Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор
1. Общий анализ проблемы .12
2. Роль иммуноцитов в развитии органа зрения .18
3. Развитие органа зрения .24
4. Структуры сосудистой оболочки глаза человека 29
5. Развитие сосудов глаза 44
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1.Клиническая характеристика материала 60
2.2.Морфологические методы исследования 63
2.2.1. Классический метод окрашивания гематоксилин-эозином 63
2.2.2. Толуидиновый синий для тучных клеток .64
2.2.3. Импрегнационные методики
2.2.3.1. Импрегнация серебром по Кахалю .65
2.2.3.2. Импрегнация осмием по Гольджи .65
2.3. Иммунная гистохимия .67
2.3.1 Идентификация иммунокомпетентных клеток .67
2.3.2 Выявление нейроглиального белка S-100 72
2.4. Морфометрия 73
Глава 3. Результаты исследования
3.1 Формирование сосудистой оболочки 73
3.2 Формирование мембраны Бруха 77
3.3 Формирование пигментного эпителия .83
3.4 Расщепление структур сосудистой оболочки .86
3.5 Ангиогенез сосудистой оболочки 89
3.6 Формирование беспигментного эпителия 108
3.7 Формирование отростков цилиарного тела .117
3.8 Стромальный меланогенез сосудистой оболочки .126
3.9 Формирование миоцитов цилиарного тела и радужки 138
Глава 4. Обсуждение 143
Глава 5. Выводы 162
Список сокращений 164
Список литературы
- Роль иммуноцитов в развитии органа зрения
- Структуры сосудистой оболочки глаза человека
- Импрегнация осмием по Гольджи
- Расщепление структур сосудистой оболочки
Введение к работе
Актуальность проблемы. Число инвалидов по зрению в России составляет
до 500 тыс. человек, 20% из них являются инвалидами с врождённой
патологией (Стоюхина А.С., 2013). По данным Всемирной организации
здравоохранения (ВОЗ), в мире насчитывается 1,5 миллиона слепых детей,
имеющих патологию органа зрения вследствие нарушений развития в
пренатальном периоде онтогенеза (Dahlin A, Geier E, Stocker SL, Cropp CD,
et al., 2015). В России, как и во всем мире, сохраняется тенденция к росту
количества офтальмологических заболеваний и инвалидности вследствие
патологии развития органа зрения (Егоров Е.А., 2013). При этом в общем
количестве глазной патологии преобладают нарушения развития структур
сосудистой оболочки, связанные с отсутствием дифференцировки,
специализации и обособления структур хориоидеи (Zoran B Redzic, 2015).
Об актуальности изучения хориоидеи также свидетельствует и то, что
самой распространенной причиной необратимой слепоты в нашей стране
является возрастная макулярная дегенерация (ВМД) (Gendron S.P., 2015). Во
всем мире люди в возрасте старше 65 лет имеют признаки этого
заболевания (Leigh H Spielberg 2013). ВМД связана с нарушением
механизмов ангиогенеза, которые на современном этапе требуют более
детального изучения (Malia M. Edwards 2013). Экссудативная форма ВМД
характеризуется аномальным, патологическим ростом новообразованных
сосудов, которые, беря начало из слоя хориокапилляров сосудистой
оболочки, прорастают через дефекты мембраны Бруха под пигментный
эпителий сетчатки (Wilkinson-Berka JL, 2015). Тем не менее, мембрана
Бруха в настоящее время относится к наименее изученным структурам глаза
человека, в то время как многие учёные фундаменталисты и клиницисты
подчёркивают её важную неоспоримую роль в развитии возрастной
ретинальной макулодистрофии (АМД) (Cohen J, 2015). Именно мембрана Бруха вместе с хориокапиллярным слоем сосудистой оболочки и клетками пигментного эпителия образует своеобразную структурно-функциональную единицу, обеспечивающую барьерные функции (Christine A Curcio, 2015).
Для успешного изучения и лечения этой патологии необходимо знание основных закономерностей нормального развития глаза, механизмов ангиогенеза в сосудистой оболочке (Donald G. Puro, 2014). Новые перспективы в успешности лечения с методологической точки зрения могут быть открыты только с помощью более глубоких морфологических исследований и анализа гистофизиологических данных в отношении сосудистой оболочки глаза (John F Bowyer 2015). Очень важно знать, в каких условиях и при воздействии каких тонких механизмов, кроме уже известных, происходит экспрессия и репрессия генов в клетках структур глаза, как и какая взаимная индукция заставляет клетки мигрировать для образования структур глаза (Marie Reine Haddad 2015).
В доступной литературе имеются противоречивые данные по поводу
функций цилиарного тела глаза человека (Муслимов С.А., 2010-2014; Jing
A.I., Yao Liu, 2014). Одни авторы утверждают о наличии у беспигментного
цилиарного эпителия только секреторной функции, другие указывают на
морфологические данные, подтверждающие, что для гистофизиологии
цилиарного тела характерна функция всасывательная (Dahlin A, 2013).
Происхождение беспигментного эпителия цилиарного тела является предметом острых дискуссий (Волгарёва Е.А., 2012; Рева Г.В., Новиков А.С., 2015).
Исследование морфогенеза, времени обособления, роста и дифференцировки структур сосудистой оболочки глаза необходимо, как для понимания нормальной структуры и функции глаза в целом, так и для более глубокого представления о становлении трофического обеспечения структур глаза (Audrey B. Condren, 2013).
Развитие клеточных технологий и их применение в офтальмологии
невозможно без знания механизмов взаимодействия клеток и тканей глаза
человека, подвергающихся неоваскуляризации (U Introini, G Casalino 2015).
Поэтому вопросы ангиогенеза в сосудистой оболочке касаются не только
общебиологических представлений о морфогенезе и дифференцировке глаза,
но и имеют практическое значение для работы врачей офтальмологов (Jing
Xu, Danhong Zhu, 2014). Несмотря на огромное количество публикаций в
периодической литературе, вопросы онтогенеза глаза рассматриваются во
многом противоречиво, особенно в отношении времени обособления
сосудистой оболочки от склеры, времени формирования радужки и
цилиарных отростков (Chien-Neng Kuo 2014), знание которых послужит
ключом в раскрытии механизмов патологических процессов,
сопровождающихся дегенеративными изменениями. Накопленный материал
по эмбриогенезу глаза требует обсуждения и коррекции ряда данных на
основании достижений современных методов световой и электронной
микроскопии (Susumu Sakimoto 2014). Необходимы глубокие знания по
физиологической регенерации структур сосудистой оболочки глаза с учетом
ее морфологических особенностей в разные периоды онтогенеза(Ling Luo,
Hironori Uehara, 2013). Недостаточность работ, выполненных на
человеческом материале, во многом ограничивает практическое
использование достигнутых результатов (Sudhakar John, 2014). Подробнее и
фундаментальнее исследовано развитие глаза лабораторных животных
(Takeshi Iwase, Brian C. Oveson, 2013). Всё это способствует высокой
актуальности запланированного исследования. Сосудистая оболочка глаза
вовлекается в патогенез таких грозных заболеваний, как глаукома,
диабетическая ретинопатия, воспалительные заболевания, дистрофические процессы и т.д. (Yangmi Lim, Dong Hyun Jo, 2012; J S Pulido, I Canal, 2014). При сахарном диабете неоваскулярная глаукома развивается в 32% случаев (U Introini, G Casalino, 2012). Диабетическая ретинопатия встречается чаще при 1 типе (40%), чем при 2 (20%) и относится к основным причинам слепоты у лиц в возрасте от 20 до 65 лет (Lynn C. Shaw, Matthew B. Neu, Maria B. Grant 2013). Получить представление о механизмах репаративной
регенерации в структурах глаза возможно только на основе глубокого морфологического изучения процессов физиологической регенерации (Dongfeng S.U., 2013).
Проведённый мониторинг возрастной структуризации сосудистой оболочки
на основе иммуногистохимических данных показал, что на современном
этапе механизмы клеточных взаимодействий в развивающейся сосудистой
оболочке глаза человека изучены недостаточно (Paris Tranos, Athanasios
Vacalis, 2013). Ключевая роль сосудистой оболочки в патогенезе многих
заболеваний органа зрения свидетельствует о высокой актуальности её
изучения, что и послужило определяющим в выборе темы диссертационного
исследования с использованием методов, позволяющих получить данные о
механизмах ангиогенеза и физиологической регенерации сосудистой
оболочки в онтогенезе человека
Цель
Установить закономерности развития структур сосудистой оболочки глаза человека в пренатальном онтогенезе.
Задачи
-
Изучить основные этапы развития сосудистой оболочки глаза человека.
-
Выявить морфологические особенности структуры сосудистой оболочки в пренатальном периоде развития человека.
-
Установить механизмы развития сосудистой оболочки глаза человека.
-
Провести морфологический мониторинг развивающейся стекловидной пластинки – мембраны Бруха (МБ) и установить источники её развития.
Научная новизна:
Полученные нами данные с использованием современных
иммуногистохимических методов исследования вносят новые представления
во временные характеристики и сроки закладки сосудов хориоидеи, в
алгоритм процессов развития и обособления структур сосудистой оболочки.
Установлен механизм фагоцитоза в развитии и обособлении отростков
цилиарного тела, хрусталика, радужки и роговицы на ранних этапах
развития глаза. Это дополняет концепцию развития и обособления структур
глаза, учитывающую только механизм апоптоза. Установлено участие
нейроглиальных мигрантов из внутренней стенки глазного бокала в развитии
мембраны Бруха в эмбриональный период развития человека. Полученные
результаты расширяют представления об особенностях трофического
обеспечения хориоидеи глаза человека в разные возрастные периоды, что
может составить основу для разработки новых, более эффективных
патогенетически обусловленных консервативных методов лечения при
патологии глаза; обосновать новые подходы к лечению офтальмопатологии. На основе полученных данных выдвинута концепция дифференцировки и специализации глиальных предшественников в цилиарный беспигментный
эпителий и мембрану Бруха глаза человека. Представлены современные иммуногистохимические, морфологические доказательства участия клеток макрофагального ряда в развитии сосудистой оболочки глаза. Установлена роль клеток позитивных по маркерам CD68 и CD163, CD 204, в развитии сосудистой оболочки глаза человека.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные данные дают более глубокие представления о механизмах
васкуляризации, меланогенеза и физиологической регенерации сосудов и
стромы сосудистой оболочки в онтогенезе человека. Установлено участие
клеток макрофагального ряда, позитивных по маркерам CD68 и CD163,
CD204, в процессе обособления хориоидеи от граничащих с ней структур
глаза, что способствует разработке новых методов лечения с
использованием иммунотерапии для регуляции процессов физиологической
и репаративной регенерации. Установленный факт развития мембраны Бруха
из нейроглиальных мигрантов из внутреннего листка глазного бокала
открывает новые перспективы в разработке методов лечения возрастной
макулодистрофии (ВМД), т.к. именно мембрана Бруха является одним из
патогенетических факторов прорастания сосудов из хориоидеи в сетчатку.
Полученные морфологические данные имеют существенное практическое
значения для работы врачей офтальмологов, невропатологов, нейрохирургов
и т.д. Материалы работы могут быть использованы в лекционных курсах по
анатомии, гистологии, биологии, офтальмологии, иммунологии,
патологической анатомии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Хронология развития сосудистой оболочки глаза человека. Особенности
закладки, дифференцировки и гистогенеза основных структур сосудистой
оболочки.
2. При развитии, структуризации и обособлении сосудистой оболочки глаза
человека одним из основных механизмов является индукторное влияние и
взаимодействие эффекторных клеток иммунофагоцитарного звена.
3. Источником развития базального комплекса сосудистой оболочки глаза
человека является нейроглия.
Личный вклад автора
Автором осуществлялось планирование тематики, алгоритма выполнения
работы и проведения исследований по всем разделам диссертации. Проведен
анализ зарубежной и отечественной литературы, выдвинута рабочая
гипотеза участия клеток макрофагального ряда в обособлении и структуризации хориоидеи, радужки и цилиарного тела, сформулированы цель и задачи исследования. Определены этапы и методы исследования. Автором лично выполнялись все этапы проведения морфологического диссертационного исследования, включая забор материала, морфологические иммуногистохимические исследования и анализ полученных данных. На
основании исследований автором опубликовано 8 статей, из них в 5 (90%
результатов) данные проанализированы им самостоятельно, и диссертант
является первым автором. Проведение морфологических исследований
осуществлялось в лаборатории Международного Медицинского Научного и
Образовательного Центра (IMERC) г. Ниигаты (Япония), в лаборатории
патоморфологии Медицинского университета Ниигаты (Япония),
лаборатории нанотоксикологии Инженерной Школы и лаборатории
гистохимии Школы биомедицины Дальневосточного Федерального
Университета (г. Владивосток). Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Развития и научного фонда ДВФУ, в рамках государственного задания 2014/36 от 03.02.2014 г. и Международного гранта Дальневосточного федерального университета (соглашение № 13-09-0602-м_а от 06.11 2013 г.).
Автор выражает глубокую признательность и благодарность профессору Т.
Ямамото за предоставленную возможность выполнения исследования в
лаборатории иммунной гистохимии Международного Медицинского
Научно-Образовательного Центра (Ниигата, Япония), к.м.н., PhD, старшему
научному сотруднику Дирекции научно-исследовательского комплекса
департамента научной и инновационной деятельности Службы проректора
по науке и инновациям Дальневосточного федерального университета И.В.
Рева, дирекции Инженерной школы и Школы биомедицины, а также
коллективу кафедры фундаментальной медицины Школы биомедицины Дальневосточного федерального университета.
Внедрение в практику
Полученные данные позволяют обосновать и внедрить в клиническую
практику новые подходы к профилактике, лечению и реабилитации
офтальмологических больных с ретинопатией недоношенных (исключение
до минимума провоцирующих факторов, таких как источник света и
оксигенация для предотвращения усиленного ангиогенеза в сетчатку);
макулодистрофией (общность развития с сахарным диабетом и
злокачественными опухолями, проявляющимися усилением ангиогенеза);
глаукомой (с назначением иммуномодулирующей терапии). Результаты
исследования могут использоваться в преподавании вопросов гистологии,
анатомии органа зрения человека, офтальмологии на II-V курсах
медицинских вузов, а также на циклах повышения квалификации по офтальмологии и патоморфологии.
Апробация работы
Материалы диссертационного исследования доложены на конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины (Владивосток, 2010, 2011, 2012); Международной конференции иммунологов, аллергологов (Москва, 2010, 2012); Всероссийской конференции глаукоматологов (Москва, 2010, 2011,
2013); Всероссийской конференции офтальмологов (Владивосток, 2010,
2012); Международной научно-практической конференции
«Фундаментальные исследования» (Майорка, Испания, 2011);
Международной научно-практической конференции «Наукоёмкие
технологии» (Рим, Италия, 2011); конференции «Фундаментальные и
прикладные исследования» (12-19 сентября 2011г., Италия, Рим;
конференции «Прикладная морфология» (Италия Ремини , 2011); Конгрессе
по иммунологии и иммунореабилитации (Нью-Йорк, США, 2012);
Международном конгрессе «Микроциркуляция в клинической практике»
(Москва, 2012); Конгрессе Euromedica-Hanover //Internationaler Kongress
Fachmesse. Moderne aspecte der prophylaxe, behandlung und rehabilitatation.
Euromedica-Hannover-2014 (Ганновер, Германия, 2013, 2014); Японо-
Российских Международных Конгрессах Infection deseases (New aspects of
epidemiology, pathogenesis, Treatment, Prevention. Japan-Russia International
Workshop 2013 (JRIW2013).-2013.» (Токио-Киото, Япония, 2013;
Международной Японо-Российской научно-практической конференции JRIC SS-2014 (Владивосток, Россия Владивосток, 2014).
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 30 печатных работ (8 статей
рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК; 1 статья – в журнале из
базы SCOPUS, WEB OF SCIENCE и PUBMED; 9 тезисов на
международном, 5 - российском уровнях); 1 патент на изобретение № 2525436 «Способ фиксации и приготовления гистологических препаратов».
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 228 страницах машинописного текста и состоит из
введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
главы собственных исследований, обсуждения, выводов и практических
рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и включает 86
микрофотографий. Указатель литературы содержит 524 работы,
включающих 114 отечественных и 410 иностранных источников.
Роль иммуноцитов в развитии органа зрения
В периодической литературе вопросы онтогенеза глаза рассматриваются во многом противоречиво, особенно в отношении времени обособления сосудистой оболочки от склеры, времени формирования радужки и цилиарных отростков [156], знание которых послужит ключом в раскрытии механизмов патологических процессов, сопровождающихся дегенеративными изменениями. Не решен вопрос о числе стадий развития сосудистой оболочки глаза [17]. Очевидно, что на каждом этапе онтогенеза предопределено формирование соответствующих морфологических структур, участвующих в трофическом обеспечении клеток и тканей глаза [9]. Изучение этих вопросов должно быть направлено на раскрытие механизмов метаболизма, различных структур, сосудистой оболочки глаза человека в разные периоды онтогенеза.
Установленный ранее факт миграции глии в направлении всех прозрачных сред глаза доказывает, что одной из причин врождённой глаукомы (например, при синдроме Петерса) является отсутствие перемещения нейроглиального дифферона клеток, который является важной составляющей роговицы, хрусталика, стекловидного тела, дифференцируется в беспигментный эпителий цилиарного тела и задний эпителий роговицы [75, 219, 253, 349]. В настоящее время к наименее изученным структурам глаза человека относится мембрана Бруха, в то время как многие авторы подчёркивают её важную неоспоримую роль в развитии возрастной ретинальной макулодистрофии (ВМД) [310, 376]. Именно мембрана Бруха вместе с хориокапиллярным слоем сосудистой оболочки и клетками пигментного эпителия образует своеобразную структурно-функциональную единицу, обеспечивающую барьерные функции [233, 369]. Также предполагается, что барьерными функциями для неоваскуляризации обладает тапетум (хориоидальное или блестящее зеркальце), которого нет у человека, и этот слой клеток располагается в пигментном слое или в сосудистой оболочке [65]. Для успешного изучения и лечения этой патологии необходимо знание основных закономерностей нормального развития глаза, механизмов ангиогенеза в сосудистой оболочке [66].
В доступной литературе имеются противоречивые данные по поводу функций цилиарного тела глаза человека [51, 52, 234]. Одни авторы утверждают наличие у беспигментного цилиарного эпителия только секреторной функции, другие указывают на морфологические данные, подтверждающие, что для гистофизиологии цилиарного тела характерна всасывательная функция [163, 127]. Происхождение беспигментного эпителия цилиарного тела является предметом острых дискуссий [18, 19, 20, 68]. Решение этого вопроса особенно важно, в связи с тем, что один из важнейших факторов, влияющих на становление ВГД (внутриглазного давления) у новорождённого ребёнка – состояние цилиарного тела [87].
Особенности реакции и разрушения эпителия в условиях глаукоматозного процесса свидетельствуют об актуальности исследований, проводимых в направлении изучения структуры и особенностей развития цилиарного тела глаза человека [4, 5, 6, 7, 8]. Имеются данные, указывающие, что начальным звеном в развитии глаукомы является нарастающая дезорганизация, деструкция соединительной ткани, как переднего, так и заднего отрезков глаза [66, 67]. О вероятности наличия аутоиммунного компонента в патогенезе этих изменений свидетельствуют результаты многочисленных исследований, выявивших в сыворотке крови и в жидкостях глаза больных глаукомой высокий уровень аутоантител к гликозаминогликанам, к структурам угла передней камеры, к денатурированной форме ДНК [11, 15]. В осуществлении иммунного надзора и поддержании гомеостаза в передней камере глаза могут принимать участие стромальные меланоциты хориоидеи, радужки и цилиарного тела [10, 14]. Например, для всех стадий глаукомы характерна депигментация и атрофия стромы радужки, наблюдается накопление свободных гранул меланина в дренажной зоне угла передней камеры. С другой стороны, эффективное лечение глаукомы аналогами простагландина сопровождается гиперпигментацией радужной оболочки [12, 13]. Многочисленные концепции порождают множество нерешённых вопросов. Одним из них является вопрос участия в процессах расщепления и обособления структур глаза человека эффекторных клеток фагоцитарного звена. Решение этой проблемы является важнейшим на пути решения механизмов развития врождённой глаукомы у человека [65].
В некоторых исследованиях сделан вывод о том, что в хориоидее васкулогенез происходит независимо от сосудистого фактора роста эндотелия -VEGF, что вносит важные уточнения в представления о молекулярных механизмах индукции сосудистого роста и решении вопросов консервативного лечения неоваскуляризации в структурах глаза человека [142, 175]. Хотя ряд авторов придерживается другого мнения [348]. Ими установлено, что ряд факторов причастен к развитию патологических изменений при формировании и регрессии сосудистого бассейна хориоидеи, включая факторы роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста эндотелия и сосудистый эндотелиальный фактор роста. Все эти противоречивые данные тормозят развитие методов консервативной терапии и применение препаратов, обладающих ингибирующим ангиогенез действием [107, 413].
Японские учёные [395, 399,] изучили распределение в хориоидее воспалительных медиаторов (интерлейкина (IL) - 1beta и фактора некроза опухоли (ФНО) – альфа) и ангиогенного фактора (VEGF), а также определили различные клеточные источники неоваскулярных мембран (CNVMs). Эти морфологические находки свидетельствуют о том, что вопрос об источниках развития сосудистой оболочки до конца не выяснен, требует дальнейших исследований в данной области [133], что подтверждает важность изучения этих процессов у эмбрионов и плодов человека так же как и необходимость выяснения роли факторов врожденного и приобретенного имунитета в процессе ангиогенеза и меланизации структур хориоидеи [201, 497].
Находки цитокератин-позитивных клеток в слое не только ПЭС, но и в строме и вокруг кровеносных сосудов, особенности их распределения требуют объяснения роли этих клеток как в физиологической регенерации, так и, возможно, при патологических процессах [140].
Также окончательно не решён вопрос о соответствии развития сосудистой оболочки и фоторецепторного слоя, как и нет единого мнения по поводу трофического обеспечения наружного слоя нейральной сетчатки за счёт хориокапилляров сосудистой оболочки [209]. Предметом дискуссий является и вопрос развития структуры стенки крупных сосудов, времени появления перицитов в оболочке кровеносных сосудов, а также их гистофизиологического значения [102].
Зависимость кровоснабжения сетчатки от состояния хориоидеи диктует необходимость более глубокого изучения развития сосудистой оболочки глаза человека, т.к. при патологических состояниях ангиогенез извращается, а регресс сосудистой системы может идти в обратном направлении по сравнению с пренатальным развитием и физиологической регенерацией [58].
B процесс физиологической регенерации сосудистой оболочки включаются несколько клеточных типов: клетки, участвующие в синтезе ткани, тканевой резорбции, клетки предшественники и клетки со смешанными функциями. В построении ткани участвуют фибробласты, формирующие строму хориоидеи и основу цилиарного тела и радужки глаза [353]. При физиологической регенерации соединительной ткани хориоидеи глаза человека наблюдаются клеточно-молекулярные, клеточно-матриксные и клеточно-клеточные взаимодействия, о механизмах которых практически не известно, как и об их индукции [259, 375].
Структуры сосудистой оболочки глаза человека
Материал помещали в 40мл 96% этилового спирта с добавлением 1-2 капель ледяной уксусной кислоты и выдерживали в термостате при 37С в течение 2-х суток, после этого кусочки споласкивали в 50о спирте до тех пор, пока они не потонут. Затем в такой же объем 96% спирта добавляли 1-2 капли нашатырного спирта и выдерживали еще двое суток в термостате при температуре 37оС. В течение суток материал промывали в водопроводной воде и 3-4 часа в сменяющихся порциях дистиллированной воды. После этого материал инкубировали в 2% растворе азотнокислого серебра при температуре 37С в течение 3-х недель. Каждые три дня серебро заменяли на свежеприготовленный раствор. Промытый в дистиллированной воде материал в течение суток выдерживали в растворе гидрохинона. Проявитель приготавливали из расчета 4 г гидрохинона, 100 г дистиллированной воды и 10 г нейтрального формалина. После этого материал промывали проточной водой для удаления формалина и в двух порциях дистиллированной воды. Для уплотнения и дальнейшей пропитки парафином или целлоидином материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50, 60, 70, 80, 90,100 градусов). В каждой порции спирта исследуемые образцы выдерживали не менее суток. Затем в новой порции 100 градусного спирта глаз находился в течение 3-х часов. Далее его помещали в смесь из 100 градусного спирта и ксилола в соотношении 1:1 до погружения на дно сосуда. После этого глаз помещали в ксилол на 1 час. При больших размерах органа, время обработки в ксилоле увеличивалось на 3 часа. В растворе парафина в ксилоле глаза выдерживали в термостате при температуре 56 градусов в течение 2-х часов, а затем на сутки помещали в смесь парафина с воском при 37С. далее материал помещали в парафин и формировали блок.
Часть материала заливалась в целлоидин. Образец вырезали и клеили на деревянную основу. Целлоидиновые блоки хранили в 70 градусном спирте. Из парафиновых и целлоидиновых блоков изготавливали срезы толщиной не более 15-20 мкм. Часть материала импрегнировали в срезах. Для изучения нервных элементов материал замораживали с предварительной инкубацией в смеси хлоралгидрата (50г), абсолютного спирта (25мл), дистиллированной воды (75мл) в течение 1-2 суток при температуре 37 градусов. Затем ополаскивали в течение 1 минуты в дистиллированной воде и погружали на 24 часа в аммиачный спирт (50 мл спирта с 4 мл нашатыря). В течение 24 часов промывали дистиллированной водой и в течение последних 2-3 часов порции дистиллята меняли каждые 10 минут. Импрегнацию проводили в 2 % водном растворе азотнокислого серебра в течение 7-8 дней в термостате при температуре 37С .
Свежие кусочки задней стенки глаза помещали в смесь из 40 мл 2,5% бихромата калия и 10 мл 1% осмиевой кислоты при температуре 20-25С на 2-7 дней. После этого кусочки обсушивали и погружали в небольшое количество 0,75% раствора азотнокислого серебра, который меняли несколько раз и погружали в 80-96 градусный спирт. Материал резали в криостате. С приготовленных срезов смывали избыточное серебро, чтобы избежать потемнения препаратов, промывали в абсолютном спирте и просветляли в криозоте и скипидаре. 2.3. Иммунная гистохимия.
Основой для проведения имуногистохимических реакций послужили иммунологические реакции антигенов и антител. Использованы современные высокочувствительные иммуногистохимические методы EPOS и En Vision. С помощью иммунной гистохимии выявлены различные фенотипы клеток моноцитарного пула по дифферону СКК, а также тучные клетки в соединительной ткани дренажной зоны глаза человека.
Выявляли CD68, CD163, CD204, CD117 c kit, CD10 c kit фирмы DAKO для иллюстрации и последующего сравнительного анализа динамики их количества в разные периоды онтогенеза человека для доказательства участия иммуноцитов в механизмах перестройки соединительнотканных структур склеры в физиологической регенерации дренажной зоны. Идентификация иммунокомпетентных клеток проводилась по одинаковой схеме, несмотря на различную локализацию антигена в клеточных структурах: мембраны, лизосомы, ядра, комплекс Гольджи.
С целью определения фенотипа иммунокомпетентных клеток методом иммунной гистохимии биоптаты фиксировали в 10% формалине на фосфатном буфере рН 6,8-7,2 в течение 24 часов. Затем промывали в проточной воде в течение 2-х часов и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации в течение 1часа в каждой порции спирта. В спирте 96о выдерживали в течение 1, 2-х, 1 часа и 4-х часов, а затем помещали в абсолютный спирт 5 раз по 30 минут и оставляли в последней порции абсолютного спирта на ночь. После этого материал погружали в смесь абсолютного спирта и ксилола в соотношении 1:1 на 0,5 часа, а затем проводили в 3 сменах ксилола в термостате при 37о по 0,5 часа в каждой. Затем использовали смесь ксилол/парафин (1:1) при 56о по 20 минут в 2-х порциях, а затем в 2-х порциях парафина при 56о в течение 1 часа в обеих порциях. После этого производили заливку. Парафиновые блоки выдерживали в течение суток в термостате при температуре 37о, а затем приготавливали срезы. Срезы и вся дальнейшая обработка материала (депарафинирование и обезвоживание) производились на автоматизированной аппаратуре лаборатории патоморфологии Медицинского университета Ниигаты (Япония), дающей высокую чувствительность к маркировке, En Vision -системе. С помощью моноклональных антител (МКА) клон КР1, код № М 0814, лот 119, выявляли макрофаги по маркёру CD68 (высокогликозилированный трансмембранный гликопротеин, который локализуется в лизосомах). Молекулярный клон CD68 показал, что LGP (семейство лизосомальных гликопротеинов) с плазматическими мембранными белками играют роль в лизосомальных трафиках и эндоцитзе, включая лизосомальные ассоциации мембранных протеинов-1 и 2 (LAMP-1 и LAMP-2). Для маркировки CD163 использовали клон 10 D6, класс иммуноглобулинов IgG1. Антитела были мечены пероксидазой хрена, а для визуализации связывания использовали диаминобензидин, поскольку связывание было коричневым. Демаскировка антигенных детерминант проводилась в стеклянном контейнере, заполненном восстанавливающим раствором и созданием условий водяной бани в течение 1 часа. Часть препаратов обработана с помощью микроволнового излучения, которое даёт лучший демаскировочный эффект, в течение получаса. Использовали для демаскировки антигенов 10 ммоль/л цитратный буфер, рН 6,0 или DАКО TRS (Target retrieval solution, сode № S 1700) Остывшие препараты промывали в дистиллированной воде. Использовали антитела в разведении 1:50 и 1:100. Окрашивание коричневого цвета свидетельствовало о положительной реакции.
Импрегнация осмием по Гольджи
В строме цилиарного тела также идентифицируются иммуноциты CD68 (антигенпрезентирующие дендритные клетки (АПК)), что свидетельствует, что в перестройке структуры, процессах васкуляризации и меланизации стромы хориоидеи принимают активное участие. Клетки Лангерганса в основном локализуются в участках стромы сосудистой оболочки. Антигенпрезентирующие дендритные макрофаги (клетки Лангерганса) также выявляются и на 16 неделе развития, когда начинается хориоидальный меланогенез с формированием стромальных меланоцитов в строме хориоидеи (рис. 5.5). Эти меланизирующиеся клетки в строме и стенке сосудов имеют контакты с макрофагами фенотипов CD68 и CD163, что позволяет сделать вывод о роли макрофагов АПК и моноцитарных в хориоидальном меланогенезе (рис. 5.5 а, б, в). Некоторые дендритные клетки заполнены гранулами пигмента. Дендритные макрофаги имеют ярко выраженное базофильное ядро и отростчатую форму. Эти клетки располагаются в строме формирующейся сосудистой оболочки. Дендритные макрофаги, также имеют контакты с фибробластами и клетками моноцитарно-макрофагального ряда.
Беспигментный эпителий отростков цилиарного тела в первую половину плодного периода не окрашивается гематоксилин-эозином, как и клетки Мюллеровской глии в сетчатке, стекловидном теле и собственном веществе роговицы. В этот период развития пигмент в пигментном эпителии имеет околоядерное расположение. Под пигментным эпителием располагается слой клеток мембраны Бруха, имеющих веретеновидную форму. Строма сосудистой оболочки имеет ячеистый вид, где формируются эндотелиальные клетки сосудов(рис.6.1а).
С 14-й недели плодного периода покрывающий отростки цилиарного тела беспигментный эпителий начинает окрашиваться эозиновыми красителями, начиная с цитоплазмы (рис.6.1б). На месте расщепления структур глаза формируется ресничный поясок с беспигментными веретеновидными клетками. Между беспигментными эпителиоцитами имеются свободные участки. Ядра беспигментного эпителия имеют не чёткие, слабо-базофильные края. Пигментный эпителий ярко выражен, происходит накопление пигмента и его упаковка в меланосомы, т.е. формируется его меланогенез.Пигмент в пигментном эпителии располагается преимущественно околоядерно.Мембрана Бруха формируется в бесструктурную стекловидную пластинку. В строме сосудистой оболочки идёт усиленный ангиогенез, формируются кровяные островки. В пучках роста кровеносных сосудов выявлялись клетки моноцитарно-макрофагального ряда.
На 17 неделебеспигментный эпителий формируется в однослойный многорядный плоский слой клеток, имеющих уплощенную форму. Представлен двумя видами клеток (с темно-фиолетовым мелким и более светлым крупным ядром). У беспигментного эпителия формируется апикальная поверхность. В базальной части цитоплазмы клеток беспигментного эпителия и между ними появляются полости с секретом, что говорит о начале диффузии (циркуляции внутриглазной жидкости). Рядом с пигментным эпителием формируются кровеносные сосуды, вокруг которыхпоявляется эластический каркас. Мембрана Бруха практически не визуализируется. Пигментный эпителий имеет околоядерное расположение меланосом. Отсутствуют стромальные меланоциты в сосудистой оболочке и вокруг кровеносных сосудов(рис.6.1в).
К 18 неделе формируются отростки цилиарного тела, которые напоминают петли пигментного эпителия. Пигментом заполняется весь пигментный эпителий, что даже не видно ядер. Накопление пигмента связано с началом стромального меланогенеза, т.е. миграцией пигмента вглубь стромы. Формирующиеся цилиарные отростки заполняются стромальным компонентом. В беспигментном эпителии располагаются гранулы с секретом. Беспигментный эпителий очень напоминает эпителий почек в нефроне, и имеет вид однослойного кубического эпителия. Среди клеток беспигментного эпителия, визуально, можно выделить 2-а типа эпителиоцитов. Первый тип (темные клетки) имеет более мелкое ярко-базофильное ядро, а второй тип (светлые клетки) имеет крупное слабо-базофильное ядро. Возможно, светлые клетки участвуют в синтетической функции, а темные клетки в секреторной (регулируют уровень внутриглазной жидкости)(рис.6.1г).
На 19 неделе, беспигментный эпителий приобретает черты многорядного цилиндрического эпителия.Также выявляются светлые и темные клетки беспигментного эпителия. Ядра темных клеток приобретают удлиненную форму и располагаются ближе к пигментному эпителию. Ядра светлых клеток располагаются ближе к апикальной поверхности. Количество светлых клеток уменьшается, возможно, путем апоптоза. На апикальной поверхности,цилиндрического беспигментного эпителия, формируется ровный сплошнойслой, которыйвыглядит, какпограничная мембрана (наружная и внутренняя пограничная мембрана сетчатки). В беспигментном эпителии, также выявляют гранулы с секретом. Уменьшается количество пигмента в пигментном эпителии, что возможно связано со стромальным меланогенезом. Строма сосудистой оболочки и мембрана Бруха имеет выраженный эластический каркас.Формирующаяся мембрана Бруха имеет ещё частично клеточное строение.Пигментный эпителий и мембрана Бруха немного отдаляются друг от друга, что возможно связано с циркуляцией внутриглазной жидкости(рис.6.1д).
С 20 недели, беспигментный эпителий приобретает более цилиндрическую форму. Ядра темных клеток также имеют более удлиненную форму и располагаются ближе к пигментному эпителию. Светлые клетки также
Расщепление структур сосудистой оболочки
Сетчатка дифференцируется раньше других оболочек глаза на задней поверхности стенки глаза, что соответствует её зрительной части и прилежанию к собственно хориоидее. Элементы сетчатки, как это и показано другими исследователями Otteson DC, Rutar M, Sugino IK et al. [337, 361, 379, 380, 381], развиваются из наружного ядерного слоя внутреннего листка глазного бокала. В тот период, когда она находится в стенке глазного пузырька, ее трофика осуществляется за счет ликвора. Формирование 2-х слойной глазной чаши сопровождается трансформацией наружной стенки в пигментный эпителий, а внутренней - служит источником для всех остальных слоев сетчатки. По мнению боьшинства авторов, трофическое обеспечение наружного слоя с ликворного способа переходит на гематогенное ультрафильтрационное обеспечение, так как начинают появляться хориокапилляры. Камбиальный слой сетчатки, пока идет миграция нейронов вдоль отростков радиальной глии, обеспечивает метаболические потребности за счет стекловидного тела. В это время видны конусы роста у нейронов и их миграция, отсутствуют внутренняя пограничная и гиалоидная мембраны, отростки клеток внутренних слоев погружены в стекловидное тело. Радиальная глия направляет рост нервных элементов сетчатки и в этом подобна глии, влияющей на рост сосудов и вектор их распространения в хориоидее в развивающемся глазу человека [384]. В наружном слое выявляется мембрана, соединяющая апикальные поверхности фоторецепторных клеток [272 , 374]. Как и Fu J, Watanabe M et al. [193 , 415], которые, как мы предполагаем, на ранних этапах эмбрионального развития обеспечивает синхронность процессов дифференцировки сетчатки. Истончение краев глазного бокала, представляющих слепую часть сетчатки, индуцировано тем, что в момент быстрого развития хориоидальной части сетчатки, по краям глазного бокала процесс достаточного трофического обеспечения нейросетчатки запаздывает, поэтому идёт массовая апоптотическая гибель нейронов и глии. Можно предположить, что первоначальное соотношение клеточных элементов в сетчатке, ее одинаковая толщина по всей стенке глазного бокала и последующая перестройка, сопровождающаяся исчезновением колбочек на периферии, истончением краев глазного бокала и появлением fovea находятся в коррелятивной связи с метаболическими запросами и стимулирует ангиогенез уже в самой сетчатке. Это отражает систему защиты нейронов, но может привести и к запрограммированной гибели - апоптозу части фоторецепторных клеток, необходимых для физиологической регенерации. Есть все основания полагать, что именно процессом васкуляризации в хориоидальной оболочке характеризуются сроки и темпы дифференцировки сетчатки. При изменении трофического обеспечения сетчатки вырабатываются стимуляторы ангиогенеза, которые необходимы для компенсаторно-приспособительных реакций, стимулирующих процессы физиологической регенерации. В целом васкулогенез в хориоидее заключается в синхронизированных во времени элементарных событиях клеточного уровня: пролиферации, миграции, дифференцировке, синаптогенезе, межклеточном распознавании и гибели клеток, причём в соответствии с растущими физиологическими запросами сетчатки.
Таким образом, развитию сосудистого бассейна глаза в целом и сосудистой оболочки в частности, способствуют прорастание сосудов в среднюю часть передних мозговых пузырей, что означает появление гематогенного источника питания. Ликворный тип питания постепенно уступает место гематогенному, но не исчезает полностью, а сохраняется в виде дополнительного. Однако, и в последующем трофические вещества попадают к нейронам через ликвор. Так как гистофизиологически и гистогенетически мембрана Бруха не может являться той структурой, которая могла бы обеспечивать достаточную трофику сетчатки за счёт ультрафильтрации крови. Ликворная трофика включается в общую трофическую систему глаза, благодаря наличию гематоофтальмического барьера. В настоящее время васкулогенез хориоидеи более глубоко исследован только у животных, на материале человека он практически изучен в немногочисленных работах. В связи с методическими трудностями отсутствуют безупречные данные по васкулогенезу сосудистой оболочки эмбрионов человека. Результаты наших наблюдений показали, что васкуляризация хориоидеи, как и сетчатки, начинается вследствие запустевания гиалоидной артерии и снижения ликворного трофического обеспечения. В результате начинает развиваться сосудистая система хориоидеи за счет ветвей глазничной артерии. Ангиогенез является компенсацией для растущих физиологических запросов нейронов сетчатки. Большинство стимуляторов ангиогенеза ведет свое происхождение из тканей с недостаточным уровнем метаболизма [102, 384]. Мы согласны с Paes KT [338] в том, что ангиогенез хориоидеи также стимулируется увеличивающимся внутрисосудистым давлением в глазничной артерии и растяжением сосудов растущей тканью радужки и цилиарного тела. Рост кровеносных сосудов наблюдается только в пределах хориоидеи, и не распространяется на сетчатку. Это свидетельствует о наличии в структуре мембраны Бруха в глазу человека неидентифицированных ингибиторов ангиогенеза. Известно, что высокую ингибирующую активность имеют протеогликаны и гликозамингликаны, а также гиалуроновая кислота [100, 391], чем богато стекловидное тело. Отметим, что этот факт при его учете и использовании соответствующих препаратов, или стимуляции мембраны Бруха имел бы значение в лечении посттравматических осложнений, ожогов глаза, профилактике неоваскуляризаций при различном генезе ретинопатий. Мы полагаем, что этому способствует повышающаяся метаболическая активность сетчатки. Позже формируется глубокая капиллярная сеть. Активность клеточных компонентов сосудистой стенки находится под контролем макрофагов, взаимодействующих с тканевыми базофилами, что находит отражение в типичной топологии сосудистых и соединительнотканных клеток.
Васкуляризация хориоидеи происходит в соответствии с последовательностью формирования ее слоев. Вопрос о механизмах образования просвета сосудов обсуждается длительное время. Одни авторы (Yamashita T et al. [99, 426]) считают, что просвет образуется путем слияния межклеточных щелей, другие (Alexa Klettner et al. [106]) полагают, что он формируется за счет внутриклеточной вакуолизации. В растущих бесшовных капиллярах появляются мелкие вакуоли за счет аутолиза участков цитоплазмы. Однако, Baba T [119] не обнаружил свидетельств в пользу внутриэндотелиальной вакуоли. В наших наблюдениях эндотелий капилляров первоначально образует мелкие вакуоли, которые, увеличиваясь в размерах, формируют просвет. Капиллярогенез хориоидеи подчиняется тем же закономерностям, что установлены для головного мозга (Куприянов В.В., Koizumi H. [34, 259]). Новообразование капилляров происходит путем почкования от существующих капилляров. Этот процесс включает: пролиферацию эндотелиальных клеток, их миграцию из стенки капилляра и созревание, ремоделирование экстраваскулярного тканевого матрикса, специализацию новообразованных капилляров и трансформацию некоторых из них в сосуды артериального и венозного звеньев микроциркуляторного русла. Такой взгляд на сущность физиологической пролиферации эндотелия сосудистой оболочки в процессе новообразования капилляров соответствует наиболее принятым морфологами для других органов (Куприянов В.В. [34]).