Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы основной акцент в изучении взаимодействия эпидермального Фактора роста ( ЭфР ) с клеткой сместился в сторону исследования, его рецептора,' поскольку стало ясно, что именно этот трансмембранний гликопротеин, обладающий ЭФР-зависимои тирозинкиназной активностью, играет решающую роль в реализации ЗФФекта ЭФР. Связывание ростового Фактора . с рецептором приводит как к автоФосФорилированию последнего, так и к ФОСФорилированию целого ряда клеточных белков по . тирозину. В свои очередь сам рецептор является субстратом для других протеинкиназ, ФосФорилирующих его по остаткам серина и треонина. Анализ связывания ЭФР с клетками продемонстрировал существование двух классов рецепторов, отличающихся по своему сродству к ЭФР. Высказывались многочисленные предположения о молекулярных основах этого' явления и связи его с состоянием ФосФорилирования рецепторов, однако окончательных данных по этому вопросу нет.
С другой стороны, в уже ставших классическими работах
( WiUinghdm, Pastah, 1981 ) ПОКаЗЭНО, ЧТО ВЗаИМОДвЙСТВИЭ
ЭФР с клеткой не ограничивается связыванием с рецептором' на плазматической мембране: ЭФР-рецэпторные комплексы поступают внутрь клетки ' посредством рецептор-опосредованного зндоцитоза (РОЭ), попадая сначала в эядосомальный KOMnapTMeinv а затем в лизосомы. С эндосомзми связана диссоциация ЭФР и рецептора, имеющая место во многих типах клеток, а также сортировка рецепторов ЭФР, направляемых на деградацию или рециклирующих обратно в плазматическую мембрану.
Значение РОЭ до сих пор неясно. Многие склонны рассматривать его только как механизм десенситизации клеток, однако есть данные о важности интернализации, особенно на начальных . этапах зндоцитоза, для реализации действия ЭФР. Однако данные о состоянии интернализовзнных рецепторов неполны и противоречивы.
Как следует из вышеизложенного, рецепторы ЭфР могут быть весьма неоднородны да своим свойствам.Возможно, именно эта гетерогенность определяет различие как внутриклеточной судьбы ЭФР-редаптора, так и реакций клеток на ЭФР в зависимости от контекста. Однако неизвестно, каким образом различные элементы гетерогенности связаны с механизмом передачи ригнала.
Цели и задачи исследования.
-
Сравнить внутриклеточную судьбу ЭФР в клетках А431 как непосредственно после стимуляции интернализации ( ранний эндоцитоз ), так и после длительной инкубации клеток в среда, содержащей ЭФР ( поздний эндоцитоз ).
-
Проанализировать участие высокоаФФИнных и низкоэффинных рецепторов ЭфР в раннем и позднем зндоцигозе.
-
Сравнить статус ФОСФорилирования рецепторов ЭФР, локализованных на плазматической мембране и внутри клетки.
Научная новизна работы. _ Проведен сравнительный , анализ интернализации и компартмеятализации ЭФР в клетках А431 как непосредственно посла стимуляции зндоцитоза, так и посла длительной инкубации клэток с ЭФР. Показано, что во втором случае имеет место замедление поступления ЭФР в лизосомы. Обнаружено, что степень выраженности этого ЗФФвкта пропорциональна концентрации ЭФР, использованной для длительной инкубации.
На плазматической мембране клеток А431 показано наличие двух. классов рецепторов ЭФР,. различающихся по своему сродству к ЭФР. Обнаружено, что после длительной инкубации клеток 'А431 в среде, содержащей высокие концентрации ЭФР, количество рецепторов на' плазматической мембране уменьшается в 2-4 раза. Преимущественной интернализации рецепторов какого-нибудь одного класса не обнаружено.
Впервые прямо показано, что как легкие, так и тяжелые эндосомы клэток А431 содержат. рецепторы' ЭФР,
ФосФорилированные по тирозину, причем тяжелые эн,цос.эмы более гетерогенны по количеству ФосФорилированных го тирозину рецепторов в расчете на одну везикулу, чем легкие. Применение бифункциональных сшивающих реагентов, непроникающих и проникающих через плазматическую мембрану, позволило продемонстрировать повышенное содержание ФОСФотирозина в интенализованных рецепторах го сравнению с поверхностными. ФосФоаминокислотный анализ показал наличие, по крайней мере,двух групп интернализованных рецепторов: ФосФорилированных преимущественно го тирозину и ФосФорилированных преимущественно по серияу и треонину.
Научно-практическое значение работы. Представленные данные по раннему и позднему .эндоцигозу необходимы для понимания механизмов Функционирования зндосомального аппарата клеток, з также связи гетерогенности рецепторов с определением внутриклеточной судьбы ЭфР-рецепторных комплексов.
Метод сдвига плотности зндосом в градиенте- Перколла с помощью антител и иммунозолота мошт быть применен для анализа содержания специфических антигенов в различных компартментах клеток.
Применение бифункциональных реагентов, проникающих и непроникающих через биологические мембраны, позволяет' проводить сравнительный анализ распределения любых лиганд-рецепторных комплексов, локализованных внутри клетки и на ее мембране.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались «а Всесоюзном совещании "Функциональная морфология клетки" ( С.-Петербург, 1991 )', 31-вои." ежегодной ' конференции Американского Общества по маточной биологии { Бостон, США, 1991 ), 1-вом. Всемирном конгрессе "Клеточная и молекулярная биология"( Париж, Франция, 1991 ), Совещании "Биология клетки в культуре" { С.-Петербург, 1992 ) и на научном сёмипзро лаборатории физиологии клеточного цикла Института цитологии РАН.
Публикации. Па теме диссертации опубликовано 7 работ.
Объем работы. Диссертация изложена на VV# 'страницах машинописного текста и состоит . из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственны! исследовании, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего У/б" публикаций. Материалы диссертации иллюстрированы 14 рисунками и 2 таблицами.
