Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Обзор литературы 11
1.1. Строение ядра и хромосомного аппарата микроспоридий 11
1.1.1. Общая организация ядра 11
1.1.2. Митоз у микроспоридий 12
1.1.3. Половой процесс у микроспоридий: закономерности изменения плоидности ядер диплокариона 15
1.1.4. Хромосомные циклы микроспоридий. Классификация жизненных циклов...25
1.2. Способы изучения кариотипа у протистов 30
1.3. Кариотипирование протистов с помощью метода пульс-электрофореза 32
1.4. Определение размера генома и уровня плоидности у протистов 39
1.5. Молекулярные кариотипы, размер генома и хромосомный полиморфизм у микроспоридий 41
ГЛАВА 2. Материал и методы 50
2.1. Методы лабораторной работы с микроспоридией Paranosema grylli 50
2.1.1. Происхождение культуры микрослоридии 50
2.1.2. Поддержание микроспоридии в культуре насекомых-хозяев 50
2.1.3. Выделение и очистка стадий жизненного цикла микроспоридии из жирового тела сверчка 51
2.1.4. Стимуляция экструзии полярных трубок из спор P. grylli и получение препарата спороплазм 54
2.2. Методы световой и электронной микроскопии 55
2.2.1. Световая микроскопия и гистохимическое окрашивание 55
2.2.2. Трансмиссионная электронная микроскопия 56
2.3. Методы цитометрии 56
2.3.1. Кислотный гидролиз и окрашивание препаратов для цитометрии 56
2.3.2. Измерение содержания ДНК в ядрах диплокариона с помощью цитометрии по изображению 57
2.4. Базовые молекулярно-биологические методы 5
2.4.1. Выделение геномной ДНК из спор P. grylli 5Е
2.4.2. Амплификация ДНК 6*
2.4.3. Клонирование продуктов ПЦР 6f
2.4.4. СеквенированиеДНК 66
2.4.5. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 66
2.5. Молекулярное кариотипирование 67
2.5.1. Приготовление образцов высокомолекулярной хромосомной ДНК Р grylli для пульс-электрофореза 67
2.5.2. Приготовление агарозных блоков с размерными маркерами для пульс-электрофореза 72
2.5.3. Пульс-электрофорез хромосомной ДНК 73
2.5.4. KARD 2-D PFGE 79
2.5.5. Гибридизация поСаузерну 81
ГЛАВА 3. Результаты 83
3.1. Изучение структуры диплокариона и хромосомного аппарата Paranosema grylli 83
3.1.1. Интерфаза 83
3.1.2. Митоз и цитокинез 84
3.1.3. Мейоз 90
3.2. Изучение молекулярного кариотипа микроспоридии Paranosema grylli 94
3.2.1. Фракционирование хромосомных ДНК P. grylli с помощью пульс-электрофореза 94
3.2.2. Особенности молекулярного кариотипа микроспоридии P. grylli 103
3.3. Идентификация индивидуальных хромосом в молекулярном кариотипе Paranosema grylli с помощью двумерного пульс-электрофореза рестрикционных фрагментов хромосомных ДНК (KARD 2-D PFGE) 105
3.4. Локализация ген-специфичных зондов на хромосомах Paranosema grylli 110
3.4.1. Гибридизация с ДНК-зондами коднокопийным
белок-кодирующим генам 110
3.4.2. Локализация ДНК-зонда к гену 16SpPHK 112
3.5. Определение абсолютного содержания ДНК в спорах
Paranosema grylli и оценка уровня плоидности ядер диплокариона 115
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 119
4.1. Особенности организации диплокариона и хромосомного аппарата у Paranosema grylli 119
4.1.1. Интерфаза 119
4.1.2. Митоз 122
4.2. Особенности протекания мейоза и его место в жизненном цикле Paranosema grylli 125
4.2.1. Морфологические маркеры мейоза у P. grylli: сравнение с другими микроспоридиями 125
4.2.2. Место мейоза в жизненном цикле P. grylli 127
4.3. Хросомный набор микроспоридии Paranosema grylli. Полиморфизм гомологичных хромосом и его возможные причины 128
4.3.1. Популяционная структура P. grylli 129
4.3.2. Уровень плоидности диплокариона микроспоридий 130
4.3.3. Возможные сценарии хромосомных перестроек в ходе пролиферации P. grylli 132
4.3.4. Репродуктивная стратегия P. grylli 139
4.3.5. Функциональное значение хромосомного полиморфизма 141
4.4. Хромосомный репертуар и размер генома Paranosema grylli в сравнении с другими микроспоридиями 142
4.5. Биологическое значение межъядерной гомогенизации геномов и возможные варианты ее реализации у мономорфных
диплокариотических микроспоридий ...145
Заключение 149
Выводы 151
Список литературы
- Половой процесс у микроспоридий: закономерности изменения плоидности ядер диплокариона
- Поддержание микроспоридии в культуре насекомых-хозяев
- Изучение молекулярного кариотипа микроспоридии Paranosema grylli
- Морфологические маркеры мейоза у P. grylli: сравнение с другими микроспоридиями
Введение к работе
Микроспоридии - это крупный тип одноклеточных эукариотических организмов, объединяющий более 160 родов облигатных внутриклеточных паразитов. Круг хозяев этих организмов включает представителей почти всех таксонов животного мира: от простейших до млекопитающих. Среди микроспоридий описаны виды, вызывающие серьезные заболевания хозяйственно-важных беспозвоночных, рыб и теплокровных животных (Исси 1986; Исси и Воронин 2007; Canning 1990). Некоторые виды этих паразитов вызывают инфекции у человека (Didier et al. 1998; Franzen and Muller 2001; Weiss 2001).
По современным представлениям, микроспоридии - это группа филогенетически близких к грибам организмов, эволюция которых преимущественно шла в направлении крайнего упрощения и редукции основных систем и структурных компонентов клетки (Edlind et al. 1996; Li et al. 1996; Keeling and Doolittle 1996; Edlind 1998; Hirt et al. 1999; Weiss and Vossbrinck 1999; Van de Peer et al. 2000; James et al. 2006; Liu et al. 2006). В миниатюрных клетках (обычно менее 10 мкм) этих паразитических организмов нет канонических митохондрий и классических диктиосом аппарата Гольджи. У них не обнаружены лизосомы и пероксисомы, а также кинетосомы и их производные (Keeling 2001; Metenier and Vivares 2001; Keeling and Fast 2002). Анализ полностью секвенированного генома микроспоридии Encephalitozoon cuniculi показал, что это один из самых маленьких из изученных на данный момент эукариотических геномов. Он сильно редуцирован за счет укорочения последовательностей генов и межгенных регионов, а также практически полного исчезновения интронов и повторяющихся последовательностей. Метаболические возможности микроспоридий, в особенности анаболический метаболизм, также чрезвычайно "урезаны" (Katinka et al. 2001; Vivares and Metenier 2000; Vivares et al. 2002). Всестороннее изучение этих паразитов существенно расширяет наши взгляды на пути и последствия редуктивной эволюции эукариотической клетки. Исследования микроспоридий углубляют наши представления о "минимальной клеточной системе", ее обязательных компонентах и
неотъемлемых функциях, а также способствуют пониманию основ функционирования более сложных клеточных систем.
Одними из наименее изученных аспектов организации микроспоридий остаются структура и функционирование их ядра и хромосомного аппарата. Хромосомы у большинства микроспоридий -мелкие и морфологически неоформленные; они остаются слабоконденсированными на протяжении всего клеточного цикла и представляют собой весьма трудный объект для морфологических исследований (Larsson 1986; Canning 1988; Vavra and Larsson 1999). Лишь у двух видов полиморфных микроспоридий, в жизненном цикле которых присутствует мейоз, описан мейотический кариотип и, соответственно, на морфологическом уровне определено количество хромосом в ядре (Hazard et al. 1979; Chen and Barr 1995). Изучение хромосомного состава ядер у подавляющего большинства других видов возможно только с помощью методов молекулярного кариотипирования. У микроспоридий проведение подобных исследований, сопряженных с необходимостью выделения большого количества интактной хромосомной ДНК, весьма затруднено. К моменту начала нашей работы были опубликованы результаты лишь шести исследований, посвященных анализу молекулярных кариотипов микроспоридий, причем ни в одном из них не было определено точное число хромосом у изучаемых организмов (Munderloh et al., 1990; Malone, Mclvor, 1993; Biderre et al., 1994, 1995; Kawakami et al., 1994; Streett, 1994). Для большинства исследованных видов было показано, что при электрофоретическом фракционировании хромосомных ДНК в геле выявляются полосы, которые характеризуются нестехиометрической интенсивностью окрашивания бромистым этидием. Интерпретация подобной картины требует привлечения трудоемких методов идентификации индивидуальных хромосом (гибридизация по Саузерну с хромосома-специфичными зондами, анализ паттернов рестрикции хромосомных ДНК), которые только в последнее время начали применять для изучения молекулярных кариотипов микроспоридий (Biderre et al. 1997; Brugere et al. 2000b; Mansour et al. 2004). В связи с вышесказанным становится понятным, почему вопрос о числе хромосом и размере геномов у этих организмов до сих пор остается малоизученным. Вместе с тем эти сведения представляют
собой один из ключей к пониманию общих закономерностей эволюции как отдельных групп микроспоридий, так и всего типа в целом.
Примерно у половины всех родов микроспоридий ядерный аппарат на протяжении всего жизненного цикла или только на определенном его этапе представлен парными ядрами, организованными в диплокарион. Особенности строения диплокариона микроспоридий и его функциональная роль изучены недостаточно. Спорным остается вопрос об уровне плоидности ядер диплокариона. Не известно, эквивалентны ли эти ядра с точки зрения их структуры и функции: идентичны ли хромосомные наборы в обоих ядрах, содержат ли они одинаковое количество ДНК, параллельно ли в них происходят матричные и другие ядерные процессы. Особенно актуальны эти вопросы для изучения генетической конституции мономорфных диплокариотических микроспоридий, в жизненном цикле которых, как традиционно считается, вообще нет монокариотической фазы, и не отмечено никаких свидетельств межъядерной рекомбинации. Остается невыясненным, имеет ли место у представителей этой группы дивергенция геномов ядер диплокариона, или существуют какие-то генетические механизмы для поддержания их эквивалентности.
Таким образом, круг неизученных вопросов, касающихся организации ядра и хромосомного аппарата у микроспоридий и, в особенности у мономорфных диплокариотических видов, оказывается весьма широк. Однако исследования такого рода сильно лимитированы отсутствием удобных моделей, которые позволяли бы выделять клетки микроспоридий в препаративных количествах.
Группа профессора И.В. Исси во Всероссийском институте защиты растений РАСХН в течение многих лет изучает модельную систему: микроспоридия Paranosema grylli - сверчок Gryllus bimaculatus (Соколова и др. 1994; Sokolova, Dolgikh, Morzhina, Nassonova et al. 2003). На этой модели исследуются как особенности паразито-хозяинных отношений у микроспоридий и насекомых, так и собственно биология микроспоридий. Культуру сверчков круглый год можно поддерживать в условиях лаборатории. Подобраны условия искусственного заражения сверчков, при которых имеет место высокая интенсивность инвазии. Разработаны методы выделения, накопления и очистки спор P. grylli; найдены подходы
к получению препаратов, обогащенных внутриклеточными стадиями развития паразита (Seleznev et al. 1995; Долгих 1997). Именно на этой удобной лабораторной модели проводились исследования углеводного и энергетического метаболизма микроспоридий (Долгих, Насонова и др. 1996; Dolgikh et al. 1997; Dolgikh 2000), особенностей организации спор (Sokolova et al. 2000) и аппарата экструзии (Dolgikh and Semenov 2003), a также изучение взаимоотношений микроспоридий с защитными системами хозяина (Соколова и Сундуков 1999; Соколова и др. 2000; Sokolova et al. 1998; Nassonova et al. 2001; Tokarev et al. 2007).
Paranosema grylli представляет собой весьма удобный объект для проведения исследований, требующих значительного количества материала - выделенных и очищенных спор и внутриклеточных стадий паразита. Появление подобного объекта сделало возможным исследование организации ядра и хромосомного аппарата мономорфных диплокариотических микроспоридий, которому и посвящена настоящая работа.
Исследования были начаты с изучения ультраструктуры ядра и хромосомного аппарата P. grylli, которое было выполнено в ходе обучения в аспирантуре на базе Лаборатории микробиологического метода защиты растений Всероссийского института защиты растений (ВИЗР) РАСХН под руководством д.б.н., проф. И.В. Исси и к.б.н. Ю.Я. Соколовой. Часть исследований, посвященных изучению ультраструктуры ядра P. grylli, была выполнена во время стажировки в Лаборатории частной зоологии проф. Р. Энцерота (R. Entzeroth) в Институте зоологии уТехнического университета г. Дрезден (Германия). Однако уже к моменту окончания обучения в аспирантуре ВИЗР РАСХН стало ясно, что изучать ядерный аппарат подобных организмов необходимо молекулярными методами. Поэтому было принято решение перенести последующие исследования хромосомного набора и плоидности ядер диплокариона P. grylli на базу Лаборатории цитологии
1 В литературе, посвященной изучению микроспоридий, для обобщенного обозначения меронтов, споронтов и споробластов - жизненных форм паразита, развивающихся в цитоплазме клетки хозяина, принят термин "стадии", а также такие его варианты, как "внутриклеточные стадии", "преспоровые стадии" и "пролиферативные стадии". Последний термин используют для обозначения только меронтов и споронтов (см., например: Селезнев и др. 1994,1997; Соколова и др. 2001 и др.).
одноклеточных организмов Института цитологии (ИНЦ) РАН, где они проводились под руководством д.б.н. СО. Скарлато. К моменту окончания аспирантуры были получены первые данные по молекулярному кариотипу; по совокупности полученных морфологических и молекулярных данных был написан первый вариант и проведена апробация кандидатской диссертации. Однако сложность наблюдаемого паттерна полос в молекулярном кариотипе P. grylli побудила нас отложить защиту. Стало очевидно, что для корректной интерпретации наблюдаемой картины необходимо идентифицировать индивидуальные хромосомы. К этому моменту уже начали появляться первые публикации, посвященные разработке метода идентификации хромосом в молекулярных кариотипах с помощью рестрикционного анализа хромосомных ДНК (метод KARD 2-D PFGE). В ходе стажировки в Лаборатории биологии протистов Университета Блеза Паскаля (Клермон-Ферран, Франция), в сотрудничестве с создателями этого метода -3. Корнийо (Е. Cornillot) и проф. К. Виваресом (СР. Vivares) - было выполнено исследование, позволившее нам корректно интерпретировать сложный паттерн полос молекулярного кариотипа P. grylli и представить к защите настоящую работу.
Половой процесс у микроспоридий: закономерности изменения плоидности ядер диплокариона
Под половым процессом в строгом смысле этого слова принято понимать не просто генетическую рекомбинацию, а два взаимосвязанных явления, характерных исключительно для эукариот: сингамию (слияние гамет) и мейоз, приводящие к чередованию гапло- и диплофазы в жизненном цикле организма (Cavalier-Smith 1995; Kondrashov 1997).
Еще в работах исследователей начала прошлого века (Mercier 1909; Stempell 1909; Debaisieux 1919; Kudo 1924) есть упоминания об аутогамии - ядерных слияниях, наблюдаемых в начале спорогонии, у двухъядерных форм микроспоридий. Отсутствие четких доказательств долгое время оставляло эти наблюдения под сомнением.
Существенным прорывом в изучении полового процесса у микроспоридий стали работы французов Лубэ и Морана с соавторами (Loubes and Maurand 1971, 1975a,b, 1976; Loubes et al. 1976a,b; Loubes 1979a,b). Эти исследователи впервые показали наличие синаптонемных комплексов в делящихся ядрах у ранних споронтов Gurleya chironomi, Thelohania fibrata, Polydispyrenia (Pleistophora) simulii, Janacekia (Tuzetia) debaisieuxi, Baculea daphniae и сделали вывод о прохождении мейоза у этих микроспоридий в начале спорогонии (Loubes et al. 1976b)4. Наблюдения французских ученых были подтверждены в практически одновременно опубликованных работах ряда других исследователей (Desportes 1976; Desportes and Theodorides 1979; Joyon and Vavra in Vavra 1976a; Vivares and Sprague 1979).
В обзоре, завершающем серию работ по развитию микроспоридий, Лубэ (Loubes 1979а) предложил возможную схему чередования гапло- и диплофазы в жизненном цикле этих организмов (Рис. 2). В соответствии с этой схемой: (1) мейоз проходит в начале спорогонии и приводит к формированию одноядерных гаплоидных спор; (2) ядра диплокариона не сливаются, а наоборот, диплокарион диссоциирует, и синаптонемные комплексы обнаруживаются в каждом из ядер диссоциировавшего диплокариона. Поскольку наблюдаемые синаптонемные комплексы свидетельствуют о спаривании гомологичных хромосом, то каждое ядро диплокариона диплоидно и, следовательно, диплокарион - это тетраплоидное образование. (3) Место кариогамии (слияния ядер) и момент формирования диплокариона остаются неясными. Предположительно, эти процессы имеют место где-то между моментом попадания спороплазмы в клетку и концом мерогонии - зачастую короткой и малоизученной стадии жизненного цикла.
Положение мейоза и кариогамии в жизненных циклах микроспоридий согласно схеме Лубэ: I - для микроспоридий, в жизненном цикле которых имеет место чередование моно- и диплокариотических стадий (Thelohania fibrata, Polydispyrenia (Pleistophora) simulii, Janacekia (Tuzetia) debaisieuxi); II - для монокариотических микроспоридий (Gurleya chironomi, Baculea daphniae, Microsporidium (Glugea) habrodesmi); III - для диплокариотических микроспоридий (бесполый цикл Nosema spp.). Непрерывными стрелками обозначена описанная по результатам наблюдений часть цикла, точечным пунктиром - предполагаемая теоретически (По: Loubes 1979а, с изменениями).
В 1979 г. Хазард с соавторами впервые документировали поэтапное изменение конфигурации хромосом, характерное для мейоза, у Amblyospora sp., паразита комаров Culex salinarius, на окрашенных лакто-ацето-орсеином давленых препаратах инфицированного жирового тела насекомых (Hazard et al. 1979). Эти исследователи документировали четыре из пяти фаз профазы І в диплокариотических споронтах и впервые описали мейотический кариотип у микроспоридии. Гаплоидное число хромосом у этого вида оказалось равным семи. Было отмечено, что максимальной конденсации хромосомы достигают на стадии диакинеза и что хиазмы между гомологами не формируются. Параллельно авторы этой статьи продемонстрировали наличие синаптонемных комплексов в ядрах тех же стадий жизненного цикла на электронно-микроскопическом уровне.
Позднее Хазард и Брукбэнк (Hazard and Brookbank 1984) впервые осуществили микрофотометрию ДНК в окрашенных по Фельгену ядрах микроспоридии. Эти исследователи впервые наблюдали кариогамию в диплокариотических меронтах и последующее редукционное деление в ранних споронтах на одном из этапов полиморфного гетероспорового жизненного цикла Amblyospora sp., который проходит в жировом теле личинок самцов комаров Culex salinarius.
Впоследствии, опираясь на эти наблюдения, были сделаны основополагающие выводы о плоидности ядер диплокариона и о чередовании гапло- и диплофазы (точнее, гапло-, дигапло- и диплофазы) в жизненных циклах микроспоридий (Canning 1988; Becnel 1992; Becnel et al. 1987, 1989; Flegel and Pasharawipas 1995), положенные, в частности, в основу одной из наиболее признанных современных систем микроспоридий (Sprague et al. 1992).
В соответствии со схемой редукционного деления у Amblyospora sp., предложенной Хазардом и Брукбэнком и обобщенной в обзоре Каннинг (Canning 1988), прохождению мейоза в диплокариотических меронтах предшествует кариогамия (Рис. 3, А - Б). Ядерная оболочка в области контакта между ядрами исчезает, и ядра сливаются. Авторы статьи полагают, что изначально ядра, входящие в состав диплокариона, гаплоидны. Следовательно, после кариогамии они образуют единое диплоидное ядро.
Поддержание микроспоридии в культуре насекомых-хозяев
Выделение стадий жизненного цикла паразита осуществляли по методикам, предложенным ранее (Селезнев и др. 1994; Seleznev et al. 1995; Долгих, Насонова и др. 1996), с незначительными изменениями и дополнениями.
Для диагностики заражения и оценки его интенсивности использовали давленые нефиксированные препараты жирового тела сверчков. При приготовлении препарата на латеральной поверхности абдомена насекомого делали небольшой надрез, пинцетом захватывали фрагмент жирового тела и помещали его на предметное стекло в каплю 150 мМ фосфатно-солевого буфера PBS (Phosphate Buffered Saline solution: 138мМЫаС1, 3 мМ KCI, 1.5мМКН2Р04, 8 мМ Na2HP04, рН 6.8). Препарат накрывали покровным стеклом, слегка раздавливали и просматривали, используя микроскоп, оснащенный фазово-контрастной оптикой. Зрелые споры выглядели как овальные тела, сильно преломляющие свет. Незрелые споры и споробласты представляли собой овальные светло-серые образования с темным контуром. Меронты и споронты выглядели как небольшие, округлые, сероватые клетки с двумя четко просматривающимися, светло-серыми пузырьковидными ядрами (Рис. 7).
Дополнительными индикаторами заражения служили внешний вид насекомых и цвет жирового тела. При сильном заражении абдомен насекомого был гипертрофирован, а жировое тело из-за присутствия большого количества спор становилось молочно-белым.
Отобранных насекомых препарировали на льду. Извлеченное жировое тело гомогенизировали в PBS, используя стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком. Гомогенат фильтровали через несколько слоев мелкой капроновой сетки; отфильтрованную суспензию центрифугировали при 200 g в течение 5 мин. В результате этой операции Рис 8 Внешний вид образовывался трехслойный осадок препарата жирового тела (Рис. 8). Верхний слой полученного после центрифугирования. осадка имел кремовый цвет и был обогащен меронтами и споронтами с небольшой примесью споробластов. В состав этой фракции также входили мелкие везикулы, предположительно остатки мембранных структур хозяина, и (иногда) немногочисленные ядра клеток хозяина. Средний слой, обычно коричневатый, содержал преимущественно споробласты разной степени зрелости, некоторое количество меронтов и споронтов, ядра и другие дериваты разрушенных клеток хозяина, а также фрагменты не полностью разрушенного при гомогенизации жирового тела. Нижний слой был характерного молочно-белого цвета и состоял из зрелых спор, почти не загрязненных дериватами клеток хозяина.
Для получения препаратов внутриклеточных стадий мерогонии и спорогонии отбирали верхний слой осадка. Очистку спор проводили из материала, оказавшегося в нижнем слое. Материал из среднего слоя подвергали еще нескольким раундам гомогенизации и центрифугирования, всякий раз отбирая нижний слой, содержащий споры, и верхний слой с преспоровыми стадиями.
Очистку спор осуществляли с помощью центрифугирования в 70 %-ном Перколле (Percoll, Sigma - Aldrich Inc., США). Для создания градиента плотности Перколл центрифугировали при 15000 g в угловом роторе в микропробирках типа Eppendorf в течение 30 мин. Для очистки материала микропробирки со спорами, наслоенными на Перколл, центрифугировали в бакет-роторе при 1200 g в течение 10 мин. Полученный осадок спор многократно отмывали в дистиллированной воде. Очищенные споры хранили в дистиллированной воде, иногда с добавлением смеси антибиотиков (50 ед/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, 50 мг/мл гентамицина, 50 ед/мл нистатина).
Для очистки стадий мерогонии и спорогонии использовали центрифугирование при тех же условиях в градиенте плотности 20 %-ного Перколла, приготовленного на PBS. Внутриклеточные стадии оседали в верхней части градиента - в зоне с плотностью 1.016 г/мл, формируя хорошо заметное кольцо. Материал из этой зоны аккуратно отбирали с помощью шприца. Отмывку стадий от Перколла осуществляли с помощью двукратного центрифугирования в PBS при 200 g в течение 5 мин. Все вышеперечисленные операции осуществляли при температуре +4С.
Экструзию спороплазм и полярных трубок из спор стимулировали в условиях сдвига рН в среде, содержащей ионы К , по адаптированной методике Куртти с соавторами (Kurtti et al. 1990, 1994). Протокол включал три этапа: (1) инкубация спор в буфере 0.5 мМ Tris-HCI, 5 мМ EDTA, рН 7.0 в течение 30 мин; (2) активация в щелочном растворе 0.01 N КОН, 0.17 М KCI, рН 12.0-13.0 в течение 30 мин; (3) нейтрализация в растворе, содержащем 0.17 MKCI, IOMMEDTA, 1мМ Tris-HCI, рН 7.0 в течение 3-5 мин. Растворы EDTA готовили из свободной кислоты, которую титровали концентрированным КОН. Экструзия полярных трубок начиналась на этапе (3) после ресуспендирования спор в растворе 0.17 М KCI, 10 мМ EDTA, 1 мМ Tris-HCI.
Нами было показано, что спороплазмы, полученные из спор, обработанных по описанной выше методике, способны инициировать цикл развития паразита в культуре клеток Sf9 из совки Spodoptera frugiperda и в культуре клеток MDCK при культивировании при температуре +30 С (Nassonova et al. 2001). В некоторых случаях после кратковременной инкубации в растворе 0.17 MKCI, IOMMEDTA, 1 мМ Tris-HCI споры переносили в питательную среду для клеток млекопитающих DMEM (Gibco BRL, Германия). По нашим наблюдениям, это способствовало увеличению числа спор, выстреливших полярные трубки, а также позволяло наблюдать морфологически целостные спороплазмы в течение нескольких часов. Этот эффект не был подтвержден при использовании других культуральных сред, например, при использовании сред для культивирования клеток насекомых М&М и ТС-100. При этом было показано, что сама по себе инкубация в DMEM не стимулирует экструзию.
Изучение молекулярного кариотипа микроспоридии Paranosema grylli
Разрешение, достигнутое в ходе проведения пульс-электрофореза, определяется расстоянием между полосами, а также их четкостью и шириной. Наши опыты показали, что при использовании режима интерполяции полосы в геле оказываются более размытыми и широкими, чем в случае применения степпинга. При ступенчатом возрастании времени пульса рисунок полос, наблюдаемый в геле после пульс-электрофореза, имеет более дискретный характер, индивидуальные полосы оказываются более узкими и четко очерченными, то есть разрешение полос оказывается выше. Это позволяет точнее определять их положение в геле, расстояние миграции от старта и, в конечном итоге, размер хромосомных ДНК, мигрирующих в этих полосах. В связи с этими наблюдениями в большинстве дальнейших опытов мы использовали режим степпинга.
Использование разных систем для пульс-электрофореза, отличающихся типом поля и уровнем автоматизации, показало, что, в принципе, и при применении поперечно-переменного электрического поля (система TAFE - Рис. 18, А), и при использовании контролируемого гомогенного электрического поля (система CHEF - Рис. 18, Б-Г) можно добиться эффективного разделения хромосомных ДНК P. grylli.
Фракционирование всего спектра хромосомных ДНК Paranosema grylli в разных системах для пульс-электрофореза. А-в поперечно-переменном электрическом поле (TAFE) в самодельной установке для электрофореза при напряженности поля 10 В/см и возрастании времени пульса от 5 до 45 с в течение 24 ч в режиме степпинга; Б-Д-в контролируемом гомогенном электрическом поле (CHEF), Б- в аппарате CHEF-DRIII Pulsed Field Electrophoresis System, Bio-Rad Laboratories при напряженности поля 6 В/см и возрастании времени пульса в режиме интерполяции от 1 до 50 с в течение 24 ч; В -в аппарате Gene Navigator System, Pharmacia Biotech при напряженности поля 10 В/см и возрастании времени пульса в режиме интерполяции от 1 до 50 с в течение 24 ч; Г - Д - в том же аппарате при напряженности поля 6 В/см в режиме трехступенчатого степпинга: 12 с в течение 12 ч, 20 с в течение 28 ч, 45 с в течение 20 ч. На дорожках А - Г разделены хромосомные ДНК из внутриклеточных стадий (А, Б, Г) и спор P. grylli (В); на дорожке Д - конкатамеры ДНК фага лямбда, справа указан размер последних. Стрелками обозначено положение зоны компрессии, где мигрируют высокомолекулярные ДНК из ядер хозяина на дорожках с ДНК из препаратов внутриклеточных стадий P. grylli (см. п. 2.5.1.). Пунктирные отрезки с цифрами над ними обозначают положение и размер самой мелкой и самой крупной хромосомной ДНК микроспоридии на разных дорожках. Серыми цифрами на дорожках Б и В маркированы полосы соответствующего размера.
Однако при использовании TAFE наблюдали характерный для этой системы эффект фокусирования полос (Cantor et al. 1988, Gardiner 1992), который способствовал формированию дискретных тонких полос с четкими границами, но приводил к низкой эффективности разделения полос в нижней части геля. Более того, гель в системе TAFE из-за вертикальной конструкции камеры имеет небольшой размер (7.5 х 10 см), что создает дополнительные трудности для достижения хорошей сегрегации полос, если их число велико. В CHEF системах полосы получаются более широкие и диффузные, но при этом благодаря большому размеру геля (15 х 15 см) и отсутствию эффекта фокусирования удается добиться лучшей сегрегации полос как с сильно отличающимися по размеру хромосомными ДНК, так и с близкими по размеру молекулами. Системы CHEF полностью автоматизированы и позволяют без труда реализовывать протяженные по времени программы с разными режимами нарастания пульса, а также, при необходимости, варьировать другие параметры электрофореза в очень широком диапазоне. В связи с этими обстоятельствами большую часть экспериментов по молекулярному кариотипированию P. grylli мы провели, используя именно эти системы.
При применении описанных выше программ для фракционирования хромосомных ДНК P. grylli последние распределялись в геле в несколько зон, каждая из которых состояла из большого числа полос близкого размера, при этом интенсивность окрашивания отдельных полос сильно варьировала. Визуальные наблюдения были подтверждены с помощью денситометрического анализа электрофореграмм. На денситометрических профилях наблюдали значительное варьирование высоты и ширины пиков, а также скученное расположение и, местами, слияние последних. Высота пиков на денситограммах пропорциональна интенсивности свечения полос, а их ширина и положение соответствуют ширине и положению полос в геле. Полученные профили наглядно продемонстрировали вариабельность окрашивания отдельных полос и их низкое разрешение в "слабоделящихся" зонах кариотипа (Рис. 19).
Морфологические маркеры мейоза у P. grylli: сравнение с другими микроспоридиями
К сожалению, мы не наблюдали более поздних фаз мейоза, на которых начинается формирование веретена деления клетки. В то же время в работе Соколовой с соавторами у P. grylli описаны стадии, содержащие от одного до четырех одиночных, не ассоциированных друг с другом ядер. Однако никаких сопутствующих процессов в ядре клетки тогда выявлено не было (Sokolova, Dolgikh, Morzhina, Nassonova et al. 2003). Наши результаты дают основания полагать, что описанной ранее фазе монокариоза предшествует мейоз, и что эти события представляют собой кратковременное явление в жизненном цикле P. grylli и происходят на ранних этапах пролиферации паразита. Эти этапы оставались до недавнего времени плохо изученными, и, скорее всего, именно поэтому мейоз долгое время оставался неизвестным у данного вида. Другим возможным объяснением может быть факультативный характер протекания мейоза. Редукционное деление, возможно, представляет собой нерегулярный и необязательный этап в цикле развития этой микроспоридии. Бесполое размножение с нечастыми раундами полового процесса характерно для многих протистов (Dacks and Roger 1999).
Поскольку мы не имели возможность проследить полную последовательность мейотических событий и не можем сделать убедительных выводов о последующих этапах и "продуктах" наблюдаемого нами процесса, то мы вынуждены констатировать, что процесс мейоза у P. grylli нуждается в дальнейшем изучении.
Весьма интересным представляется тот факт, что P. grylli на самом деле не единственная мономорфная диплокариотическая микроспоридия, у которой описан мейоз. Очень похожие диплокарионы, в которых наблюдали синаптонемные комплексы, описаны у Nosema rivulogammari (Larsson 1983), однако этому наблюдению до сих пор не было уделено должного внимания. У этой микроспоридии синаптонемные комплексы наблюдали в диплокариотических споронтах. Были обнаружены многочисленные одноядерные стадии спорогонии, однако их дальнейшая судьба, равно как и способ формирования диплокариотических споробластов, не были прослежены. Осталось неясным, происходит ли деление ядра одноядерной клетки и образование диплокариона или имеется промежуточная четырехъядерная стадия. Ларсон отмечает, что четырехъядерные стадии ни разу не были обнаружены на электронно-микроскопических препаратах, однако клетки, которые "возможно могут быть интерпретированы как четырехъядерные", были отмечены при светомикроскопических исследованиях (op.cit.).
Мейоз у микроспоридий, как правило, наблюдается при переходе от мерогонии к спорогонии, обычно - в ранних споронтах (Loubes 1979a,b; Hazard and Brookbank 1984; Larsson 1983). В этой связи важно отметить, что синаптонемные комплексы у P. grylli обнаружены в клетках, не имеющих никаких следов дополнительного электронно-плотного слоя снаружи от плазмалеммы. Появление на поверхности клетки участков, на которых плазмалемма утолщается за счет формирования снаружи от нее дополнительного электронно-плотного слоя (часто называемого "примордиумом" экзоспоры), является первым сигналом перехода от мерогонии к спорогонии у P. grylli. Таким образом, стадии, в которых мы обнаружили синаптонемные комплексы, должны быть интерпретированы как меронты, что свидетельствует о весьма необычной позиции мейоза в жизненном цикле данной микроспоридии.
KARD 2-D PFGE анализ и Саузерн-гибридизация с ген-специфичными зондами показали, что сложный и трудно интерпретируемый паттерн полос в кариотипе Paranosema grylli обусловлен двумя причинами: комиграцией гетерологичных молекул одинакового размера и значительным варьированием размеров гомологичных хромосом. Основной результат исследования молекулярного кариотипа у P. grylli - это демонстрация сильно выраженного размерного полиморфизма хромосом у этого организма. При анализе причин этого феномена мы должны принять во внимание особенности популяционной структуры P. grylli, проблему плоидности ядер диплокариона и репродуктивную стратегию этой микроспоридии.
Наблюдаемый молекулярный кариотип представляет собой кумулятивную картину - результат наложения индивидуальных кариотипов 2-3 х 108 спор, изолированных из одного насекомого-хозяина. Неизвестно, являются ли такие инфрапопуляции P. grylli клональными или смешанными. Эта микроспоридия постоянно поддерживается в экспериментально заражаемой культуре сверчков с 1994 года. Можно было бы предположить, что многочисленные пассажи P. grylli привели к отбору и получению клонального изолята данной микроспоридии. Однако вариабельность, наблюдаемая в рисунке полос в кариотипах разных инфрапопуляции P. grylli, свидетельствует о том, что некоторая хромосомная гетерогенность в лабораторной популяции этого паразита все же существует.
Наши результаты показывают, что размер и число хромосом, мигрирующих в минорных полосах, варьируют среди инфрапопуляции. Мажорные полосы в основном остаются инвариантными (Рис. 23). KARD 2-D PFGE анализ продемонстрировал, что в минорных полосах мигрируют в геле хромосомные ДНК только одного типа, в то время как в мажорных полосах содержится набор как гомологичных, так и гетерологичных хромосомных ДНК. Разница в размерах между хромосомными ДНК, мигрирующими в пределах мажорной полосы, может составлять 5-20 т.п.н. Практически в этот же диапазон укладывается разница в размерах между полиморфными гомологами. Таким образом, вариабельность хромосом из мажорных полос, возможно, осталась невыявленной при сравнении кариотипов инфрапопуляции.
