Введение к работе
і . ,.
Актуальность темы исследования. Известно, что клетки млекопитающих под воздействием некоторых цитотоксических препаратов спонтанно приобретают устойчивость к широкому спеїггру липофильных агентов, таких, как колхицин, адриамицин, винбластин, винкристин. актиномицин Д, эпиподофиллотоксин, бромистый этидий и ряду других ядов. Этот Феномен, называемый множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), представляет серьезную проблему в химиотерапии опухолей человека. Подобный Феномен наблюдается также in vitro при культивировании клеток
ПОСТОЯННЫХ ЛИНИЙ В ПРИСУТСТВИИ Определенных ЯДОВ (Endicott, . Line. 1989;.Juranka at al., 1989).
Типичным механизмом* обеспечивающим устойчивость клеток к ядам и антиметаболитам является экспрессия в устойчивых клетках трапомембраннного гликопротеина с молекулярной массой 130-200 кДА, получившего название Р-гликопротеин (англ. "permeability"). Функционально Р-гликопротеин представляет собой энергозависимую помпу, удаляющую яды из устойчивых клеток, понижая тем самым внутриклеточное содержание яда. Р-гликопротеин кодируется одним из членов небольшого семейства
Генов - mdr генов, (multidrug resistant). СЄМЄЙСТВО mdr ГВНОВ
включает как минимум, три гена у грызунов и два гена у человека.
Таблица 1.
Классификация генов mdr в клетках различных видов:
Зкспероменты проведенные с применением- трансакции генов mdr показали.-что только гекы, относящиеся к I классу приводят
К раЗВИТИО феНОТИПа МЛУ (Dovault, Gross, 1990).
Повышенная экспрессия Р-гликопротеипа, приводящая к развитию Фенотипа МЛУ, достигается у млекопитающих при помощи 'различных механизмов, включая амплификацию генов, выявляемую как на молекулярном уровне, так и при анализа кзриотипз устойчивых клеток в виде- дополнительного генетического
Материала'(Roninson et al'.,' 1984; 5cott,o ot al., 1Э86; .Riordan
et al., 1986; Shen Qt al, , 1986; Teeter et al.,1986; van der Bliek et al., 1986), аКТИВаЦИЮ ТраНСКрИПЦИИ (Shen et al., 1988) И ТраНСЛЯЦИОННуЮ регулЯЦИЮ (Bradley et al., 1989).
Предполагается, что в регуляции экспрессии гена mdr
участвует КОМПЛеКС Fos/Jun, КОТОрЫЙ СВЯЗЬШЭвТСЯ С АР-1 СЭЙТОМ В
области промотора гена, причем для генов хомяка pgpi и мыши mdri/ib комплекс Foa/Jun осуществляет положительную регуляцию (Bhusman et al., 1992; ikegushi et al., 1991). Предполагается, что наличие добавочного сів-негативного элемента в области промотора мышиного гена mdr3, приводит к негативной регуляции
ЭКСПреССИИ ЭТОГО гена Комплексом Fos/Jun (Teeter et ьі., 1991).
Косвенно об'этом свидетельствуют следующие данные: 1.Обработка клеток ядами группы МЛУ вызывает повышение в 3-6 раз экспрессии
Гена foa, Предшествующее ПОВЫШвНИЮ ЭКСПреССИИ ГвНа mdr (Bhusman
et al., 1992); 2. В области промотора гена mdr 1 обнаружена
специфическая регуляторная последовательность
Б"...tgag/tca...3', представляющая собой сайт связывания для
Комплекса fos/jun (Ueda et al., 1987; Hsu et al.. 1990).
Имеются также сведения о прямой активации промотора mdr
ДНК-ТрОПНЫМИ агентами (Knhno,1989).
Таким образом исследование постоянных клеточных линий, обладающих МЛУ, может способствовать как пониманию механизмов, ' лежащих в основе селекционной амплификации генов, так и изучению координированной регуляции экспрессии. В данной работе в качестве модельной системы мы использовали клетки постоянных' клеточных линий, селектированных в присутствии бромистого этидия (БЭ). Используемые в ' работе клеточные линии характеризовались пониженным накоплением селективного агента и в ряде случаев проявляли. перекрестную устойчивость и имели кариологические маркеры амплификации генов (Гринчук и др., 1В83-, Гринчук, Игнатова, 1933; Ефимова и др.,- 1984).
Амплификация генов, как способ быстрой адаптации клеток к' меняющимся условиям окружающей среды, либо как модификация , генома клеток, специализированных для выполнения определенных Функции широко распространена у'Зукарио'т и часто встречается в
ГОНОМаХ раКОВЫХ .КЛеТОК И ПОСТОЯННЫХ' КЛеТОЧНЫХ ЛИНИЙ (Stark, VJahl, 19В4; Hamlin et al.',, 1984; Schinike, 1S84). Наиболее
привлекательной из предложенных гипотез амплификации является модель диспропорциональной репликации с последующей
- З -рекомбинацией (Schimke, 1984). ОСНОВНЫМ СЛ9ДСТВИЄМ «_ ЭТОЙ
гипотезы является положение о постоянной генерации клеткой экстрахромосомных молекул (эДНК), содержащих копии активно экспрессирущихся генов. Предполагается, что экстрахромосомные молекулы способны автономно реплицироваться, многократно повышая' уровень- амплификации гена , и, в ряде случаев,
ЭКСКреТИрОВаТЬСЯ КЛеТКОИ В окружающую среду. (Adams, 1985;
Сальников, 1990). Эта модель в целом остается недоказанной, хотя отдельные элементы теории имеют экспериментальное подтверждение.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы
состояла в выяснении специфических и неспецифических
компонентов молекулярно-генетических механизмов МЛУ в клетках
постоянных линия различного видового и тканевого происхождения
и их гибридах, полученных путем одно- и многошаговой селекции в
присутствии БЭ. Более того, поскольку обычно возникновение МЛУ
обычно ассоциировано с генными амплификациями, мы попытались
найти экспериментальные подходы к изучению более общего
явления, а именно, мы попытались проанализировать первичные
процэссы образования в клетке дополнительного генетического
материала. .
Конкретные задачи исследования состояли в следующем:
І.Для выяснения участия в механизме устойчивости Р-гликопротеинов, являющихся специфическим компонентом МЛУ, провести анализ структуры, перестроек и экспрессии генов mdr в клетках линий, устойчивых к БЭ.
2.Для выяснения возможных механизмов регуляции экспрессии гена mdr провести анализ структурних перестроек и экспрессии
Гена fos В КЛеТОЧНЫХ ЛИНИЯХ, ЭКСПреССИруюЩИХ mdr.
- З.Для выяснения неспецифических компонентов МЛУ провести изучение изменения активности эндогенных нуклеаз как развитие ответа' на стрессовые воздействия в клетках, не имеющих амплификации гена mdr и не экспрессирующих Р-гликопротеин.|
4.Для выяснения процессов приводящих к амплификации генов провести анализ экстрахромосомной ДНК в клетках, устойчивых к 'различным концентрациям БЭ, а также изучить связь процессов клеточной гибели в условиях стресса под воздействием ядов с процессами образования экстрзхромосомной и внеклеточной ДНК. Научная новизна работы. В' процессе выполнения работы мы
- A -
показали, что клатки различных линии, селектированные на устойчивость к БЭ и обладающие МЛУ содержат амплификацию генов mdr I класса.. сопровождающуюся повышенной экспрессией. Амплификация различных генов при селекции человеческого хронического промиелолеикоза К5в2 в присутствии адриамицина и БЭпозволяет предположить специфичность БЭ как субстрата для Р-гликопротеина, кодируемого геном mdr г. Мы показали, что в некоторых' клеточных, линиях устойчивость к возрастающим концентрациям БЭ может достигаться за счет регуляции экспрессии генов-mdr. Данные об амплификации, и экспрессии гена fos в некоторых линиях с МЛУ позволяют предполагать,, что этот ген может участвовать как в позитивной,- так и в негативной регуляции экспрессии гена mdr.
Кроме того, нам удалось обнаружить довольно редкий случаи так называемой "нетипичной ЯЛУ" - клетки обладают устойчивостью" к высоким концентрациям БЭ в отсутствии амплификации, и экспрессии генов mdr. Мы показали, что в . этих линиях приобретение устойчивости к БЭ сопровождается увеличением активности Zn - независимой звдонуклеазы, что возможно, имеет отношениз к изменению взаимодействия ДНК-тропных агентов с внутриклеточными мишенями.
Нам удалось получить некоторые новые данные об- образовании амплифицированных последовательностей, которые укладываются в рамки теории амплификации Шимке (schimke, 1934). В частности мы показали, что в клетке существует-внерепликативныи синтез ДНК, в том числе в условиях стресса под воздействием ядов, приводящий к 'генерации эДНК, содержащих амплиФицированные последовательности. Копии амплифицированных последовательностей выделяются клеткой в окружающую среду. Более того, мы показали, что Фракция оДНК -в клетке неоднородна по составу и частично происходит вследствии .процэссов, не связанных с оверрепликацией. а, возможно с делецией, репарацией, рекомбинацией. Мы впервые показали, что в процессах образования эДНК участвует Zn -независимая эндонуклеаза.
Практическая ценность работы. ' Получонные результаты
углубляют имеющиеся представления о молекулярных механизмах
'устойчивости клеток к ядам и 'антиметаболитам. Данные о
амшшФИкации'И экспрессии гена mdr в клетках, устойчивых к БЭ
значительно дополняют представления о Феномене МЛУ и имеют не
только1 теоретическую, но и практическую цанность в связи с широким использованием подобных ДНК-тропных агентов в химиотерапии опухолей. Данные об амплификации и экспрессии гена foe в некоторых линиях с МЛУ могут способствовать пониманию механизма регуляции экспрессии гена mdr. Обнаруженные нами линии с 'нетипичной устойчивостью" могут .служить эксперементальнои моделью для изучения других "Вв mdr-зависимых" механизмов обеспечения устойчивости клеток к ядам и антиметаболитам. Предложенный метод анализа гетерогенности Фракции эДНК с использованием импульсного мёчегош БДУ открывает широкие возможности для дальнейшего-изучения Феномена образования и Функционирования эДНК ' с привлечением гибридизационного анализа конкретных Фракций. Сведения об экскреции клетками амплифицированных последовательностей, возможно содержащих копии активно экспрессиругощихся генов, могут ' представлять интерес для практической онкологии.
Апробация- работы. Материалы диссертации были представлены нэ и Международном совещании по клеточному ядру (Суздаль 1889), на Всесоюзном совещании "Структура и Функции клеточного ядра" гГродно, 1990), на 15 Международном конгрессе по биохимии (Иерусалим, 1991)., на її Всесоюзной конференции "Геном человека" (Переславль-Залесский, 1991), на Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1992 v
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения,'" обзора литературы, материалов ' и методов исследования, результатов .собственных исследовании, обсуждения, выводов* и списка литературы, содержащего публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 25 ' рисунжзии и 7 таблицами.
