Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Морфофункциональная характеристика яичников новорожденных в норме и при патологии беременности. Возможные механизмы влияния на состояние органа в репродуктивном периоде (с.9)
1.1 Краткая характеристика эмбрионального развития яичников (с.9)
1.2. Морфология яичников новорожденных (с. 10)
1.3. Фолликулогенез (с. 13)
1.4. Фолликулярные кисты в перинатальном периоде и детском возрасте (с.20)
1.5. Синдром поликистозных яичников (с.24)
1.6. Патология беременности и гормоны. Возможное влияние отклонений их концентрации на яичники плода, формирование репродуктивной системы (с.28)
Глава 2. Материалы и методы исследования (с.34)
2.1.Общая характеристика секционного материала (с.34)
2.2. Гистологическая обработка яичников (с.35)
2.3.Морфометрический и гистохимический анализ (с.36)
2.4. Критерии балльной оценки морфологических особенностей исследованных яичников (с.36)
2.5. Гистохимическая обработка материала (с.43)
2.6. Количественная морфометрическая обработка материала (с.44)
Глава 3. Результаты собственных исследований (с.46)
3.1. Морфология яичников новорожденных и детей первых полутора лет жизни (с.46)
3.2. Морфологическая характеристика примордиальных фолликулов (с.58)
3.3. Гистохимическая характеристика примордиальных фолликулов (с.61)
3.3.1. Концентрация нуклеиновых кислот (с.61)
3.3.2. Ядрышковые организаторы (с.63)
3.3.3. Суммарный белок (с.65)
3.3.4. Активность ферментов в структурах фолликулов и кист в яичниках новорожденных и детей, умерших в раннем детском возрасте (с.69)
3.4. Патологические изменения яичников (с.69)
3.5. Кисты в яичниках новорожденных и детей первых полутора лет (с.85)
3.6. Анализ влияния возраста плода и патологии гестационного процесса на морфометрические показатели, характеризующие яичники (с.94)
3.6.1.Медианы исследованных морфометрических параметров яичников новорожденных различных групп (с.96)
3.7. Возможные механизмы воздействия некомфортных условий развития на пренатальный органогенез яичников и гистофизиологическая классификация яичников новорожденных (с. 107)
Заключение (с. 113)
Выводы (с. 121)
Список литературы (с. 123)
- Морфология яичников новорожденных
- Патология беременности и гормоны. Возможное влияние отклонений их концентрации на яичники плода, формирование репродуктивной системы
- Критерии балльной оценки морфологических особенностей исследованных яичников
- Активность ферментов в структурах фолликулов и кист в яичниках новорожденных и детей, умерших в раннем детском возрасте
Введение к работе
Актуальность проблемы. Репродуктивное здоровье женщин зависит от многих факторов и, в то же время, является одной из важных характеристик медицинского и социального благополучия общества. Оно определяется в значительной мере состоянием важнейшего органа женской половой системы, яичников, зависящим от многих факторов и, прежде всего, характера его развития в ранние периоды онтогенеза. Особенностью развития яичников является то, что его важнейшие структуры, фолликулы, закладываются до рождения. В связи с этим их количество и свойства в репродуктивном периоде в значительной мере предопределяются тем, в каких условиях протекал эмбриональный органогенез, гонад. В настоящее время считается, что причины и важные звенья патогенеза распространенных заболеваний женской половой системы, таких как синдром поликистозных яичников (СПЯ), синдром истощения яичников, других заболеваний, характеризующихся снижением репродуктивных потенций, определяются нарушениями развития репродуктивной системы, в том числе, яичников, в пренатальном периоде онтогенеза системы (Г.Б. Ковальский и соавт., 1996, I. L., Creswell et al., 1997, Э.К. Айламазян и соавт., 2000, Л.А. Самородина и соавт., 2001, В.М. Кеттайл, Р.А. Арки, 2001, М.А. Манухин и соавт, 2004, J.M. Adavs et al., 2004, Г. В. Тагиева и соавт., 2004, S.M. Carlsen et al., 2005, СО. Дубровина, 2006 , P. Матхур, Д. Дженкинс, 2006 и др.). Роль нарушений эмбрионального органогенеза и формирования яичников в детском возрасте в развитии СПЯ, раннем климаксе и других нарушениях репродуктивной и эндокринной функций представляется достаточно вероятной, однако удельный вес этих нарушений и механизмы их реализации в патологический процесс в настоящее время не могут считаться окончательно выясненными (И.И. Дедов и соавт., 2000, Л.Ф, Курило и соавт., 2000, М.И. Русалова, Р.И. Исраилов,2002, Л.А. Марченко и соавт., 2004, М.В. Яманова и соавт, 2004 и др.)
Эти положения делают высоко значимыми данные, характеризующие состояние яичников у новорожденных. В то же время, анализ литературы сви-
детельствует о том, что такие работы немногочисленны. При этом методы современного морфологического анализа, широко применяемые при изучении яичников экспериментальных животных, не находят должного применения при изучении яичников новорожденных детей. Недостаточное внимание морфологов к исследованию данного органа обусловлено тем, что яичники не являются в этом возрасте жизненно важным органом, и их патология не представляется существенной в механизмах танатогенеза.
Необходимость же изучения особенностей гистофизиологии яичников новорожденных, развитие которых проходило в физиологических или осложненных патологией гестационного процесса условиях, обусловливается возможностью прогнозирования на его основе состояния органа в последующем.
Одной из предпосылок для решения данных вопросов может стать мор-фофункциональный анализ особенностей гистофизиологии яичников новорожденных и детей, осуществленный на большом материале, с применением современных морфометрических, гистохимических методов.
Цель исследования: дать морфометрическую и гистохимическую характеристику основных структур яичников новорожденных, выявить их особенности, обусловленные некомфортными условиями пренатального развития, оценить возможную роль в формировании патологии органа в репродуктивном периоде.
Задачи исследования:
Изучить особенности морфологии яичников новорожденных, обусловленные их гестационным возрастом.
Охарактеризовать особенности морфологии яичников, обусловленные патологией плода и матери во время беременности.
Дать морфометрическую характеристику примордиальных фолликулов новорожденных, сопоставить ее с морфологией примордиальных фолликулов у детей и женщин репродуктивного возраста.
Проанализировать возможные механизмы формирования особенностей гистофизиологии яичников новорожденных, эмбриогенез которых проходил в условиях патологии гестационного процесса.
Определить, какие из особенностей морфологии яичников, имеющиеся в перинатальном периоде, а также - у детей раннего возраста; могут способствовать в последующем нарушениям репродуктивной и эндокринной функций органа.
Научная новизна исследования
1. Впервые дана комплексная морфометрическая и гистохимическая характе
ристика і основных структур яичников новорожденных, пренатальное разви
тие которых протекало
в физиологических условиях
при гестационном процессе, осложненном болезнями матери и плода (инфекционная патология; гестозы, пороки развития),
при разном гестационном возрасте (26-40 недель)
Впервые описаны морфометрические особенности яичников новорожденных и детей раннего возраста при наличии в них фолликулярных кист, установлено, что морфология яичников при этом однотипна с таковой при СПЯ.
Впервые проведен анализ вероятных последствий нарушений пренатального развития яичников для их состояния в репродуктивном периоде.
Научная и практическая значимость работы
Полученные данные существенно дополняют информацию о пренаталь-ном органогенезе яичников, дают количественную оценку важнейших структур органа - примордиальных фолликулов в гонадах новорожденных. В работе сформулированы и обоснованы положения о некоторых механизмах возникновения отклонений гистофизиологии яичников при патологии геста-
ционного процесса, возможного их влияния на состояние органа в репродуктивном периоде онтогенеза. Описаны существенные черты сходства морфологии яичников новорожденных при наличии в них кист и при СПЯ у женщин в репродуктивном периоде. Эти данные представляют значительный интерес для гистологии репродуктивной системы, педиатрии, эндокринологии, репродуктологии.
Материалы работы могут использоваться в преподавании в медицинских и биологических вузах на кафедрах гистологии, акушерства и гинекологии, эндокринологии, педиатрии.
Основные положения, выносимые на защиту
Г. Морфология яичников новорожденных характеризуется высокой вариабельностью, проявляющейся выраженными различиями плотности-расположения примордиальных фолликулов, количества фолликулов, находящихся на стадиях первичных и вторичных, степени развития те-коцитоподобных клеток, стромальных компонентов.
Яичники новорожденных, развивавшихся в условиях патологии геста-ционного процесса, отличаются от таковых в норме 1) усиленной гибелью фолликулов 2) наличием значительного числа половых клеток, находящихся в составе «дофолликулярных структур» - яйценосных шаров или большим числом крупных первичных и вторичных фолликулов 3) гипертрофией плотной соединительной ткани.
Отличия морфологии яичников плодов, развивавшихся при патологии гестационного процесса, могут рассматриваться преимущественно как следствие изменений органов, продуцирующих гонадотропные гормоны, регулирующих функционирование и развитие гонад (гипофиза плода, плаценты).
Особенности гистофизиологии яичников новорожденных при выраженном уменьшении числа примордиальных фолликулов, наличии кист могут рассматриваться как факторы риска в последующем патоло-
гии, сопровождающейся снижением репродуктивных потенций женщины.
Апробация материалов диссертации
Материалы исследования были представлены на Дальневосточной региональной научно-практической конференции «Современные технологии в акушерстве и гинекологии (2006, 2007.), Региональной конференции (2007), на совместном заседании Лаборатории клинико-диагностических исследований Института охраны материнства и детства и кафедры гистологии Дальневосточного государственного медицинского университета (2008).
Морфология яичников новорожденных
Яичники новорожденных содержат все основные структуры, имеющиеся в яичниках взрослых женщин, за исключением зрелых фолликулов и желтых тел, появление которых происходит при половом созревании, знаменующем наступление репродуктивного периода. Масса яичников, их гистологическое строение у новорожденных характеризуется значительной вариабельностью (Я. Ла-шене, Е. Сталиорайтите, 1969, С.Л. Бачалдин, 1992, Л.Ф. Курило и соавт, 2000). Одна из ее причин - различия условий эмбриогенеза. Так, масса яичников у доношенных новорожденных - около 207 мг, у недоношенных с массой тела 1501-2500г она составляла 123 мг. Еще меньше она была при большей степени недоношенности (С.Л. Бачалдин, 1992). У новорожденных, матери которых имели патологию сердечно-сосудистой системы и нефропатию, масса органа превышала таковую в контроле в 1,5 раза. По данным С.Л. Бачалдина (1992) суммарное количество примордиальных фолликулов в яичниках у глубоко недоношенных новорожденных (масса тела меньше 1500г) было в несколько раз меньшим, чем у доношенных контрольной группы.
Аналогичные результаты получены и другими авторами. Так, у плодов, имевших признаки задержки внутриутробного развития, число примордиальных фолликулов было существенно меньше, чем у контрольных плодов соответствующего возраста (С. Sforza , A. Forabosco, 1998, J.P. de Bruin et al. 1998).
Примордиальные фолликулы, по мере увеличения возраста плода, прогрессивно занимают все больший объем периферической части коры яичников (в среднем 41 % в 20 недель,. 53 % при рождении, 68% на 8-м месяце после рождения). В рост вступают, прежде всего, фолликулы, расположенные в глубоких слоях коркового вещества. Отражением этого служит тот факт, что первичные фолликулы располагаются преимущественно во внутренней части коры. Вторичные фолликулы локализуются рядом с кортико-момедуллярной границей. Предполагается, что регуляция численности примордиальных фолликулов координируется паракринными факторами (С. Sforza et al., 2003);
Переход примордиального фолликула к первичному фолликулу - критический процесс в нормальной овариальной физиологии, механизмы которого остаются необъясненными. Изучение in vitro яичников новорожденных крыс при культивировании в присутствии прогестерона, эстрадиола или сыворотки теленка показало, что все они влияли на трансформацию примордиальных фолликулов в первичные. Авторы выдвигают гипотезу, согласно которой, высокие уровни материнских и плодовых стероидов предотвращают преждевременное уменьшение числа примордиальных фолликулов и переход их в первичные в течение эмбриогенеза. После того, как уровень стероидов после рождения резко снижается, примордиальные фолликулы вступают в дальнейшее развитие. Эти положения предполагают новую роль стероидов-в материн-ско-плодовом эндокринном модуле в управлении численностью примордиальных фолликулов и их ранними стадиями дальнейшего развития (P. Kezele , М.К. Skinner, 2003). Морфометрический анализ человеческих яичников (от 20-ой недели гес-тации до 8-го послеродового месяца) показал, что овариальный объем был приблизительно 30 мм3 в 20 плодных недель и 287 мм3 в 8-ой послеродовой месяц. Независимо от возраста, кора занимала большую часть органа, в преде-лах от 90 % в 20 пренатальных недель (приблизительно 27 мм ) до 85 % в 8 послеродовых месяцев (приблизительно 245 мм ). В коре примитивная корковая ткань была найдена во всех яичниках, и ее абсолютный объем остался неизмененным между 20-ой плодной неделей и рождением. В проанализированных авторами плодных стадиях, общее количество примордиальных фолликулов имело большую вариабельность, со значительным приращением с между 20-ой и 25-ой плодными неделями: После этого их число увеличивалось более медленно (приблизительно в 1,2 раза между 25-ой неделей и рождением, 1,1 раза между рождением и 8-ым послеродовым месяцем). Самый большой абсолютный объем примордиальных фолликулов был найден при рождении. Размеры фолликулов, ооцитов и их ядер увеличивались в течение внутриматочной жизни, в то время как после рождения их размеры не изменялись. У 8-месячного ребенка почти все зародышевые клетки были включены в фолликулы, а примитивная корковая ткань была сильно редуцирована. (С. Sforza , A. Forabosco, 1998).
При исследовании роли гормонов в развитии яичника новорожденного и также в сохранении и гибели зародышевых клеток в неонатальном периоде установлено, что апоптоз играет ключевую роль в регуляции их количества. Влияние на этот процесс гормонов показано в следующих опытах: новорожденным мышам-самкам вводились эстрадиол или окситоцин, животные забивались в 5-дневном возрасте. Яичники мышей, которым был введен эстрадиол, имели значительно большее число фолликулов и уменьшенное количество половых клеток в состоянии апоптоза. Введение окситоцина оказало противоположный эффект (L. Marzona et al. , 2001).
Хронический холодовый стресс и гипоксия беременных крыс приводят к усиленной атрезии овариальных фолликулов у их новорожденного потомства (Л.М Мельникова, 1988). Возможно, что эти процессы также являются гормоно зависимыми, в частности от глюкокортикоидов, концентрация которых увеличивается при стрессах (И.И. Дедов, 2000).
Измененный гормональный статус крыс, подвергнутых односторонней овариоэктомии за 1,5 мес. до беременности, обусловливал следующие особенности яичников их потомства: в 5-30-дневном возрасте они были «более зрелые», чем в контроле, у взрослых животных - опережали свой календарный возраст (И.Р. Еременко, 1991). Таким образом, изменения эндокринного статуса матери определяло «траекторию» развития яичников у потомства, в том числе, характер фолликулогенеза в них.
При исследовании взрослых крыс-самок с поврежденным в неонатальном периоде задним гипоталамусом, выявлены значительно увеличенные уровни пролактина, уменьшенные - лютеинизирующего гормона. Концентрация про-стагландин-2альфа, являющегося стимулятором лютеолиза, также была уменьшена. В результате в яичниках не происходил лютеолиз, и их новые генерации накапливались в течение нескольких циклов (O.K. Ivanisevic-Milovanovic etal. 1998).
Патология беременности и гормоны. Возможное влияние отклонений их концентрации на яичники плода, формирование репродуктивной системы
Важным фактором этиопатогенеза самых разных нарушений течения беременности являются отклонения от нормы уровня различных гормонов, вырабатываемых в гонадах, надпочечниках, щитовидной железе, а также - в плаценте (Репродуктивная эндокринология, 1998, И.Н. Логвинова, А.С. Емельянова, 2000; Д.А. Евсеенко, Н.И. Цирельников, 2000, Е.В. Фадеев, СВ. Лесникова, 2001, Т.И. Романцова и соавт, 2001, M.W. Elting et al., 2001, Р.Эрколла, 2001, И.Е. Алещенко и соавт, 2001, Т.В. Братчикова и соавт., 2004, Y.Atamer et al., 2004, Кулида Л.В. и соавт, 2005, С.Г. Перминова и соавт, 2006, И.И. Крукиер и соавт., 2007 и др.)
При индуцированной беременности в 1-м триместре - содержание эстрадио-ла, прогестерона, кортизола в плазме - больше, чем при спонтанной беременности, при осложненной - меньше. Во 2-м-З-м триместрах при неосложненной - на нижней границе нормы, при осложненной - снижено. Это сопровождается угрозой выкидыша и преждевременных родов. Кортизол резко увеличивается после 32-й недели при низкой концентрации прогестерона, что может приводить к прерыванию беременности (В.Л. Тютюник и соавт., 1999).
При плацентарной- недостаточности в условиях гестоза в плаценте снижена интенсивность белкового синтеза, уменьшена активность митохондриальных ферментов, разобщено окислительное фосфорилирование, наблюдаются деструктивные изменения (В.Е. Радзинский, И.М. Ордиянц , 1996).
Т.В. Братчикова и соавт. (2004) выявили у беременной с тяжелым гестозом существенное снижение суточной экскреции метаболитов прогестерона, эстро генов, фетальных стероидов: аллопрегнандиола, прегнанолона, гидроксидегид-роэпиандростерона, эстрадиола, эстрона. При преэклампсии в плазме материнской крови увеличена концентрация кортиколиберина (Е. Karteris et al., 2005). Повышенные концентрации глюко кортикоидов, действующие на плод, влияют на его гипоталамо-гипофизарно надпочечниковую систему в препубертатном, постпуберататном периодах. Они могут способствовать преждевременному появлению патологий, связанных со старением (S.G. Matthews et al., 2004). Задержка внутриутробного развития- - результат комплексной патологии, вызванной множественными факторами плодового, плацентарного, и материнского происхождения. Анемия и/или недоедание матери являются1 наиболее частой его причиной в развивающихся странах. Значительно более высокие уровни хорионического гонадотропина, пролактина, плацентарного лактогена наблюдались в крови пуповины новорожденных с отставанием роста, рожденных женщинами с плохим питанием и анемией (S.D: Mahajan et al., 2004).
Концентрации альдостерона были более низкими, при преэклампсии при сроках гестации от 26 до 29 недель. Концентрация прогестерона были выше при преэклампсии чем в контроле с 18 до 21 неделю беременности. Отношение прогестерон/эстрадиол было значительно выше при преэклампсии (S.P. Salas et al, 2006). Концентрация хорионического гонадотропина и Н2О2 в сыворотке была по вышена у пациенток с преэклампсией в сравнении с контролем. Была найдена существенная положительная корреляция между этими показателями. Предпо лагается, что хорионический гонадотропин может поддерживать уровень окис лительного стресса при беременности (A. Kharfi et al, 2005). В развитии преэклампсии патогенетическую роль может иметь раннее повышение концен трации прогестерона. Концентрация альдостерона при этом снижена (S.P. Salas et al, 2006). Материнские уровни альдостерона были более низкие при преэк лампсии и задержке развития плода, чем в контрольной группе (М. Laskowska et al, 2004). ЗО Концентрация андростендиона, тестостерона были повышены на 17 и 33 неделях беременности у женщин, у которых в последующем развивалась пре эклампсия, в то время как концентрация дегидроэпиандростерона была повы шена на 17-й неделе беременности, причем это наблюдалось при беременности и мужскими, и женскими плодами. На 33 неделе повышение уровня андро стендиона и тестостерона были отмечены только у женщин, имевших плодов мужского пола. Авторы приходят к заключению, что уровни андрогенов повы шены во втором триместре у женщин, у которых в последующем развивается преэклампсия. (S.M. Carlsen et al., 2005). При нормальной беременности, с увеличением ее срока, происходит увеличение концентрации альдостерона. При преэьслампсии снижение концентрации альдостерона зависит от снижения активности метилоксидазы, катализирующей одну из реакций синтеза этого гормона (К. Shojaati et а1.д 2004). С. Ficicioglu (2003) не обнаружил статистически существенные различия в концентрации общего тестостерона и свободного эстриола между группой женщин с преэклампсией и контрольной. Уровень свободного тестостерона был значительно выше при преэклампсии. Автор полагает, что андрогены не играют существенной роли в патогенезе преэклампсии. Уровень тестостерона был существенно увеличен только при преэклам псии средней степени тяжести (Y. Atamer et al., 2004). Тестостостерон, эстра диол, дегидроэпиандростерон-сульфат были исследованы перед родоразреше нием. У женщин с преэклампсией найдены несущественные различия1 в сред них уровнях общего тестостерона эстрадиола и дегидроэпиандростерон сульфата (N.R. Miller et al., 2003). У женщин с гипертонией беременных были повышены концентрации сывороточного андростендиона и тестостерона (S. Jirecek et а1.д 2003).
Материнский возраст имел отрицательную корреляционную зависимость от концентрации дегидроэпиандростендион-сульфата, андростендиона и тестостерона, но не коррелировал с концентрацией эстрогенов в крови матери или пуповины (R. Troisi et al., 2003). Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что различные патологические процессы, осложняющие течение беременности, сопровождаются изменениями концентрации гормонов в системе мать-плацента-плод. Каковы же возможные механизмы действия этих отклонений на формирующееся нейроэндокринную и половую системы плода. По нашему мнению, основываясь на данных литературы (В.Б. Розен, 1996, Г.Б. Ковальский и соавт., 1996, И.И. Дедов и соавт, 2001), можно полагать, что они могут реализовываться, в частности, следующими путями. 1. При трансплацентарном поступлении гормонов (например, стероидных) к плоду, в том числе, его нейросекреторным клеткам гипоталамуса, аденоци-там гипофиза; стероидпродуцирующим клеткам яичников, влияя на их функционирование. 2. Для гормонов, не проходящих через плацентарный барьер, их влияние может быть опосредованным, при изменении свойств плаценты, в том числе, эндокринных, с последующим действием измененных концентраций плацентарных гормонов на центральные и периферические звенья эндокринной и репродуктивной систем.
Таким образом, изложенные данные свидетельствуют о том, что гисто-физиология яичников в пренатальном, перинатальном и раннем возрасте изучалась многими авторами. В то же время, исследования, основанные на применении современных методик, проведены почти исключительно на яичниках лабораторных животных. Работы, в которых использованы современные морфометрические, гистохимические методы (с количественной оценкой результатов) яичников новорожденных детей в норме, при разных степенях недоношенности, патологии матери и плаценты - единичны, причем базируются на изучении небольшого материала, порой - описании единичных наблюдений. Это обусловлено, прежде всего, тем, что патологические изменения яичников в этом периоде жизни не являются причиной смерти и поэтому не привлекают значительного внимания патологоанатомов.
Критерии балльной оценки морфологических особенностей исследованных яичников
Гистохимическая обработка материала включала в себя: 1. Выявление нуклеиновых кислот галлоцианином по Эйнарсону. 2. Окраска на суммарный белок. Определение концентрации суммарного белка в цитоплазме и ядре, в результате окрашивания амидочерным 10Б, по методике В.А. Брумберга и Л.З. Певзнера (1972). Депарафинированные срезы окрашивали 40 минут в 0,003%-м растворе амидочерного 10Б фирмы Chemapol (Чехия) при комнатной температуре. Раствор красителя готовили каждый раз, непосредственно перед употреблением, на веронал-ацетатном буфере Михаэлиса, рН 5,3. Затем мазки споласкивали в этом же буфере и воде, высушивали фильтровальной бумагой, обезвоживали, проводя через три смены абсолютного этанола (по 2 минуты в каждом), просветляли в ксилоле и заключали в бальзам. 3. Окраска на ядрышковые организаторы. Для выявления зон ядрышкового организатора использовалась методика окрашивания 50% раствором AgNOs, описанная в работах Н.Н. Мамаева и СВ. Мамаевой (1989). По современным представлениям, с зонами ядрышковых организаторов связаны некоторые негистоно-вые кислые белки, содержащие аминокислоту диметиларгинин и участвующие в транскрипции РНК (В. Ploton et al., 1988). Аргирофильные свойства этих негисто-новых кислых белков, локализованных на коротком плече акроцентрических хромосом 13-15, 21, 22, используют для выявления зон ядрышковых организаторов с помощью AgN03- В основе реакции лежит избирательное связывание AgN03 с негистоновыми кислыми белками, которые образуют рибонуклеопро-теиновые комплексы с вновь синтезированной рРНК. При световой микроскопии отложения AgN03 представлены в виде черных или коричневых гранул, каждое из которых представляет собой фибриллярный центр, окруженный гранулярным компонентом (В. Ploton et al., 1988). Показателем активности эон ядрышковых организаторов служит количество гранул AgN03, которое соответствует количеству функционирующих в клетке РНК-полимераз. Изменение, количества аргирофиль-ных зон ядрышковых организаторов является своеобразным маркером степени синтетической активности клетки
Методика окрашивания состояла в следующем. Депарафинированные срезы- помещали на 20 минут в 1% раствор муравьиной кислоты, после чего переносилшна 10 минут в бидистиллированную воду. Затем под покровное стекло наносили гель из меси 1 части желатины, приготовленной на; 1% водном растворе муравьиной кислоты, w 2 частей 50% водного раствора нитрата серебра: выдерживали 15 минут в термостате при температуре: 37 С и промывали в дистиллированной воде. Затем мазки высушивали фильтровальной бумагой;, обезвоживали, проводят через\ три; смены абсолютного этанола, (по 2 минуты в; каждом); просветляли в ксилоле ж включати в (бальзам: 4. Определение- активности ферментов: НАДН-, НАДФН-диафораз, Зр-гидроксистероиддегидрогеназы по Лойда и соавт. (1982), G. Nacos, R. Gossrau (1994).
При этом использовались стандартные для дегидрогеназ среды (1мл 0,1М? раствора фосфатного буфера с рН 7,4 + 1мг нитросинеготетразолия) с добавлением в них субстрата (Гмг НАДН; НАДФН или дегидроэпиандростерона соответственно). Время инкубирования срезов при всех этих реакциях равнялось 30 минутам при 37 С. После инкубации срезы промывали дистиллированной водой, затем — 4% формалином, ополаскивали водой и заключали в глицерин-желатину. При исследовании ферментов использовали реактивы фирмы Applr Chem Heim (Германия).
Морфометрическое исследование включало в себя? изучение площади сечения ядрышек, ядер и цитоплазмы ооцитовшримордиальных фолликулов; а также — определение в названных структурах (на препаратах, окрашенных галлоцианином) концентрации нуклеиновых кислот. В каждом исследованном случае измерения проведены не менее, чем в 25 ооцитах. На основании полученных данных вычислялись ядрышко-ядерные и ядерно-цитоплазматические соотношения площади и отношения концентрации нуклеиновых кислот в цитоплазме к таковой в ядре. Морфометрические исследования проведены на аппарате Мекос (Медицинские компьютерные системы). Статистическая обработка количественных данных проведена при помощи программы Statistica 6, опции «дескриптивная статистика», «корреляционный анализ».
Активность ферментов в структурах фолликулов и кист в яичниках новорожденных и детей, умерших в раннем детском возрасте
Данные исследования проведены на 2 яичниках новорожденных и 3 детей, умерших в раннем детском возрасте от заболеваний вирусно-бактериальной природы. Они включали в себя определение активности НАДН- и НАДФН-дегидрогеназ, отражающих активность окислительных процессов в митохондриях и вне их соответственно. НАДФН-дегидрогеназы в стероидпродуцирующих клетках имеют, кроме того, прямое отношение к синтезу гормонов. Исследовалась также активность Зр-гидроксистероиддегидрогеназы — ключевого фермента сте-роидогенеза, катализирующего превращение прегненолона в прогестерон, необходимого для синтеза как половых, так и адренокортикальных гормонов. Впримордиальных фолликулах активность НАДН- и НАДФН-дегидрогеназ выявлялась в цитоплазме ооцитов (рис. 36-38). Многочисленные, сливающиеся друг с другом, гранулы формазана темносинего или фиолетового цвета маркировали ее. При проведении реакции на Зр-гидроксистероиддегидрогеназу примор-диальные фолликулов не выявлялись.
В клетках внутренней теки полостных фолликулов, клетках стенок кист, а также - в отдельных участках интерстициальной ткани обнаруживалась положительная реакция на все три изучавшихся фермента (рис.39-46). Эти данные свидетельствуют о том, что в яичниках новорожденных и 2-4-летних детей вступившие в рост фолликулы приобретают способность к стероидогенезу, обладают необходимыми для этого ферментами.
В большинстве случаев, изученных нами, морфология яичников была близка к таковой, описываемой в литературе в качестве возрастной нормы. В то же время, в части наблюдений она характеризовалась особенностями, которые можно рассмат ривать как отклонения от нормы или проявления патологии. Наиболее характерными из них в изученном нами материале были:
1. Значительное число погибающих примордиальных фолликулов (рис. 47), высокая степень вариабельности их размеров, выявлявшаяся даже при изучении препаратов без применения морфометрии. Морфология гибели фолликулов при этом не отличалась от описанной выше, характерной для случаев, когда она не была столь массовой.
При этом фолликулы разных размеров могли находиться рядом друг с другом. Нередко в таких случаях они располагались, «разреженно», отделяясь друг от друга толстыми прослойками соединительной ткани. Иногда в таких случаях обнаруживались очаги кальцификации (рис. 48).
2. Малое число примордиальных фолликулов в корковом веществе. Если в большинстве случаев, как у доношенных, так и у недоношенных новорожденных, эти структуры составляли его преобладающую часть, то в некоторых яичниках по всему корковому веществу в одном поле зрения имелись лишь единичные при-мордиальные фолликулы. При этом корковое вещество содержало 1)скопления половых клеток, не включенных в состав фолликулов — в виде Пфлюгеровых шаров или тяжей или 2)резко гипертрофированную фиброзную ткань (рис. 49 - 51).
Первый вариант был более част при глубокой незрелости плодов, второй — в яичниках детей, проживших несколько месяцев после рождения. В то же время, эти особенности яичников детей, проживших 1-3 месяца после рождения нельзя рассматривать как следствие их более старшего возраста по сравнению с перинатально умершими. Дело в том, что прожившие несколько месяцев после рождения были обычно недоношенными, поэтому их «суммарный» (пренатальный + постнаталь-ный) возраст был близок к таковому у доношенных новорожденных, умерших в перинатальном периоде. Поэтому более вероятной причиной указанных особенностей яичников является обусловленное патологией гестационного процесса и/или постнатального периода исходно уменьшенное количество фолликулов, образовавшихся из оогоний и/или их усиленная гибель с последующим замещением фиброзной тканью. Рис.36. Яичник новорожденной. Реакция на НАДН-дегидрогеназу. Высокая активность фермента в ооцитах примордиальных фолликулов. Увеличение 10 20.
Яичник новорожденной. Реакция на НАДН-дегидрогеназу. При-мордиальный фолликул. Увеличение 15 90. Рис.38. Яичник новорожденной. Реакция на НАДФН-дегидрогеназу. Высокая активность фермента в ооцитах примордиальных фолликулов. Увеличение 10 20.
Строма яичника гидроксистероиддегидрогеназу. акцию. Увеличение 10 20. новорожденной. Реакция на Зр-Тяжи клеток, дающих положительную ре 3. Значительное увеличение числа текоцитоподобных клеток. В таких случаях они образовывали скопления в виде тяжей, гнезд, имевших разные размеры. Иногда они формировали скопления вокруг атретических полостных фолликулов, кист, в других случаях - располагались вне связи с ними. Величина и форма данных клеток были вариабельны: от небольших веретенообразных до крупных полигональных или округлых. Цитоплазма таких клеток окрашивалась по-разному. В некоторых она хорошо воспринимала и кислые и основные красители, в других - была «светлой», иногда с вакуолями. Размеры и форма их ядер варьировали от небольших овальных до крупных округлых. Иногда клетки приобретали признаки лютеоцитов - они значительно увеличивались в размерах, имели светлую, вакуолизированную цитоплазму, светлое крупное шаровидное ядро. При этом подобные клетки образовывали тяжи, напоминающие таковые в желтом теле. По-видимому данные преобразования интерстициальных клеток можно рассматривать как их лютеинизацию. В целом описанные особенности можно расценивать как проявления гипертекоза и текоматоза. В нескольких случаях мы наблюдали, что поверхность яичника имела выраженные «неровности». Они проявлялись наличием 1)выростов коркового вещества в виде сосочков высотой 70-150мкм, иногда имевших тонкую «ножку», а также 2)многочисленными врастаниями поверхностного эпителия вглубь яичника, что проявлялось наличием «дорожек» из таких клеток, проходящих на большую или меньшую глубину коркового вещества (рис.55 58).
