Содержание к диссертации
Введение
1. Список сокращений 3
2. Введение 5
3. Обзор литературы 11
4. Цель работы и задачи 28
5. План экспериментальных исследований 29
6. Материалы и методы 33
7. Результаты собственных исследований 41
8. Обсуяедение 58
9. Заключение 62
10. Выводы 66
11. Благодарности 67
12. Список литературы 68
- Обзор литературы
- План экспериментальных исследований
- Материалы и методы
- Результаты собственных исследований
Введение к работе
Актуальность проблемы. На рубеже XX и XXI веков зародилась новая интегральная медико-биологическая дисциплина – нейроиммуноэндокринология, которая объединяет и координирует исследования, направленные на изучение механизмов взаимодействия основных регулирующих систем – нервной, эндокринной и иммунной (Акмаев И.Г., 1996, 1999; Basedovski et al, 1996).
В нейроиммуноэндокринную систему входят гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система, гипоталамо-гипофизарная нейросекреторная система, а со стороны иммунной системы – комплекс цитокинов – сигнальных молекул, вырабатываемых клетками лимфоцитарного и моноцитарно-макрофагального ряда.
Единство регуляторных систем наиболее ярко проявляется при состояниях, угрожающих целостности и жизни организма, например воспалительной реакции. Цитокины, как главные медиаторы воспаления, оказывают разнообразные эффекты на нейроэндокринные нейроны гипоталамуса и клетки эндокринных желез, изменяя активность гормональных систем, которые, в свою очередь, компенсируют вызванные воспалением нарушения. Гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система и ее конечный продукт – глюкокортикоиды являются главным биологическим инструментом адаптации организма к стрессу различной природы, в том числе и «иммунному».
Гипоталамо-гипофизарная нейросекреторная система, менее изученная система, состоит из крупноклеточных ядер гипоталамуса, нейроны которых синтезируют гормон вазопрессин. Значение системного вазопрессина при воспалении определяется, в первую очередь, его потенциальной возможностью компенсировать потери воды, обусловленные симптомами воспаления. На сегодняшний день описан широкий спектр эффектов антидиуретического гормона на метаболизм, температуру тела, поведение, сосудистый тонус, а также локальных - ауто\паракринных. (Murphy et al., 1993; Гриневич В.В., Поленов А.Л., 1994; Гриневич В.В. и др., 1997, 2003; Verbalis, 1999; Wang et al., 1998; Hurbin А et al, 2002).
Из всего многообразия этиологических факторов воспаления (бактерии, вирусы, простейшие) в настоящее время приобретает актуальность изучение влияния бактериального эндотоксина липополисахарида (ЛПС) на гипоталамо-гипофизарную нейросекреторную систему. ЛПС является одним из наиболее мощных бактериальных антигенов, приводящих к запуску воспалительной реакции через специфические рецепторы (CD14, TLR4) на макрофагах, дендритных клетках и др. (Medzitov, Janeway., 1997; Akira et al., 2001; von Meyenburg et al., 2004). При этом происходит усиление секреции и выброс различных медиаторов воспаления, изменяющих тканевой метаболизм, микроциркуляцию, активирующих Т- и В- лимфоциты, которые в свою очередь вырабатывают каскады цитокинов – интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-6 (ИЛ-6) и фактор некроза опухолей (ФНО-), осуществляющие межклеточную кооперацию при иммунном ответе. В работах как наших, так и зарубежных авторов показано на примере гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, что ЛПС непосредственно не изменяет активности нейросекреторных клеток и клеток аденогипофиза, а является мощным индуктором синтеза ИЛ-1 – основного медиатора эффектов бактериального эндотоксина липополисахарида. (Гриневич В.В. и др., 1999; Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2003; Chrousos, 1995; Turnbull, Rivier., 1999).
Цель исследования: изучить морфофункциональное состояние гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы у крыс и факторы, регулирующие секрецию крупноклеточного вазопрессина, в условиях острого воспаления в эксперименте.
Задачи исследования:
-
Исследовать транскрипцию, трансляцию вазопрессина в крупноклеточных нейронах гипоталамуса и его секрецию в кровь у крыс после однократной внутрибрюшинной инъекции бактериального эндотоксина липополисахарида в низкой дозе (25 мкг\100г веса) и высокой дозе (250мг\100г веса) в динамике (0, 30мин, 3ч, 6ч).
-
Изучить эффект однократной внутрибрюшинной инъекции бактериального эндотоксина липополисахарида (250мг\100г веса) на экспрессию и секрецию крупноклеточного вазопрессина в условиях физиологической осмотической стимуляции.
-
Исследовать транскрипцию, трансляцию вазопрессина в крупноклеточных нейронах гипоталамуса и его секрецию у адреналэктомированных и ложнооперированных крыс после однократной инъекции бактериального эндотоксина липополисахарида в дозе 25 мкг\100г веса.
Научная новизна. В настоящем исследовании получены новые данные о морфофункциональной характеристике гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы у крыс в условиях острого воспаления (в эксперименте).
Проведена сравнительная оценка влияния однократного внутрибрюшинного введения низких и высоких доз липополисахарида (25мкг\100г и 250 мкг/100г) на синтез и секрецию крупноклеточного вазопрессина у крыс в базальных условиях, так и при физиологической осмотической стимуляции гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы с помощью морфологических, электронно-микроскопических, иммуноцитохимических методов исследования.
Используя метод авторадиографической гибридизации «in situ» выявлен новый «неосмотический» механизм регуляции крупноклеточного вазопрессин-ергического нейрона в условиях острого воспаления (липополисахарид, 250мкг\100г).
Получены достоверные данные об усилении синтеза и секреции крупноклеточного вазопрессина при однократном интраперитонеальном введении липополисахарида (25 мкг\100г) на фоне двусторонней адреналэктомии, что свидетельствует подавляющей роли глюкокортикоидов в регуляции крупноклеточного вазопрессин-синтезирующего нейрона гипоталамуса при воспалении.
Теоретическая и практическая значимость. Воспалительный процесс, имеющий глубокие эволюционные корни, неизменно привлекает специалистов в области биологии и медицины, как с точки зрения своей феноменологии, так и практического здравоохранения. Все исследования, проливающие свет на механизмы его реализации и понимания роли в этих механизмах взаимодействия основных регулирующих систем организма, представляются важными в своей концептуальной основе и значимыми для практической медицины, поскольку подводят теоретический базис к разработке новых диагностических критериев и терапевтических подходов к лечению и профилактике воспалительных процессов.
Внедрение в практику. В результате проведенного экспериментального исследования получены данные о морфофункциональной характеристике гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы в условиях острого воспаления (в эксперименте), которые используются в учебном процессе и научной работе кафедры гистологии и эмбриологии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ РосЗдрава РФ.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:
-
Всероссийской конференции с международным участием «Нейроэндокринология-2003» 23-25 сентября 2003 г.-Санкт-Петергбург, Россия.
-
I Всероссийской конференции «Физиология иммунной системы» 11-14 октября 2003г, Сочи, Дагомыс.
-
Всероссийской научной конференции «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы», Москва, 2003г.
-
3-ем Российском Конгрессе по патофизиологии с международным участием, Москва, 9-12 ноября 2004г.
-
VII Всероссийской конференции по патологии клетки, Москва, 2005г.
-
Межкафедральном заседании сотрудников кафедр гистологии и эмбриологии педиатрического и лечебного факультетов ГОУ ВПО РГМУ РосЗдрава.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 1 статья – в журнале, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из введения, 8 глав, включающих обзор литературы и обсуждение полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя используемой литературы, включающего 71 отечественных и 144 зарубежных источников.
База проведения исследования. Кафедра гистологии и эмбриологии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ МЗ РФ, лаборатория электронной микроскопии ЦНИЛ ГОУ ВПО РГМУ МЗ РФ под рук. член-корр. РАМН, д.м.н., профессора Банина В.В., лаборатория гормонов и рецепторов под рук. д.б.н. П.М.Рубцова Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва, Россия.
Обзор литературы
На рубеже XX и XXI веков зародилась новая интегральная медико-биологическая дисциплина - нейроиммуноэндокринология, которая объединяет и координирует исследования, направленные на изучение механизмов взаимодействия основных регулирующих систем — нервной, эндокринной и иммунной (Basedovski et al, 1996, Акмаев, 1996, 1999). В нейроиммуноэндокринную систему входят гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система (ГГАС), гипоталамо-гипофизарная нейросекреторная система (ГГНС), а со стороны иммунной системы — комплекс цитокинов — сигнальных молекул, вырабатываемых клетками лимфоцитарного и моноцитарно-макрофагального ряда. Единство регуляторных систем наиболее ярко проявляется при состояниях, угрожающих целостности и жизни организма, например воспалительной реакции. Цитокины, как главные медиаторы воспаления, оказывают разнообразные эффекты на нейроэндокринные нейроны гипоталамуса и клетки эндокринных желез, изменяя активность гормональных систем, которые, в свою очередь, компенсируют вызванные воспалением нарушения. ГГАС и ее конечный продукт — глюкокортикоиды являются главным таким биологическим инструментом адаптации организма к стрессу различной природы, в том числе и «иммунному». ГГНС, менее изученная система, состоит из крупноклеточных ядер гипоталамуса, нейроны которых синтезируют гормон вазопрессин (ВП). Значение системного ВП при воспалении определяется, в первую очередь, его потенциальной возможностью компенсировать потери воды, обусловленные симптомами воспаления. На сегодняшний день описан широкий спектр эффектов ВП на метаболизм, температуру тела, поведение, сосудистый тонус, а также локальных ауто\паракринных. [Гриневич В.В., Поленов А.Л., 1994; Гриневич В.В. и др., 1997; Murphy et al., 1993; Verbalis,1999; Wang et al., 1998; Hurbin A et al, 2002].
Последующий литературный обзор посвящен описанию и анализу результатов исследований, отражающих основы гистофизиологии ГГНС (ВП-эргической части системы), а также ее роли и регуляции в условиях острого воспаления. Гипоталамо-гипофизарная нейросекреторная система (ГГНС). ГГНС состоит из двух отделов центрального - крупноклеточные ядра гипоталамуса и периферического - задняя доля гипофиза (ЗДГ). Гипоталамус. Крупноклеточные нейросекреторные ядра. Крупноклеточные ВП-эргические нейроны сосредоточены в паравентрикулярных (ПВЯ) и супраоптическом (СОЯ) и ряде добавочных ядер гипоталамуса [Боголепова И.Н., 1968; Войткевич А.А., Дедов И.И., 1972; Гриневич В.В., Поленов А.Л., 1996; Гриневич В.В., 1997; Swanson, Sawchenko, 1983]. Аксоны этих нейронов, спускаясь в составе ножки гипофиза, заканчиваются терминалями в его задней доле, откуда ВП выделяется в системный кровоток. Молекулярная биология крупноклеточного нейрона гипоталамуса. Ген ВП высокогомологичен у представителей разных отрядов млекопитающих и состоит из трех экзонов, разделенных двумя интронами. В геноме имеется только одна его копия.
Общая протяженность гена ВП варьирует от 1200 до 2000 пар оснований, в зависимости от видовой принадлежности. Первый экзон кодирует синтез сигнального пептида, собственно молекулы ВП, трехаминокислотный линкер (глицин-лизин-аргинин), являющийся сигналом для эндопротеазы, и первых 9 аминокислот N-конца молекулы нейрофизина, второй — наиболее консервативный участок нейрофизина (с 10 по 76 аминокислоты), а третий экзон - С-конец молекулы нейрофизина и гликопептид, значение которого остается не ясным [Young W.S., 1992; Gainer Н., Wray S., 1992, 1994]. Как и во многих других генах, в нетранслируемых областях гена ВП имеются участки, определяющие его экспрессию. Так, 5 -участок имеет цАМФ- и глюкокортикоид-отвечающий элементы, соответственно расположенные в позициях -227 и -662 пар нуклеотидов от точки начала транскрипции и оказывающих стимулирующее и ингибирующее влияния на транскрипцию гена ВП. [Young, 1992]. Наряду с этим, концевые участки гена ВП содержат последовательности, ответственные за формирование регуляторных элементов матричной РНК (мРНК). Например, к последним относится участок в 3 - нетранслируемой области, ответственный за кэппинг (capping) 5 -конца мРНК ВП, т.е. присоединение к нему в процессе транскрипции 7- метилгуанозиновых остатков, которые в дальнейшем связываются с молекулой мРНК. В 5 - нетранслируемом участке имеется сигнальный участок для полиаденилирования 3 -конца мРНК. Обычно этот участок представлен последовательностью ААТААА. Соответствующая ей последовательность РНК ААУААА выполняет сигнальную роль для эндонуклеазы, которая разрезает гетеронуклеарную РНК (гнРНК) 10-15 основаниями ниже. Затем второй фермент, поли-(А)-синтетаза, добавляет к этой РНК поли-(А)-хвост, длиной от 100 до 200 оснований. Основной смысл кэппинга и полиаденилирования 3 - конца мРНК - стабилизиция мРНК и участие в ее транспорте и связывании с рибосомами. Трансляция ВП происходит одновременно с его белком-носителем -нейрофизином II, после чего в аппарате Гольджи осуществляется их упаковка (гликозилирование и деградация) в элементарные нейросекреторные гранулы. Гранулы транспортируются по аксону, достигая его терминали, и выделяются в системный кровоток путем экзоцитоза по Са +-зависимому механизму, вызываемому деполяризацией мембраны [Thirion S. et al., 1999]. Согласно математической модели функционирования ГГНС [Fitzsimmons et al., 1992, 1994] уровни ВП в крови коррелируют с транскрипционной активностью, но не с процессами трансляции.
План экспериментальных исследований
1) Контроль (п=7). Крысы получали и/п инъекции стерильного физиологического раствора (ЗООмкл). Инъекции производили 1 мл (инсулиновыми) одноразовыми шприцами. 2) Однократное введение ЛПС. Непосредственно перед и/п инъекцией ЛПС (250мкг/100г) растворяли в стерильном физиологическом растворе, ЗООмкл которого приходилось на одну инъекцию. Крысы умерщвлялись путем декапитации через: 30 мин после инъекции (п=6), 1 ч (п=6), 3 ч (п=6), 6 ч (п=6), 12ч(п=6). Эффект ЛПС на активность ГГНС в условиях осмотической стимуляции. Экспериментальные группы: 1) Контроль (п=5). Крысы получали и/п инъекции стерильного физиологического раствора (ЗООмкл). 2) 1-я опытная группа (п=17). Однократное введение ЛПС. Крысы умерщвлялись путем декапитации через: 3 ч после инъекции (п=6), 6 ч (п=П). 3) 2-я опытная группа (п=6). Животных данной группы в течение 6 дней подвергали солевой нагрузке; для этого воду в поилках замещали 2% раствором NaCl. 4) 3-я опытная группа (п=14). Животных этой группы на седьмой день солевой нагрузки (2% раствор NaCl) через Зч (п=7) и 6 ч (п=7) после инъекции ЛПС (250 мкгМООг) путем декапитации выводили из эксперимента. Эффект ЛПС на активность ГГНС у адреналэктомированых и ложнооперированных крыс. Животные были разделены на две группы: крысам 1-й группы — (п=20) была произведена двусторонняя адреналэктомия (АДЭ) под комбинированным наркозом (тиопентал натрия, эфир для наркоза).
После операции АДЭ крысы получали 0,9% раствор NaCl для компенсации потерь натрия в отсутствии альдостерона. 2-я группа крыс — (гг=20) подвергалась ложной операции (ЛО). Под комбинированным наркозом крысам производилось вскрытие забрюшинного пространства - животное располагается лежа на животе, производится послойный разрез в паравертебральной области чуть ниже реберной дуги с обеих сторон, затем разведение тканей в этой области с помощью кончиков сосудистого зажима, после чего накладывались послойные швы. Экспериментальные группы: 1). Контроль(п=4) - однократная и/п инъекция ЗООмкл 0,9% р-ра NaCl. 2). Однократное введение ЛПС ложнооперированным (ЛО) крысам. В связи с повышенной чувствительнотью АДЭ жтивотных к ЛПС, дозировка ЛПС была снижена до 25 мкг/ЮОг. Непосредственно перед и/п инъекцией ЛПС растворяли в стерильном физиологическом растворе, ЗООмкл которого приходилось на одну инъекцию. Материал забирали через: 30 мин после инъекции (п=4); 1 ч (п=4); 3 ч (п=4); 6 ч (п= 4). 3). Однократное введение ЛПС адреналэктомированным (АДЭ) крысам проводилось по выше описанной схеме. Материал для исследования забирали через аналогичные промежутки времени. Животных всех экспериментальных групп выводили из эксперимента путем декапитации с помощью гильотины. Кровь собирали, гепаринизировали, центрифугировали, собирали плазму и замораживали при -80С для определения уровней ВП и Na. Для проведения гибридизации in situ мозг быстро извлекали из черепной коробки и целиком замораживались на сухом льду. Гипофиз заливали в среду Tissue Teck (Sacura Finetek Inc.USA), полимеризующуюся при охлаждении (-20С), и замораживали на сухом льду. Затем на криостате изготавливали срезы толщиной 12 мкм, монтировали их на стекла, и хранили при -80 С. Часть материала заливали в парафин (для последующей иммунной гистохимии и световой микроскопии) и эпон (для проведения трансмиссионной электронной микроскопии).
Материалы и методы
Этот метод применялся для выявления и количественной оценки уровней транскрипции (гнРНК) и трансляции (мРНК) гена ВП в крупноклеточных ядрах (ПВЯ и СОЯ) гипоталамуса. Для проведения гибридизации in situ мозг быстро извлекали из черепной коробки и целиком замораживали на сухом льду. В дальнейшем органы хранили в холодильнике при -80С. Краткая характеристика гибридизационных проб. 1) ВП (экзонная проба): фрагмент кДНК длиной 230 нуклеотидов. Соответствует 3-му экзону гена ВП крысы. Клонирован в плазмиде pGEM-4Z. Синтезирована и любезно предоставлена зав. лаборатории гормонов и рецепторов П.М. Рубцовым (институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта). 2) ВП (интронная проба): франмент кДНК длиной 230 нуклеотидов с сайтом рестриктазы Pvu II. Соответствует интрону І ВП-нейрофизинового гена крысы. Клонирован в плазмиде pGEM-3. Синтезирована и любезно предоставлена зав. лаборатории гормонов и рецепторов П.М. Рубцовым (институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта). Приготовление гибридизационных проб на основе клонированных в плазмиды векторов: 1) Линеаризация плазмид соответствующими рестрикционными ферментами и контроль в агарозном геле (1% агароза на ТАЕ буфере). 2) Очищение кДНК с помощью фенол-хлороформной экстрации, осаждение в этаноле и растворение в воде. Концентрация ДНК составляет обычно 1 мкг в мкл. 3) In vitro транскрипция (для синтеза антисмысл овой РНК с матрицы кДНК) проводится при помощи специфических РНК полимераз (SP6, ТЗ или Т7) со следующими реагентами: RNAsin, транскрипционный буфер, ЮОмМ DTT, lOxrNTP. 4) Очищение транскрипта с помощью центрифугирования в фильтрационных сефадексных колонках. 5)
Преципитация пробы РНК с транспортной РНК дрожжей, 5М NaCl и 100% этанолом на сухом льду (30 мин), центрифугирование (30 мин, 40000 об/мин), промывание осадка 70 спиртом и его высушивание. 6) Растворение осадка в TRIS буфере с добавлением 1 ООмМ DTT. Гибридизация мРНК с использованием рибопроб Проводилась согласно стандартному протоколу [Grinevich et ah, 1997; ]. Стекла с криостатными срезами (12 мкм) органов размораживали при комнатной температуре в течение 10 мин, затем фиксировали в 4% параформальдегіде на фосфатном буфере (рН 7,4) 5 мин, отмывали в фосфатном буфере (3 раза по 5 мин) и ацетилировали 10 мин в 0,25% уксусном ангидриде с добавлением 0,1М триэтаноламина на физ. растворе. Затем срезы обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и хлороформе и высушивали при комнатной температуре. После этого на срезы наносили гибридизационный буфер, содержащий 2x106 микрокюри в мкл. пробы, меченой S-35, и инкубировали 12 часов при 55С. После инкубации неспецифическое связывание удалялось путем промывки в стандартном цитратном солевом буфере (4xSSC) с 50% формамидом/250 мМ NaCl при 60С в течение 20 мин, а затем - с добавленной в SSC рибонуклеазой А при 37С в течение 30 мин. Затем проводили длительную промывку срезов в SSC нисходящих концентраций, финальным этапом которой был O.lxSSC при 50С 15 мин. После этого стекла переносились в 70 спирт на 1-2 мин и высушивались при комнатной температуре. Количественный анализ гибридизационных сигналов. Для оценки гибридизационных сигналов срезы экспонировались на высоко-чувствительной авторадиографической (рентгеновской) пленке ВЮМАХ MR (Kodak, IBI, New Heaven, CT, USA) с опытным выбором оптимального времени экспозиции для каждой из проб: 12ч для гнРНК и 15 мин мРНК. После проявления пленки оптическая плотность сигнала определялась с помощью компьютеризированной системы анализа изображений (Imaging Research, St Catherine, Ontario, Canada), используя публичный домен программы анализха изображений Национальных институтов Здоровья США (Интернет сайт: http://www.rsb.Info.nih.gOv/nih-imaQ:e). Оптическую плотность определяли как минимум на 2 последовательных срезах, вычисляли среднее значение для каждой крысы, а потом — для всей группы. Статистическая обработка проводилась с помощью комплексного пакета программ ANOVA, включаюшего тест Fisher a (least significant difference procedure — PLSD). P 0.05 считалось статистически достоверной разницей между экспериментальными группами. Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего. Плотность сигнала (уровни гнРНК и мРНК ВП) представлены в виде абсолютных единиц оптической плотности -пикселях. Приготовление проб, гибридизации и анализ результатов проводились совместно с проф. В.В.Гриневичем в лаборатории гормонов и рецепторов под руководством д.б.н. П.М.Рубцова (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва, Россия).a
Результаты собственных исследований
Инъекция ЛПС в дозе 250 мкгМОО г не приводит к достоверному изменению содержания ВП в плазме крови с тенденцией к снижению через 6 и 12 часов. При этом значимых изменений в концентрации натрия в крови не отмечено (Рис. 1). гнРНК и мРНК ВП в СОЯ и ПВЯ гипоталамуса. В гипоталамусе контрольных животных радиоактивное мечение гнРНК и мРНК ВП было выявлено в мелко- и крупноклеточной частях ПВЯ, СОЯ и добавочных ядер. Помимо этого, мРНК (но не гнРНК) выявлена в супрахиазматическом ядре. (Рис.2). Отличий в оптической плотности метки первичного транскрипта гена ВП ни в крупноклеточной части ПВЯ, ни в СОЯ во всех точках наблюдения выявлено не было. Однако обнаружено небольшое, но статистически значимое (25%, Р 0,01) снижение оптической плотности мРНК ВП в обоих ядрах через 6 и 12 часов после введения ЛПС (Рис. 2). Эффекты острого воспаления (и\п инъекция ЛПС (250 мкгМООг)) на экспрессию и секрецию крупноклеточного ВП в условиях хронической осмотической стимуляции. ВП и Na+ плазмы крови. У крыс, подвергнутых 6-ти дневной солевой нагрузке происходит небольшое нарастание уровней ВП и Na+ которое, однако, не достигает статистически значимой величины. Инъекция ЛПС через 3 часа вызывала 4-х кратный подъем уровня ВП (с 2 ± 0,4 до 7,6± 3,5 пг\мл, Р 0,05) по сравнению с группой солевой нагрузки, без изменений концентраций Na+ (149,78 ± 4,07 и 148, 34 ± 4,54 мМ\л). Через 6 часов после инъекции ЛПС уровень ВП недостоверно превышал контрольный (солевая нагрузка) вдвое (4,87 ± 0,95 пг\мл), а концентрация Na+ оставалась неизмененной (142,1 ± 3,7 пг\мл) (табл 1). Солевая нагрузка вызывает увеличение оптической плотности метки гнРНК ВП в СОЯ и ПВЯ на 46% и 32% соответственно (Р 0,01), по сравнению с контролем (Рис. 3,4). Введение эндотоксина крысам, подвергнутым солевой нагрузке, приводило к небольшому (—10%, НД) нарастанию сигнала в СОЯ и при неизменной ситуации в ПВЯ (Рис. 3,4). МРНК ВП в СОЯ и ПВЯ гипоталамуса.
При изучении плотности мечения мРНК ВП - оказалось, что солевая нагрузка приводила к значимому нарастанию сигнала в обоих ядрах. Так, в СОЯ это увеличение составило 42% (Р 0,01), а в ПВЯ - 27% (Р 0,01). Введение же ЛПС крысам, подвергнутым солевой нагрузке, приводило к слабому снижению уровней мРНК ВП через 3 ч, а через 6ч оно становилось достоверным (Р 0,05). В СОЯ это снижение составило 17%, а в ПВЯ - 19%. (Рис. 3,4). МРНК ВП в здг. Оптическая плотность метки мРНК ВП в ЗДГ крыс, подвергнутых солевой нагрузке, нарастает в 5 раз по сравнению с контролем (Р 0,001). Инъекция ЛПС этим животным приводит через 3 часа к еще большему нарастанию интенсивности мечения (на 41%, Р 0,01 по сравнению с солевой нагрузкой и 7 раз - с контролем, Р 0,001). Однако через 6 ч после инъекции ЛПС определяется достоверное снижение оптической плотности мечения на 45% (Р 0,01) по сравнению с соотносимым контролем (солевая нагрузка), хотя сигнал в 4 раза превышает уровни общего контроля (Р 0,001) (рис 5, 6).
