Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Болезнь Альцгеймера и сосудистое слабоумие в сравнительном аспекте 10
1.2. Структуры передне-базального мозга и гипоталамуса человека 22
1.3. Влияние половых стероидных гормонов на когнитивные функции и состояние мозга 34
1.4. Эстрогеновые рецепторы и 36
1.5. Ароматаза 38
1.6. Методы оценки метаболической активности нейронов 39
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1. Общая характеристика материала и рутинных методов исследования 47
2.2. Иммуноцитохимия 55
2.3. Молекулярно-биологическое исследование мамиллярных тел .68
2.4. Гибридизация in situ мРНК вазопрессина 73
2.5. Компьютерный анализ .74
Глава 3. Результаты собственных исследований .77
3.1. Цитоархитектоника ядер передне-базального мозга и гипоталамуса при старении и болезни Альцгеймера .77
3.2. Изменения цитоархитектоники и метаболической активности нейронов передне-базального мозга и гипоталамуса при сосудистой деменции .99
3.3. Нейроглиальный индекс в ядрах передне-базального мозга и гипоталамуса при болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии .110
3.4. Иммуноцитохимическое исследование эстрогеновых рецепторов и в ядрах передне-базального мозга и гипоталамуса при болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии 119
3.5. Сплайсинговые варианты мРНК эстрогенового рецептора в медиальном мамиллярном ядре 143
3.6. Иммуноцитохимическое исследование ароматазы 162
3.7. Иммуноцитохимическое исследование мутантного белка УБВ+1 – маркера нарушения протеасомы 178
Глава 4. Обсуждение полученных результатов .180
4.1. Изменения метаболической активности нейронов при старении и болезни Альцгеймера .180
4.2. Метаболические изменения в ядрах гипоталамуса и передне-базального мозга при сосудистом слабоумии .188
4.3. Нейроглиальный индекс в ядрах передне-базального мозга и гипоталамуса при болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии 195
4.4. Эстрогеновые рецепторы и в ядрах передне-базального мозга и гипоталамуса при болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии 198
4.5. Сплайсинговые варианты мРНК эстрогенового рецептора в медиальном мамиллярном ядре .207
Выводы .222
Практические рекомендации .226
Список сокращений 228
Список литературы 229
- Структуры передне-базального мозга и гипоталамуса человека
- Иммуноцитохимия
- Иммуноцитохимическое исследование эстрогеновых рецепторов и в ядрах передне-базального мозга и гипоталамуса при болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии
- Метаболические изменения в ядрах гипоталамуса и передне-базального мозга при сосудистом слабоумии
Структуры передне-базального мозга и гипоталамуса человека
В течение многих лет холинергическая система передне-базального мозга ассоциируется со снижением познавательных функций при старении (Kesner, 1988) и болезни Альцгеймера (БоАл) (Боголепова, 2009; Bird et al., 1983). В составе передне-базального мозга различают базальное ядро Мейнерта (БЯМ), диагональное поле Брока и медиальное ядро перегородки. Вертикальное ядро диагонального поля Брока (ВЯДБ) и базальное ядро Мейнерта (БЯМ) являются основными холинергическими ядрами передне-базального мозга человека (Mesulam et al., 1983; Saper and Chelimsky, 1984). Проекции ВЯДБ (Ch2) направляются в гиппокамп и гипоталамус, а из БЯМ (Ch4) – в новую кору и амигдалу (Mesulam et al., 1983). По меньшей мере 70% нейронов ВЯДБ и 90% клеток БЯМ – холинергические, ввиду наличия в них специфических биохимических маркеров: холин-ацетилтрансферазы (ХAT), синтетического фермента ацетилхолина, и его гидролитического фермента ацетилхолинэстеразы (AХЭ) (Mesulam et al., 1983). Перикарионы, содержащие АХЭ, почти всегда содержат иммунореактивное вещество ХАТ (Mesulam et al., 1983). Помимо этого в ядрах передне-базального мозга присутствуют ГАМК-эргические клетки (Gylyas et al., 1991). Холинэргические нейроны ВЯДБ и БЯМ поглощают холин для следующих целей: 1) он фосфорилируется до образования фосфохолина, который в дальнейшем превращается в мембранный фосфатидилхолин; и 2) ацетилируется с образованием нейротрансмиттера ацетилхолина, участвующего в познавательных функциях (Богацкая и Потапенко, 1987; Muir, 1997). Содержание ХАТ и АХЭ уменьшается в коре, гиппокампе, вентральном отделе полосатого тела и передне-базальном мозге пациентов с БоАл (Kasa et al., 1997; Shinotoh et al., 2000). Повреждение холинэргической системы, имеющей огромное значение для памяти и других познавательных функций (Swaab et al., 1998), лежит в основе классической холинэргической гипотезы БоАл, утверждающей, что утрата холинэргической функции является основной причиной нарушения познания при БоАл (Collerton et al., 1986; Nasman et al., 1991; Sternbach 1998). Так как в клеточных популяциях Ch1 и Ch3 передне-базального мозга обнаружены лишь единичные холинэргические нейроны (Mesulam et al., 1983), предметом исследования в настоящей работе стали формации Ch2 (ВЯДБ) и Ch4 (БЯМ).
Базальное ядро Мейнерта
Базальное ядро Мейнерта (БЯМ) - основной источник холинэргической иннервации новой коры (Mesulam et al., 1983). БЯМ представлено крупными нейронами, простирающимися рострально от срединной перегородки и диагонального поля Брока через безымянную субстанцию до каудальной части бледного шара (Амунц, 2003; Saper and Chelimsky, 1984). Плотность расположения нейроцитов отличается асимметрией и выше в левой половине (Амунц, 2006). Активность холинэргических нейронов БЯМ при нормальном старении снижается. Об этом свидетельствует уменьшение активности ХАТ и АХЭ с возрастом (Sparks et al., 1992). Помимо этого, при старении в БЯМ сокращаются объёмы ядрышек (Mann et al., 1984) и размеры аппарата Гольджи (Salehi et al., 1994), что также указывает на снижение метаболических/синтетических процессов в холинэргических нейронах. Литературные сведения об изменениях числа нейронов БЯМ при старении довольно противоречивы. По данным одних авторов потери нейронов в этом ядре составляют от 23% до 90% (deLacalle et al., 1991; Lowes-Hummel, 1989; McGeer et al., 1977), тогда как в других работах гибели нейронов БЯМ обнаружено не было (Chui et al., 1984; Clark et al., 1983). Возможным объяснением указанных противоречий являются сморщивание нейронов БЯМ, утрата холинэргических маркеров и топографические различия, описанные в тематических обзорах Flood и Coleman (1988) и Swaab с соавт. (1998).
БЯМ поражается при многих нейропсихических заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера (Price et al., 1985), болезнь Паркинсона (Mufson et al., 1991), синдром Дауна (Casanova et al., 1985), болезнь Пика (Uhl et al., 1983), болезнь Крейтцфельдта-Якоба (Arendt et al., 1984), синдром Ретта (Wenk, 1997), и хронический алкоголизм (Arendt et al., 1983; Cullen and Halliday, 1995). Особенно выраженными являются изменения БЯМ при БоАл, которые проявляются прогрессивной дегенерацией холинэргических нейронов (Jacobs et al., 1992; Vogels et al., 1990), снижением метаболической активности нейронов (Salehi et al., 1994; Swaab et al., 1998), серьёзными нарушениями цитоскелета, сопровождающимися накоплением гиперфосфорилированного тау (Swaab et al., 1992), уменьшением ретроградного транспорта фактора роста нервов из коры в БЯМ (Mufson et al., 1995) и утратой высоко и низкоаффинных нейротрофиновых рецепторов (Mufson et al., 1996; Salehi et al., 1996; Salehi et al., 2000).
Вертикальное ядро диагонального поля Брока
Вертикальное ядро диагонального поля Брока (ВЯДБ), соответствующее клеточной группе Ch2 передне-базального мозга человека, является основным источником холинергической иннервации гиппокампа (Отмахов, 1993; Mesulam et al., 1983; Mesulam et al., 1984; Saper and Chelimsky, 1984), который поражается при БоАл более всех других структур мозга (Salehi et al., 1995; Swaab et al., 2002). Следует отметить, что помимо холинергических ядер гиппокамп получает афферентные волокна, содержащие различные нейротрансмиттеры, из многих других корковых и подкорковых формаций. Эти проекции на сегодняшний день изучены относительно слабо (Amaral and Insausti, 1990). ВЯДБ расположено вдоль вентромедиальной границы перегородки. На препаратах, окрашенных по Нисслю, это ядро характеризуется очень крупными (20-25 x 30-40 мкм) гиперхромными нейронами веретеновидной формы (Mesulam et al., 1983; Mesulam et al., 1984; Saper and Chelimsky, 1984). По меньшей мере 70% нейронов ВЯДБ - холинергические (Mesulam et al., 1983). Холинергические проекции, направляющиеся из ВЯДБ в гиппокамп через свод, отвечают за способность усваивать и воспрозводить визуально-пространственные навыки. Эта функциональная особенность была продемонстрирована при разрушении свода у мартышек (Harder et al., 1996). Несмотря на то, что выраженный дефицит системы холинэргических проекций из ВЯДБ в гиппокамп типичен для БоАл (Vogels et al., 1989), сведения о степени дегенерации ВЯДБ при БоАл носят противоречивый характер. По данным Mufson с соавт. (1989) и Vogels с соавт. (1990) при БоАл в ВЯДБ не наблюдается гибели клеток, тогда как Gertz и соавт. (1987) обнаружили в этом ядре значительное сокращение преимущественно холинергических нейронов. В отличие от БЯМ, количество нейронов ВЯДБ, экспрессирующих мРНК рецепторов фактора роста нервов, при БоАл не изменяется (Higgins and Mufson, 1989).
Туберомамиллярное ядро гипоталамуса человека
Туберомамиллярное ядро (ТМЯ) представлено обширными скоплениями крупных нейронов в туберальном и заднем гипоталамусе, расположенными над ростральной частью латерального туберального ядра, вокруг свода и каудального отдела мамиллярных тел (Airaksinen et al., 1991; Saper, 1990; Swaab, 1997). В ТМЯ насчитывается около 64000 крупных мультиполярных нейронов с эксцентричными ядрами и периферически расположенным веществом Ниссля, которые разделяют на несколько подгрупп (Airaksinen et al., 1991; Saper, 1990; Swaab, 1997). Предметом исследования в настоящей работе стала главная вентральная группа этого ядра, соответствующая классическому ТМЯ (Airaksinen et al., 1991). Нейроны ТМЯ секретируют гистамин мозга. Многочисленные проекции гистаминэргических клеток ТМЯ направляются через гипоталамус в передне-базальный мозг, амигдалу, кору головного мозга, таламус, покрышку моста и среднего мозга и мозжечок (Airaksinen et al., 1991; Brown et al., 2001; Panula et al., 1990; Panula et al., 1993; Passani et al., 2000; Trottier et al., 2002; Wada et al., 1991). Гистамин, вырабатываемый нейронами ТМЯ, выступает в роли нейротрансмиттера и/или нейромодулятора, регулирующего нейроэндокринные и нейроиммунные функции, циркадианные ритмы, циклы сна и бодрствования. ТМЯ считается главным центром бодрствования (Сунцова и соавт., 1998; Сунцова и Дергачёва, 2002; Henderson, 1997). Помимо этого, гистаминэргическая система ТМЯ участвует в регуляции температуры тела, экскреции жидкости, подавлении пищевого поведения, контроле сосудов головного мозга, обучения и памяти, возбуждения, волнения, энергетического метаболизма мозга, активизации симпатической нервной системы, высвобождения гормонов из гипофиза и центральных аминэргических нейротрансмиттеров под влиянием стресса, антиноцицепции, анальгезии и локомоторной активности (Brown et al., 2001; Huston et al., 1997; Panula et al., 2000; Passani et al., 2000; Wada et al., 1991). Выделение гистамина усиливается при экстремальных состояниях, таких как дегидратация и гипогликемия, а также под воздействием различных стрессоров (Brown et al., 2001). По мнению некоторых авторов гистаминэргическую систему ТМЯ можно назвать центром, активизирующим работу всего головного мозга (Passani et al., 2000). Более того, ТМЯ имеет важное значение для пластичности мозга и функционального восстановления после повреждения центральной нервной системы (Huston et al., 1997).
Иммуноцитохимия
Окрашивание аппарата Гольджи
Для иммуноцитохимического окрашивания аппарата Гольджи использовались поликлональные антитела, полученные в результате иммунизации кролика пептидом HG-130, сиалогликопротеином средней цистерны аппарата Гольджи (АГ) нейронов человека (130 кДа). После депарафинирования, регидратации в спиртах нисходящей концентрации, споласкивания в дистиллированной воде и промывания в Трис-фосфатном буфере (0.05M Tris and 0.15M NaCl, pH 7.6) (TBS), срезы помещались в микроволновую печь при температуре 900C дважды по 5 минут в 1% растворе ZnSO4 для оптимального высвобождения антигена HG-130. Затем срезы споласкивали в дистиллированной воде, промывали в буфере TBS в течение 10 минут, инкубировали в TBS, содержащем 5% молочного порошка в течение 1 часа, споласкивали в TBS, инкубировали в 10% растворе лошадиной сыворотки в течение 10 минут для исключения фонового окрашивания, споласкивали в TBS и инкубировали с первичными антителами (анти-HG-130), разведенными 1:1000 в фосфатном буфере (pH 7.6), в течение 1.5 часов при комнатной температуре и в течение ночи при 40C. На следующий день срезы промывали в растворе TBS два раза по 7 минут и инкубировали с козьей сывороткой AKON, распознающей иммуноглобулины кролика, в разведении 1:100 в TBS в течение 1 часа при комнатной температуре, затем снова споласкивали в TBS дважды по 7 минут, инкубировали с пероксидазо-антипероксидазным комплексом (ПАП) в разведении 1:1000 в TBS в течение 30 минут при комнатной температуре и споласкивали в TBS. В качестве хромогена использован 3 ,3 -диаминобензидина тетрагидрохлорид в растворе TBS, содержащем перекись водорода. Интенсификация окраски достигнута добавлением сульфата аммонийного никеля. После проявления срезы споласкивались в TBS дважды по 7 минут, затем были дегидратированы в спиртах восходящей концентрации и ксилоле и заключены в синтетической среде «Entellan». Специфичность антител HG-130
Поликлональные антитела, распознающие 18 аминокислот специфичного сиалогликопротеина аппарата Гольджи человека (Croul et al., 1990; Gonatas et al., 1989), присоединённых к тироглобулину посредством глутаральдегида, были получены через 7 месяцев после иммунизации, и оказались аналогичными ранее использованным MG-160 (Ishunina et al., 1999; Lucassen et al., 1993; Lucassen et al., 1994; Salehi et al., 1994; Salehi et al., 1995a; Salehi et al., 1995b).
Для подтверждения специфичности новых антител HG-130 выполнены следующие тесты: соседние срезы гипоталамуса человека окрашивались 1) один новыми антителами HG-130, а другой – хорошо проверенными антителами MG-160; 2) один антителами HG-130, а другой – преиммунной сывороткой. Окрашивание новыми антителами HG-130 было идентичным MG 160. С помощью обоих антител аппарат Гольджи выявлен в гипоталамических нейронах в виде характерного гранулярного цитоплазматического окрашивания вокруг ядра. Локализация иммуноцитохимического окрашивания в аппарате Гольджи (АГ), а не в эндоплазматической сети была отдифференцирована под световым микроскопом. Так, в супраоптическом ядре, с помощью антител HG 130 окрашивался околоядерный участок, соответствующий месту расположения АГ, тогда как в периферической части цитоплазмы, где локализуется эндоплазматическая сеть, окрашивания не наблюдалось.
Иммуноцитохимического окрашивания не выявлено и при использовании преиммунной сыворотки. Дополнительно проведен западный блоттинг.
Западный блоттинг для HG-130
Для проведения западного блоттинга фрагменты лобных извилин от различных случаев, полученные в рамках работы Нидерландского Банка Мозга, были быстро заморожены в жидком азоте и хранились при температуре -80oC. Кусочки лобной извилины объёмом приблизительно 1 mm3 помещались в 500 мкл суспензионного буфера (0.1M NaCl, 0.01M Tris-HCl, 0.001M EDTA (pH 8.0), 100 мкг/мл фенилметилсульфонил фторида, леупептин (10 мкг/мл)) в пластиковые пробирки. Ткань мозга гомогенизировали с помощью ультра-турракса и центрифугировали в течение 5 минут со скоростью 14000rpm при 4oC. 15 мкл полученной жидкости перемешивали с равным объёмом буфера, состоящего из (0.01M Tris-HCl (pH 6.8), 0.02M DTT, 4% SDS, 0.2% голубого бромофенола, 20% глицерин), кипятили в течение 5 минут, помещали в 7.5% SDS полиакриламидный гель, который подвергался электрофорезу при 30мA, 250 Ватт в буфере, содержащем (0.025M Tris, 0.25M глицина (pH 8.3), 0.1% SDS). По завершении электрофореза осуществлялся блоттинг геля на нитроцеллюлозную бумагу (размер пор 0.45 мкм) в течение 1 часа при 100мA, 100Вольт, 250 Ватт. Используемые при этом кусочки фильтровальной бумаги были пропитаны в Тоуниновском буфере (содержит 0.025M Tris-HCl, 0.2M глицина, 20% метанола). Нитроцеллюлозные бумаги инкубировались на водяной бане при температуре 95oC в течение 10 минут, споласкивались в супермиксе (состоит из 0.15M NaCl, 0.05M Tris-HCl (pH 7.6), 0.5% Тритона X-100, 0.25% желатина) в течение 10 минут, инкубировались с антителами HG-130 в разведении 1:1000 в течение 1 часа при комнатной температуре с последующей инкубацией при температуре 4oC в течение ночи). На следующий день нитроцеллюлозные бумаги споласкивали в супермиксе 2 раза в течение 10 минут, инкубировали со вторичными антителами свиньи, распознающими иммуноглобулины кролика в разведении 1:1000 в супермиксе, в течение 1 часа при комнатной температуре, споласкивали в буфере TBST (содержит 0.15M NaCl, 0.065M Tris-HCl (pH 7.5), 0.05%Tween) два раза по 10 минут и инкубировали в растворе субстрата западного блоттинга «Lumi Light» в темноте в течение 5 минут. Для распознавания окраски на нитроцеллюлозные бумаги помещали специальную хемолюминесцентную плёнку, которую спустя две минуты проявляли в растворе D-19 (Kodak) в течение 4-х минут, споласкивали в проточной воде и фиксировали в максфиксе (Kodak). На проявленной плёнке выявлено три полосы (Рис. 4). Полоса, соответствующая размеру 130 кД, принадлежит белку HG-130 АГ, полоса 68 кД соответствует размеру вторичных антител, что подтверждено отдельным окрашиванием без первичных антител (Рис. 4В), тогда как полоса 50 кДа выявлена при окраске преиммунной сывороткой (Рис. 4С). Следует отметить, что окрашивания преиммунной сывороткой в парафиновых срезах не обнаружено, так что ни вторичные антитела, ни преиммунная сыворотка в изучаемом материале неспецифической иммуноцитохимической реакции не дают.
Иммуноцитохимическое окрашивание соматостатина
Для точного определения анатомических границ вентромедиального ядра было проведено иммуноцитохимическое окрашивание соматостатина (Timmers et al., 1996) согласно следующему протоколу: после депарафинирования и регидратации срезы промывались в растворе TBS, кипятились в микроволновой печи при 700 W 2 раза в течение 5 минут в 0.05M цитратном буфере (pH 4.0), охлаждались до комнатной температуры в течение 20 минут, промывались в TBS, пре-инкубировались в растворе TBS, содержащем 5% молочного порошка (pH 7.6) в течение 1 часа и инкубировались с поликлональными кроличьими антителами, распознающими соматостатин 1-12 (S320) в разведении 1:500 в супермиксе (0.25% желатин, 0.5% Тритон-X в 5% растворе молочного TBS, pH 7.6) в течение 1 часа при комнатной температуре и при 40 в течение ночи. На следующий день срезы промывались в 5% растворе молочного TBS (pH 7.6), инкубировались со вторичными антителами козы, распознающими иммуноглобулины кролика (в разведении 1:100 в супермиксе) в течение 1 часа, снова промывались в 5% растворе молочного TBS, инкубировались с третичными антителами PAP в разведении 1:1000 в супермиксе в течение 30 минут, промывались в 0.1M буфере Tris-HCl (pH 7.6), затем инкубировались в TBS, содержащем 3-3 -диаминобензидин, 0.01% H2O2 и 0.3% сульфата аммонийного никеля, дегидратировались в спиртах восходящей концентрации и ксилоле, после чего были заключены под покровные стёкла в среде Entellan. Иммуноцитохимическое окрашивание нейрофибриллярных клубков
Для определения гиперфосфорилированного тау (AT8) (Cummings et al., 2002), использовались срезы базального ядра Мейнерта и супраоптического ядра, соседние окрашенным антителами, распознающими аппарат Гольджи и эстрогеновые рецепторы. Они были депарафинированы, регидратированы, промыты в дистиллированной воде, инкубированы в метаноле, содержащем 0.3% H2O2, снова промыты в дистиллированной воде, затем в 0.05% M Tris-HCl, преинкубированы в молочном буфере Tris (0.05% M Tris-HCl, содержащем 5% молочного порошка) в течение 10 минут и инкубированы с антителами AT8 (Cummings et al., 2002) в разведении 1:300 в молочном буфере Tris при температуре 40 C в течение ночи. На следующий день срезы были промыты в буфере Tris 3 раза по 10 минут, инкубированы со вторичными антителами кролика, распознающими иммуноглобулины мыши, в разведении 1:100 в молочном буфере Tris в течение 1 часа при комнатной температуре, промыты в буфере Tris 3 раза по 10 минут и проявлены в растворе 3 ,3 - диаминобензидина тетрагидрохлорида, содержащем 0.0001% H2O2 в течение 20 минут, затем докрашены гематоксилином и эозином в течение 2 минут, промыты в проточной воде в течение 5 минут, дегидратированы и заключены в синтетическую среду. Иммуноцитохимическое окрашивание эстрогенового рецептора а
Иммуноцитохимическое исследование эстрогеновых рецепторов и в ядрах передне-базального мозга и гипоталамуса при болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии
Иммуноцитохимическое окрашивание ЭРос и ЭРр в БЯМ человека выявлено в ядрах нейронов и в виде гранул в их цитоплазме (Рис. 41, 42). Фоновая окраска практически отсутствовала. Помимо крупных нейронов эстрогеновые рецепторы обнаружены в астроцитах, микроглии, кровеносных сосудах и мелких нейронах. В контрольной группе выраженных половых и возрастных отличий в интенсивности окрашивания нейронов на ЭРос и ЭРР не обнаружено, тогда как у пациентов с БоАл интенсивность экспрессии эстрогеновых рецепторов была значительно выше, чем у контрольных случаев (Рис. 41, 42). Содержание ЭРос в БЯМ было выше, чем ЭРр. Причём, ЭРос локализовался главным образом в ядрах нейронов, а ЭРР - в цитоплазме (Таблица 16, Рис 41, 42). Ни длительность фиксации, ни промежуток между моментом смерти и взятием материала не влияли на окрашивание эстрогеновых нейронов в контрольной группе и группе с БоАл при использовании теста линейной регрессии. В среднем, в контрольной группе было изучено 308+25 нейронов БЯМ для каждого случая на предмет ЭРос и 314+23 для ЭРр. В группе с БоАл для каждого случая было проанализировано 211+15 на предмет ЭРос и 179+17 на ЭРр. Согласно тестам Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка распределение полученных значений было нормальным. Половые и возрастные особенности ЭР а и ЭРр в контрольной группе.
По результатам двухфакторного теста ANOVA процентное содержание нейронов БЯМ с ядерными и цитоплазматическими эстрогеновыми рецепторами а и Р в контрольной группе от пола и возраста не зависело.
Анализ линейной регрессии позволил выявить тенденцию к положительной корреляции процента нейронов с ядерными ЭРос с возрастом (r=0.305, p=0.053), что означает некоторое увеличение содержания ЭРос в процессе старении. Однако, после разделения по половому признаку, статистически достоверная положительная корреляция процента нейронов БЯМ с ядерными ЭРос и возрастом была установлена у мужчин (г=0.612, р=0.003) и отсутствовала у женщин (г=0.011, р=0.963).
Число нейронов БЯМ с цитоплазматическими ЭРР увеличивалось при старении в контрольной группе независимо от пола (г=0.0.323, р=0.042) (Таблица 16, 18).
ЭРапри БоАл
У пациентов с БоАл в базальном ядре Мейнерта отмечено более высокое содержание нейронов с ядерными ЭРос, чем у контрольных случаев (главный эффект теста ANOVA (ГЭ): F(1;23) = 9.992; p = 0.005). В то же время различий в количестве нейронов БЯМ с цитоплазматическими ЭРос между контрольными случаями и пациентами с БоАл установлено не было (Таблица 17, 19, Рис. 43). Половые различия экспрессии ЭРос в группе с БоАл отсутствовали (Таблица 17, 19). ЭРаприБоАл
У пациентов с БоАл процентное содержание нейронов БЯМ с цитоплазматическими (ГЭ: F(1;23) = 6.437; p = 0.019) и ядерными ЭРР (ГЭ: F(1;23) = 4.805; p = 0.039) оказалось выше, чем у контрольных случаев (Рис. 28, 29). Комбинированный эффект БоАл и пола был значительным для процента нейронов БЯМ, содержащих ядерные ЭРр (ГЭ: F(2;23) = 4.049; p = 0.033; эффект взаимодействия (ВЭ): F(1;23) = 6.137; p = 0.022). Количество нейронов с ядерными ЭРР оказалось выше у женщин с БоАл, чем у контрольных женщин (ГЭ:F(2;17) = 5.460; p = 0.017) (Таблица 19). После разделения группы с БоАл по полу, влияние БоАл на процент нейронов БЯМ с ядерными ЭРР оказался значительным у женщин (ГЭ: F(1;10) = 7.849, p = 0.019), но не у мужчин (ГЭ: F(1;10) = 0.0001, p = 1.000).
Генотип аполипопротеина Е (ApoE) не влиял на процент нейронов с цитоплазматическими (p = 0.960) и ядерными (p = 0.169) ЭРос и цитоплазматическими (p = 0.863) и ядерными (p = 0.492) ЭРР по результатам теста ANOVA. Рис. 43 отражает различия в количестве нейронов с ядерными и цитоплазматическими ЭРос и ЭРР между контрольными случаями и пациентами с БоАл (группа 1) независимо от пола, тогда как таблица 19 представляет половые различия в контрольной и группе с БоАл (группа 2).
Вертикальное ядро диагонального поля Брока ЭРа
Окрашивание ЭРа показано в ядрах и цитоплазме нейронов без существенных половых и возрастных различий (Таблицы 20 и 21). Значительно более высокая интенсивность окраски ядерных ЭРа отмечена в ВЯДБ пациентов с БоАл по сравнению с контрольными случаями (Рис. 44). Согласно анализу линейной регрессии ни длительность фиксации, ни промежуток между моментом смерти и взятием материала не влияли на процентное содержание нейронов с ядерной и цитоплазматической окраской ЭРа и ЭРр. Следует подчеркнуть, что ядерная локализация ЭРа и ЭРР была обнаружена и у молодых контрольных случаев с более длительным промежутком между моментом смерти и взятием материала. Более того, систематическое исследование на материале экспериментальных животных показало, что окрашивание ЭРа и ЭРР довольно резистентно к временному интервалу до фиксации.
ЭР а в контрольной группе
По результатам однофакторного анализа ANOVA и теста Крускалл-Уоллис статистически достоверных различий в процентном содержании нейронов ВЯДБ с ядерными и цитоплазматическими ЭРа среди четырёх групп контрольных случаев не обнаружено. Более того, указанный показатель при старении существенно не изменялся (Таблицы 20 и 22). Анализ линейной регрессии выявил положительную корреляцию генотипа АРОЕ (є2 єЗ є4) с процентом нейронов ВЯДБ с цитоплазматическими ERa (г = 0.767, р = 0.044) у пожилых контрольных случаев.
ЭРа у пациентов с БоАл
У пациентов с БоАл обнаружено значительно более высокое содержание ядерных ЭРа в нейронах ВЯДБ, чем у контрольных случаев (ME (главный эффект): F(l;21) = 9.415, р = 0.006 по данным ANOVA и р = 0.013126 согласно тесту Манн-Уитни) (Таблицы 21 и 23, Рис. 44 и 45). У людей с БоАл с возрастом увеличивалось процентное содержание нейронов с цитоплазматическими ЭРос (г = 0.701, р = 0.024). Влияние генотипа АРОЕ на содержание ЭРос в нейронах не установлено. После разделения случаев по полу, оказалось, что процент нейронов с цитоплазматическими ЭРос увеличивался с возрастом у мужчин с БоАл (г = 0.865, р = 0.058) и в контрольной группе (г = 0.965, р = 0,008), и практически не изменялся у женщин этих двух групп.
Метаболические изменения в ядрах гипоталамуса и передне-базального мозга при сосудистом слабоумии
Магнитно-резонансные и позитрон-эмиссионные исследования продемонстрировали снижение общего уровня метаболизма в мозге пациентов с сосудистой деменцией (СС), зависевшее от локализации и распространённости ишемических повреждений (Mielke et al., 1992; Sultzer et al., 1995; Capizzano et al., 2000; Herminghaus et al., 2003). Однако, с помощью указанных методов изучение небольших структур мозга и специализированных групп нейронов оказалось невозможным. Более того, в литературе отсутствовали сведения о возможных изменениях в гипоталамических нейроэндокринных ядрах и холинэргических структурах передне-базального мозга, участвующих в регуляции памяти. Дополнительный интерес представляло изучение супраоптического (СОЯ) и инфундибулярного ядер (ИНФ), что связано с особенностями клинической симптоматики СС. Так, нарушения синтеза вазопрессина в СОЯ могут лежать в основе частого клинического симптома СС – недержания мочи, а также иметь отношение к изменениям артериального давления у этой группы людей (Sachdev et al., 1999; Pohjasvaara et al., 1998). Что касается инфундибулярного ядра, то это – один из основных источников гонадолиберина (ГнРГ) и нейропептидов, участвующих в регуляции пищевого поведения у человека. При БоАл в этом ядре обнаружен гиперфосфорилированный тау, лежащий в основе нейрофибриллярных клубков (Swaab, 2003; Swaab, 2004). Как было сказано ранее, размер АГ и перикарионов нейронов являются достоверными параметрами изменения метаболизма в различных группах клеток, при различных физиологических состояниях и неврологических заболеваниях независимо от типа нейротрансмиттеров, используемых нейронами (Ishunina and Swaab, 2003), и потому использовались для определения нарушений метаболической активности у пациентов с СС в этой работе. Дополнительно к указанным параметрам впервые проведена гибридизация in situ мРНК вазопрессина в дорсолатеральной части СОЯ людей с СС.
В настоящем исследовании впервые показано снижение метаболической активности нейронов супраоптического (СОЯ), инфундибулярного (ИНФ) и туберомамиллярного (ТМЯ) ядер пациентов с СС. Напротив, в вертикальном ядре диагонального поля Брока (ВЯДБ) наблюдалось увеличение размеров как АГ, так и перикарионов, указывающих на повышение метаболической активности нейронов (Swaab et al., 2002; Ishunina and Swaab, 2003). Значимых изменений иммунореактивности АГ в медиальном мамиллярном ядре (ММЯ) обнаружено не было. Перечисленные изменения могут ассоциироваться со снижением мозгового кровотока, обусловленного ишемическими повреждениями и сосудистой патологией у пациентов с СС. Вариабельность метаболических нарушений у пациентов с СС, отмеченная и в настоящей работе, может быть связана с: 1) различиями локализации и распространённости ишемических повреждений (при этом подкорковые повреждения играют главную патогенетическую роль (Parnetti et al., 1990) и 2) степенью тяжести деменции (колебания по шкале Рейсберга составили от 3 до 7), которая в свою очередь в значительной мере зависит от объёма метаболически неактивной ткани (Mielke et al.,1992). Особый интерес представляет более выраженное снижение метаболизма нейронов СОЯ и ТМЯ у пациентов с СС мужского пола, что совпадает с данными литературы о более высокой частоте встречаемости сосудистой деменции у мужчин (Sachdev et al., 1999). Эту находку можно объяснить и возможными половыми различиями объёма повреждённого белого вещества. В противоположность БоАл (чаще поражает женщин), у пациентов с СС патология белого вещества преобладает над изменениями серого вещества (Englund, 2002). Принимая во внимание данные литературы о большем объёме белого вещества у мужчин по сравнению с женщинами (Gur et al., 1999), можно предположить, что у мужчин с СС наблюдается более значительная степень поражения белого вещества мозга.
ВЯДБ и БЯМ – основные холинэргические ядра передне-базального мозга. Проекции ВЯДБ направляются главным образом в гиппокамп, а из БЯМ – в кору головного мозга. Метаболическая активность нейронов оказалась повышенной в ВЯДБ при СС. При этом удалось повторно показать возрастную активизацию нейронов ВЯДБ при БоАл (Ishunina and Swaab, 2003). Интересно, что при БоАл иммунореактивность АГ в ВЯДБ отрицательно коррелировала со стадией распространённости нейрофибриллярных клубков по Браак, что подтверждает предположение о компенсаторном характере активизации холинэргических нейронов на ранних этапах развития деменции (Swaab et al., 2002; Ishunina and Swaab, 2003; DeKosky et al., 2002). В соответствии с предыдущими результатами (Ishunina and Swaab, 2003) размеры АГ и перикарионов нейронов увеличивались при старении в ВЯДБ контрольных случаев. В связи с отсутствием значительных различий в интенсивности окраски АГ в БЯМ при СС, стоит отметить отсутствие соответствующих отличий и в активности холинацетилтрансферазы в ткани мозга пациентов с СС (White et al., 1977).
СОЯ человека на 90-95% состоит из вазопрессиновых нейронов и является основным источником вазопрессина плазмы, участвующего главным образом в регуляции реабсорбции воды, осмолярности плазмы и артериального давления (Swaab, 2003). Секреция ВП у пациентов с деменцией, включая БоАл, обычно не нарушена (Swaab, 2003; Swaab, 2004). Однако, сведения, касающиеся продукции ВП при СС, отсутствовали. В работе Srensen и соавт. (1983) у людей с деменцией обнаружено снижение уровня ВП в плазме и цереброспинальной жидкости. Однако, тип деменции в этом исследовании не уточнялся. Приведенные данные подтверждают снижение метаболической активности вазопрессиновых нейронов и уровня мРНК ВП у большинства пациентов с СС, описанное в настоящей работе. Нарушение синтеза ВП может быть связано с симптомом недержания мочи и понижением артериального давления на поздних стадиях развития СС. В данном исследовании относительный размер АГ в СОЯ больных с СС был меньше при наличии симптома недержании мочи. Более того, уровень мРНК вазопрессина был ниже при меньших значениях диастолического артериального давления. В связи с этим уместно обратить внимание на тот факт, что у исследованных больных с СС, у которых в прошлом наблюдалась гипертензия, артериальное давление снижалось на более поздних стадиях развития деменции в соответствии с литературными данными (Sachdev, 1999; Pohjasvaara et al., 1998).
Отсутствие различий в уровне экспрессии мРНК ВП во всей когорте случаев с СС можно объяснить гетерегонностью нейропатологических изменений при СС (Таблица 1). Например, у случая с СС # 4 в коре обнаружены только микроинфаркты при отсутствии подкорковых повреждений. Подобным образом преобладание «старых» корковых инфарктов может лежать в основе более высокой концентрации мРНК ВП у случая с СС # 9. По-видимому, “старые” корковые инфаркты либо оказывают незначительный эффект на экспрессию мРНК ВП, либо даже стимулируют мРНК ВП, тогда как “недавние” и подкорковые повреждения скорее приводят к значительному снижению синтеза ВП. Эти данные подтверждают мнение о том, что подкорковые сосудистые повреждения являются центральными в патогенезе СС и (Parnetti et al., 1990; Esiri et al., 1997). Активизация синтеза ВП у пациентов с СС может быть вызвана травматическим повреждением мозга у пациентов # 9 и # 5, а у случая # 5 – менингиомой в основании мозга (Yuan and Wade, 1991). Нельзя исключить и возможность влияния дополнительных факторов, влияющих на уровни мРНК в посмертном материале контрольных случаев (например, # 3, # 6 and # 9). Как правило, у контрольных случаев более длительный промежуток между моментом смерти и аутопсией мозга, чем у пациентов с СС (p = 0.023). Он отрицательно коррелирует с экспрессией мРНК ВП (r = -0.565; p = 0.089). Несмотря на это, в контрольной группе наблюдается более интенсивное мечение мРНК ВП, чем у пациентов с СС, что подтверждает идею о снижении продукции вазопрессина у большинства случаев с СС.
Удивительна тенденция к увеличению размеров перикарионов нейронов СОЯ, которая на первый взгляд противоречит уменьшению метаболизма ВП нейронов. Однако, при исследовании с помощью световой и флюоресцентной микроскопии в нейронах СОЯ пациентов с СС выявлены избыточные периферические отложения липофусцина, объясняющие увеличение размеров клеток и являющиеся признаком снижения функциональной активности ВП нейронов (Swaab, 2003; Swaab, 2004).