этому признаку. Показана зависимость жизнеспособности клонов МГ-22а от числа выявленных генетических перестроек. Было выявлено, что способность опухолевых клеток к дифференцировке при их пролиферации в ПКГ может сохраняться при достаточно высокой частоте генетических перестроек. На клоновых линиях МГ-22а и J-774 с
разным уровнем генетического полиморфизма впервые была изучена способность опухолевых клеток индуцировать апоптоз спленоцитов, а также подвергаться апоптозу, индуцированному спленоцитами, при их совместном культивировании. Показано, что устойчивость к апоптозу у опухолевых клеток, вызываемому спленоцитами, наблюдается у клоновых линий с высокой генетической вариабельностью. В то же время, такие клоновые линии обладают способностью индуцировать апоптоз спленоцитов. Впервые был проведен клональный анализ популяции опухолевых клеток по экспрессии генов апоптоза Fas и FasL, для чего был использован метод ОТ-ПЦР, с помощью которого была показана широкая вариабельность их экспрессии. В опытах по совместному культивированию опухолевых клеток с сингенными спленоцитами в спленоцитах после культивирования обнаружено значительное повышение вариабельности экспрессии FasL. Таким образом показано, что опухолевые клетки с разным уровнем генетического полиморфизма могут оказывать воздействие на контактирующие с ними лимфоциты, влияя на экспрессию FasL и определяя таким образом интенсивность апоптоза опухолевых клеток.
Теоретическое и практическое значение работы
Полученные данные показывают, что в возникновении и нарастании генетического полиморфизма в процессе пролиферации опухолей in vitro и in
wvo участвуют перестройки, выявляемые методом RAPD-ПЦР. Вариабельность числа перестроек такого типа может дать представление о жизнеспособности опухолевых клоновых линий. Важное теоретическое значение имеет показанная в работе возможность повышения уровня дифференцировш в клоновых линиях даже при высоких значениях индекса генетической вариабельности.
Практическое значение работы заключается в том, что показана целесообразность использования для изучения взаимодействия опухолевых клеток с иммунной системой модели совместного культивирования опухолевых клонов с син генным и спленоцитами. Такая модель может быть использована не только в экспериментальной онкологии, но также и для изучения опухолей человека с целью определения их взаимоотношения с лимфоцитами носителя опухоли. При этом показана целесообразность выявления генетической вариабельности в опухолях методом RAPD-ПЦР для определения степени их злокачественности и способности индуцировать апоптоз лимфоцитов, а также претерпевать индукцию апоптоза лимфоцитами. В работе показана целесообразность использования метода ОТ-ПЦР для выявления экспрессии Fas и FasL в опухолевых клетках и спленоцитах.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Изменения генома в генеративных и соматических клетках, необходимые для нормального онтогенеза
Структура генома клеток генеративного ряда традиционно считалась стабильной. Именно гаметы содержат полную генетическую информацию данного вида и обеспечивают его неизменность в ряду поколений. Однако в литературе имеются данные, свидетельствующие об изменениях генома генеративных клеток в процессе их жизнедеятельности.
Феномен амплификации рибосомных ДНК впервые был открыт в ооцитах амфибий, а затем у рыб и некоторых насекомых (Кафиани, Костомарова, 1978). Также этот феномен был открыт и у млекопитающих и подробно изучен во время оогенеза и сперматогенезв крыс (Глазков, Медников, 1980). Было показано, что на стадии пахитены в профазе I мейоза сперматоцитов происходит двукратное увеличение количества рДНК. Степень амплификации рДНК в оогенезе крыс аналогична. Общая схема амплификации рибосомных генов в гаметогенезе крыс имеет много общих черт с аналогичными процессами, протекающими в ооцитах рыб, амфибий и насекомых. Известно также, что у мыши синтез рРНК в эмбриогенезе начинается с двуклеточной стадии развития (Engel et al., 1977).
Выявлены также генетические изменения, происходящие в эмбриогенезе во время первых делений зиготы. Как было показано в ряде работ по изучению раннего эмбриогенеза мыши (с начала транскрипционной активности зиготы до имплантации зародыша в матку) в клетках эмбрионов имеют место изменения структуры и функции хромосом. К ним относятся изменения в активности ядрышкообразующих районов (Паткин и др., 1992а), а также в характере гетерохроматизации Х-хромосомы (Паткин, Сорокин, 1985). Кроме того, выявлены изменения чувствительности ДНК ранних зародышей к расщеплению ДНКазой I (Паткин и др., 1984), эндонуклеазами Alu I, Msp I и Нра II (Паткин, Сорокин, 19926) и динамики образования одноцепочечных разрывов (Паткин и др., 1995). Показанные изменения позволяют предполагать, что реорганизация хромосомной структуры может играть важную роль в коммитировании и начальной дифференцировке, происходящей на доимлантационной стадии развития мыши.
Во время ранних делений дробления у нескольких десятков видов аскарид (Godey, Pimpinelli, 1993), веслоногих рачков (Гришанин и др., 1996), некоторых миксин (Nakai et al., 1995), а также инфузорий, клещей, жуков, бабочек, мух и рыб (Глазер, 1998) происходит диминуция хроматина, которая представляет собой запрограммированную элиминацию части генома соматических клеток. Например, в геноме двух видов морских веслоногих рачков диминуция хроматина наблюдается в клетках зародыша во время первых двух делений дробления, при этом различий в величине генома между соматическими и генеративными клетками взрослых рачков не возникает (Robins, McLaren, 1982). В то же время у зародышей пресноводных рачков клетки соматического ряда во время 4-го деления теряют 94 % хромосомной ДНК, тогда как в клетках зародышевого пути диминуции ДНК не происходит (Гришанин, 1995). У пресноводных рачков была изучена ДНК до и после диминуции хроматина с помощью RAPD-ПЦР (Гришанин и др., 1996). Было обнаружено, что последовательности, выявляемые этим методом, можно разделить на три группы: 1) сохраняющиеся в соматических клетках после диминуции хроматина; 2) выявленные только в клетках зародышевой линии; 3) возникающие после диминуции хроматина.
При изучении процесса диминуции на нематодах вида Ascaris suum было показано, что этот процесс происходит в особых областях, получивших название «районы хромосомных разрывов» и имеющихся на всем протяжении хромосом (Tobler et al., 1992). Эти районы не относятся к какому-либо одному семейству повторов, но, возможно, их общим свойством является способность к формированию неканонических структур ДНК. Например, во время диминуции хроматина из презумптивных соматических клеток Ascahs lumbricoides удаляется 99.5 % сателлитных последовательностей (Mulleret al., 1982). Кроме того, в лаборатории Тоблера было обнаружено (Landolt, ТоЫег, 1988), что наряду с высокоповторяющейся фракцией потери несут семейства средних повторов и уникальные последовательности.
Во время онтогенеза у человека может происходить изменение размеров теломерных участков хромосом. Так, было показано, что терминальные рестрикционные фрагменты половой хромосомы примерно на 5 т.п.н. длиннее в ДНК спермия, чем в ДНК, экстрагированной из клеток крови (Cooke, Smith, 1986). Исследования, проведенные в последующие годы, показали, что укорочение хромосомных теломер в онтогенезе во всех тканях человека является нормальным и необходимым процессом {Дымшиц, 2000).
Наряду с количественными изменениями, происходящими в ДНК соматических клеток, известны также направленные перестройки генома, в результате которых создаются клеточная гетерогенность и многообразие. Так, в процессе иммуногенеза у млекопитающих образуются 106 различных клонов В-лимфоцитов, каждый из которых продуцирует только один тип антител. Установлено, что это многообразие определяется в основном сайт-специфическими делециями в генах, кодирующих иммуноглобулины (Tonegawa et al., 1981).
В клеточных популяциях покрытосеменных растений в процессе онтогенеза наблюдается варьирование: а) числа ядер на клетку (встречаются одно-, двух- и многоядерные клетки); б) размеров ядер и размеров клеток в клеточной популяции; в) числа хромосом в одноядерных клетках; г) длительности митотического цикла в клетках одного и того же растения; д) состава внутриклеточных органелл (хлоропластов, митохондрий и др.). Такая картина изменений свойственна как соматическим, так и генеративным клеткам растений (Малецкий, Колодяжная, 1999).
У простейших, обладающих ядерным дуализмом (роды Eupfotes, Paramecia, Oxytricha и др.) были обнаружены глубокие перестройки структуры генома. Эти изменения происходят при образовании макронуклеуса и сопровождаются процессами элиминации части хромосом, избирательной политенизации, фрагментации хромосом по строго определенным участкам и воссоединения субгенных фрагментов хромосом (Prescott, 1994). В ряде случаев, например, в гене, кодирующем ДНК-полимеразу а у Oxytricha nova, во время диминуционных процессов происходят многочисленные инверсии, захватывающие кодирующие участки (Hoffman, Prescott, 1996). Только в таком перестроенном виде ген приобретает функциональную значимость.
Сохранение способности опухолевых клеток к дифференцировке при разных условиях их пролиферации
Несмотря на то, что злокачественной трансформации подвергаются недифференцированные делящиеся клетки, образовавшаяся популяция опухолевых клеток, как правило, сохраняет способность к цитодифференцировке. Эта способность обычно находится в обратной зависимости с интенсивностью пролиферации популяции опухолевых клеток и может поэтому служить показателем злокачественности популяции, т.е. чем выше дифференцировка в популяции опухолевых клеток, тем ниже ее злокачественность, определяемая преимущественно по критериям «темп роста», «инвазивность» и «способность к метастазированию».
Как было показано в ряде исследований, злокачественный рост может быть не только прогрессирующим, но может и регрессировать, при чем нередко утрата признаков злокачественности сопровождается повышением дифференцировки в популяции опухолевых клеток (Швембергер, 1976; 1987; Lotem, Sachs, 2002). Представляет интерес, насколько зависит и зависит ли вообще способность опухолевых клеток к повышению дифференцировки и утрате злокачественности от изменений кариотипа опухолевых клеток. Представляет существенный интерес, насколько способность опухолевых клеток к дифференцировке и утрате злокачественности зависит от генетической изменчивости, которая происходит при злокачественной трансформации и дальнейшей прогрессии опухоли. Опыты, проведенные в 70-х годах Минц (Mintz, Cronmiller, 1978) с клетками тератокарциномы мыши показали, что после введения опухолевых клеток в бластоциста продолжалось их нормальное развитие, при этом часть потомства оказалась химерной. Кариологическое исследование показало, что использованные клетки тератокарцином были анеуплоидными с отсутствием Y-хромосомы, а это означает, что анеуплоидия не помешала клеткам утрачивать злокачественность и дифференцироваться в нормальные ткани. Также было показано, что реверсия к норме может сопровождаться потерей клетками определенных хромосом (Bloch-Shtacher, Sachs, 1976), превращением дипло ид но-тетра пройд ной популяции в диплоидную (Zuna, Lehman, 1977), а также происходить при сохранении полиплоидного модального класса (Dexter, 1981). Изучение сарком показало, что злокачественные клетки могут приобрести признаки незлокачественных клеткок после сегрегации определенных хромосом (Sachs, 1995), а в других типах клеток - путем специфических хромосомных изменений в результате гибридизации различных типов клеток (Klein, 1981; Harris е.а., 1969).
При изучении дифференцировки различных линий стволовых клеток при гематопоэзе и способности нормальных клеток индуцировать дифференцировку при лейкемии было обнаружено, что клетки миелоидной лейкемии in vitro могут быть индуцированы к дифференцировке в неделящиеся зрелые гранулоциты или макрофаги добавлением различных цитокинов (Lotem, Sachs, 2002а). Однако авторы отмечают, что что разные клоны клеток лейкемии имели разные блоки в способности подвергаться дифференцировке. Ранее было показано, что клетки миелоидной лейкемии могут быть индуцированы к нормальной дифференцировке не только в культуре, но и in vivo (Lotem, Sachs, 1978; 1988). После введения этих клеток в эмбрион мыши они участвовали в нормальном гематопоэзе и были обнаружены у здоровых взрослых животных (Gootwine et al., 1982; Webb et al., 1984). Эта способность опухолевых клеток лейкемии не коррелировала с количеством хромосомных нарушений (Sachs, 1987). Это может означать, что патологическая програма развития клеток миелоиднои лейкемии может быть репрограммирована эпигенетически путем соответствующей дифференцировки цитокинами. Также было показано, что в качестве индукторов дифференцировки миелодных клеток могут выступать и другие компоненты: различные химические вещества, в настоящее время использующиеся в химиотерапии опухолей {цитозинарабинозид, метатрексат и др.), облучение и глюкокортикоидные гормоны (Marks, Rifkind, 1978). При высоких дозах эти компоненты вызввают гибель клеток индукцией в них апоптоза, тогда как низкие дозы могут индуцировать дифференцировку. Однако в разных клонах лейкемии требуется различное сочетание этих компонентов. Кроме химиотерапевтических компонентов дифференцировку в клетках миелоиднои лейкемии также могут индуцировать такие вещества как инсулин, бактериальные липополисахариды, форболовый эфир, ретиноиды, витамин ДЗ или их различные сочетания (Sachs, 1978; 1982; Degos, Wang, 2001). Были выявлены подходящие индукторы дифференцировки и для других типов опухолей. Например, меланома может быть индуцирована комбинацией интерферона В и мезерина (Leszczyniecka et al., 2001), клетки опухоли простаты человека - обработкой интерлейкина 6 или сАТР (Deeble et al., 2001) и др. Таким образом, приведенные данные показывают, что опухолевые клетки могут быть эпигенетически репрограммированы в незлокачественные с помощью индукции дифференцировки.
На основании этих данных можно сделать вывод, что существуют различные пути генной экспрессии, приводящие к дифференцировке, и если генетические изменения супрессируют индукцию дифференцировки клетки по одному пути, то существуют альтернативные пути, по которым клетка может прийти к дифференцировке.
Представляют интерес исследования способности опухолевых клеток к повышению дифференцировки и утрате злокачественности при их трансплантации в иммунопривилегированные места организма, в частности, в переднюю камеру глаза (ПКГ). В опытах по трансплантации опухолевых клеток нескольких мышиных перевивных линий скелетных мышц (рабдомиосарком) в ПКГ, проведенных И.Н.Швембергер с сотр. (1987), было показано, что и повышение дифференцировки опухолевых клеток и утрата ими злокачественности может наблюдаться в заданных экспериментальных условиях у анеуплоидных клеток. Это означает, что увеличение числа Ify хромосом не является препятствием для повышения дифференцировки опухолевой клетки. В связи с этим представляет интерес как влияет на способность опухолевых клеток к дифференцировке другие типы генетической изменчивости, в частности, перестройки, генетического аппарата клетки, выявляемые методами ПЦР-фингерпринта.
Индукция дифференцировки опухолевых клеток и морфологическое исследование опухолей
Последнее десятилетие ознаменовалось бурным изучением молекулярных механизмов апоптоза как в физиологических условиях, так и при злокачественном росте. В результате этих исследований было выявлено большое значение в апоптозе системы Fas-рецептора и Fas-лиганда (Барышников, Шишкин, 2002).
В настоящее время выделяют два основных пути апоптоза - рецептор-зависимый сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки и митохондриальный путь. Наиболее изученной группой рецепторов гибели клетки является суперсемейство рецепторов факторов некроза опухоли (tumor necrosis factor receptors, TNFRs). Среди членов этого суперсемейства важное место занимает Fas-рецептор (Fas/Apo-1/CD95) - трансмембранный белок I типа, содержащий «домен смерти» (Itoh, Nagata, 1993). Fas опосредует апоптоз, связываясь с моноклональными антителами или с лигандом, который экспрессируется на клеточных мембранах или присутствует в растворенной форме. Fas-лиганд (FasL) является членом суперсемейства лигандов факторов некроза опухоли (tumor necrosis factors, TNFs), которые являются мембранными гликопротеидами II типа и относятся к цитокинам (Cosman, 1994). Суперсемейство лигандов TNF вовлечено в индукцию секреции цитокинов, регуляцию повышения экспрессии молекул адгезии, активационных антигенов и ко-стимулирующих белков, а также всех известных усиливающих и регулирующих сигналов, которые появляются во время иммунного ответа. Подобно TNF-лиганду Fas-лиганд может освобождаться от клеточной поверхности и быть физиологически активным в растворенной форме. Растворимая форма Fas-лиганда может быть результатом секреции или протеолиза и действовать аутокринным или паракринным образом.
Система Раэ-рецептор/Раэ-лиганд (Fas/FasL) - одна из основных генетических систем, которая может осуществлять включение в клетках программы апоптоза (Lynch et al., 1995). При реализации механизма апоптоза активную роль играет семейство каспаз, а также киназы, представляющие собой стресс-активированные белки (Philchenkov et al., 2004). Активированные каспазы расщепляют белки, идентифицированные как субстраты каспаз. Мишенями активированных каспаз или их субстратами являются сигнальные протеины. Одна роль каспаз заключается в инактивации протеинов, которые защищают клетку от апоптоза. С другой стороны, каспазы участвуют в апоптозе через прямое разрушение клеточных структур, что иллюстрируется при деструкции ядерных ламин - белков, которые лежат в основе ядерных мембран и участвуют в организации хроматина. Каспазы также участвуют в реорганизации клеточных структур непрямым путем через расщепление протеинов, участвующих в регуляции цитоскелета. В то же время каспазы участвуют в диссоциации регуляторных и эффекторных доменов (инактивации протеинов, участвующих в репарации ДНК, мРНК-сплайсинга и ДНК-репликации).
Центральным компонентом системы контроля за апоптозом является белок р53. При этом происходит быстрое увеличение экспрессии р53 и переход в функционально-активное состояние. р53 запускает ряд внутриклеточных процессов, ведущих к самоубийству клетки. Эффективным ингибитором клеточной смерти в различных клеточных типах, включая Т- и В-клетки, является продукт гена bcl-2, который может быть компонентом физиологического механизма, контролирующим выживание и смерть лимфоцитов. Кроме того, экспрессия Fas-рецептора регулируется рядом других клеточных факторов (CD2, CD4, CD8 и др.), а также цитокинами и гемопоэтическими факторами роста.
Fas выявляется в большинстве типов клеток человека (French et al., 1996). Экспрессия FasL выявлена также в большом количестве тканей, но на низком уровне. Больше всего она представлена в клетках иммунной системы, селезенке, тимусе, активированных Т- и В-лимфоцитах, натуральных киллерах и нейтрофилах (Tanaka et al., 1995; French et al., 1996). Имеются данные, что именно от экспрессии FasL в опухолевых клетках зависит сопротивление опухолей иммунной системе организма и, следовательно, само развитие и течение заболевания. Благодаря экспрессии FasL опухолевые клетки могут убивать лимфоидные клетки путем Fas-опосредованного апоптоза (Houston et al., 2003). Таким образом, именно за счет экспрессии FasL опухоли могут обеспечивать себе защиту от лимфоцитов и таким образом приобретать иммунологическую привилегированность. В ряде исследований были выявлены в опухолях как FasL-положительные, так и FasL-отрицательные участки. Такие участки, как правило, различаются по количеству инфильтрирующих их лимфоцитов. Количество лимфоцитов в FasL-положительных участках значительно меньше, чем в FasL-отрицательных. Показано также, что появлению в опухолевых клетках FasL обычно предшествует утрата ими Fas (Hug, 1997; Pinkoski, Green, 2000). Эти данные говорят в пользу целесообразности применения клонального анализа для исследования злокачественных опухолей и прогнозирования их взаимоотношений с иммунной системой организма, который бы позволил выявить гетерогенность опухолей и по экспрессии Fas, и по экспрессии FasL. Для выявления экспрессии Fas и FasL адекватным методом является метод обратно-транскриптазной ПЦР (ОТ-ПЦР) (Leeetal., 1999; Radfaretal., 2005).
Взаимоиндукция апоптоза в клоповых линиях гепатомы МГ-22а и саркомы J-774 мыши и сингенными спленоцитами
Клетки популяции и клонов гепатомы МГ-22а были трансплантированы в подкожную соединительную ткань (ПСТ) и в переднюю камеру глаза (ПКГ).
Девять опухолей из ПСТ были исследованы морфологически. Большинство опухолей инкапсулированы и не спаяны с окружающими тканями. Опухоли бугристые, средней плотности, поверхность их разреза бело-розового цвета. Три опухоли дали метастазы в окружающие ткани -22/6, 525 и 544. Морфологические характеристики опухолей, выросших в ПСТ, довольно сходны (рис. 8). Большая часть опухоли состоит из низкодифференцированных клеток с темными ядрами неправильной формы. Эти клетки среднего размера, содержат крупные гиперхромные ядра и узкий ободок цитоплазмы. Клетки не образуют каких-либо структур, ядерно-цитоплазматическое отношение у всех клеток достаточно велико. По направлению к периферии опухолевых узлов клетки увеличиваются в размерах за счет цитоплазмы, которая нередко состоит сплошь из прозрачных вакуолей. У опухолей из ПСТ 22/5, 22/8, 525, 543 и 544 среди сплошных полей низкодифференцированных клеток встречаются отдельные участки, состоящие из более крупных клеток, содержащих структурированные ядра с хорошо различимыми ядрышками. Митозы распределяются по опухоли неравномерно, число их уменьшается в участках, в которых гепатоциты имеют признаки гипертрофии и расположены вблизи очагов некроза.
После трансплантации клеток клоновых линий и общей популяции гепатомы МГ-22а в ПКГ мышей линии СЗНА выросла и была исследована 41 опухоль. Опухоли по морфологическим признакам были разделены на 2 группы - недифференцированные опухоли и опухоли с элементами дифференцировки (рис. 9).
20 недифференцированных трансплантатов в ПКГ морфологически представляли собой, как правило, сплошные поля клеток с полиморфными ядрами, содержащими неструктурированный или слабоструктурированный хроматин (рис. 9а, б). Ядра окружены узким ободком цитоплазмы, изредка встречаются фигуры митозов. Иногда встречаются переплетающиеся пласты клеток с мелкими гиперхромными ядрами. Для низкодифференцированных опухолей характерно почти постоянное присутствие полей некрозов. Поля некрозов бывают двух видов - или же они гомогенные, эозинофильные, или же - на эозинофильном фоне встречаются россыпи мелких окрашенных гематоксилином фрагментов ядер. В некоторых трансплантатах могли быть обнаружены пласты вытянутых параллельно расположенных клеток, имеющих слабо структурированные ядра и плохо различимую цитоплазму. В таких пластах группы клеток отделены друг от друга параллельно расположенными коллагеновыми волокнами.
Элементы дифференцировки были обнаружены у 21 исследованной опухоли из ПКГ. Очаги цитотмпической дифференцировки представляют собой сплошные неструктурированные пласты достаточно крупных опухолевых клеток (рис. 9в, г). Клетки содержат ядра с отчетливо видимыми ядрышками и глыбками хроматина. Цитоплазма в таких клетках эозинофильная, светлая, обильная; ядерно-цитоплазматичнекое отношение небольшое. Фигуры митозов встречаются достаточно часто. Нередко опухоли содержат структуры, которые можно расценить как гистотипическую дифференцировку. В таких участках опухолей клетки располагаются в виде псевдодолек, окруженных тонкими коллагеновыми волокнами. Иногда рядом с очагами дифференцированных гепатоцитов располагаются небольшие группки мелких, с угловатыми гиперхромными ядрами клеток (по 8-10), окруженные коллагеновыми волокнами. Нередко можно обнаружить пласты, состоящие из мелких веретеновидных клеток с неструктурированными ядрами и цитоплазмой, ориентированные в одном направлении и напоминающие пласты соединительной ткани.
Полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК в клетках клонов гепатомы мыши МГ-22а, выявленный методом RAPD-ПЦР, при разных условиях культивирования in vivo ДНК из опухолей, выросших в ПСТ и ПКГ, была исследована методом RAPD-ПЦР с тремя праймерами (рис. 10-18). В результате были получены амплифицированные фрагменты ДНК в диапазоне длин от 300 до 2800 п.н. Сравнение фингерпринтов АФ-ДНК клонов, полученных in vivo, с фингерпринтами АФ-ДНК соответствующих клонов гепатомы МГ-22а in vitro, позволило зарегистрировать следующие изменения: появление новых амплифицированных фрагментов, исчезновение фрагментов, свойственных основной популяции, изменение местоположения фрагментов, а также изменения интенсивности их свечения в ультрафиолете по 23 амплифицированным фрагментам ДНК. Интересно отметить, что общее количество таких изменений на фингерпринтах как появление нового амплифицированного фрагмента ДНК и увеличение интенсивности свечения, практически совпадало с общим количеством таких изменений как исчезновение фрагментов и уменьшение интенсивности свечения. Изменения были выявлены у 80 % опухолей в основном с одним из трех праймеров - 447. Остальные два праймера не показали значительных различий на фингерпринтах различных опухолей. Согласно данным, полученным с помощью всех трех праймеров, наиболее вариабельными были фрагменты ДНК, состоящие из 850, 900 и 950 п.н.
Клетки основной популяции МГ-22а после культивирования in vivo имели незначительные изменения на фингерпринтах АФ ДНК в сравнении с клетками in vitro, показывая от 0 до 1 изменений. Исключение составила только одна опухоль, выросшая в ПКГ. Клетки же изученных клоновых линий можно было разделить на 2 части - половина клонов {22/4, 22/5, 22/7 и 22/8) показывали небольшую изменчивость на фингерпринтах АФ ДНК в сравнении со своими клетками in vitro, другая же часть клонов, наоборот, характеризовалась высокой изменчивостью при культивировании in vivo (22/6, 513, 525, 544), т.е. практически все опухоли этих клонов, выросшие в ПСТ или ПКГ, имели значительное количество генетических изменений.
![Изменение показателей пролиферации и апоптоза в условиях лимфопении и восстановления Т-клеточного пула после аутологичной трансплантации стволовых кроветворных клеток [Электронный ресурс]](/i/i/4340/208452.png "Изменение показателей пролиферации и апоптоза в условиях лимфопении и восстановления Т-клеточного пула после аутологичной трансплантации стволовых кроветворных клеток [Электронный ресурс] Пронкина Наталья Викторовна")
