Содержание к диссертации
Введение
1 Введение 6
1.1 Актуальность темы исследования 6
1.2 Цель работы 7
1.3 Задачи исследования 7
1.4 Новизна полученных результатов 7
1.5 Методология и методы диссертационного исследования 8
1.6 Апробация результатов исследования 9
2 Обзор литературы 10
2.1 Общий план строения ядерной оболочки 10
2.2 Белки-ламины - основной компонент ламины 11
2.3 Строение молекул ламинов 12
2.4 Функции доменов ламинов 13
2.5 Фарнезилирование ламинов 15
2.6 Тонкое строение ламины 16
2.7 Поведение ламинов в митозе 19
2.8 Скорость обмена ламинов 20
2.9 Связь ламины и хроматина 21
2.10 Ламины и транскрипция 22
2.10.1 Влияние экспрессии ламинов на общий уровень транскрипции 23
2.10.2 Ламины как транскрипционные факторы 24
2.10.3 Транскрипция и положение внутри ядра 25
2.11 Ламины и репликация 28
2.11.1 Для запуска репликации необходимо образование ламины 29
2.11.2 Ламины как факторы репликации
2.12 Определение положения хроматина внутри ядра 31
2.13 Ламины и репарация 32
2.14 Ламины и апоптоз 32
2.15 Нарушения, вызванные патологическими изменениями в ламинах
2.15.1 Ламинопатии: один ген, широкий спектр заболеваний 33
2.15.2 Ламинопатии, связанные с нарушением механической прочности ядерной оболочки 34
2.15.3 Ламинопатии, связанные с токсичностью незрелых форм ламина
2.15.4 Патологии, связанные с ламином В 37
2.16 Связь ламинов с цитоскелетом 39
2.17 Заключение 41
3 Материалы и методы 43
3.1 Работа с эукариотическими клетками 43
3.1.1 Культивирование клеток 43
3.1.2 Трансфекция эукариотических клеток 43
3.1.3 Получение стабильных линий 44
3.1.4 Репликативное мечение, детекция репликативной метки 45
3.1.5 Синхронизация СНО 45
3.1.6 Получение ядерных почек 46
3.2 Работа с прокариотическими клетками 46
3.2.1 Получение компетентных клеток 46
3.2.2 Трансформация бактерий 47
3.2.3 Выделение ДНК из бактерий 47
3.2.4 Рестрикционный анализ плазмидной ДНК 47
3.3 Cветовая микроскопия: пробоподготовка, получение и анализ изображений 48
3.3.1 Прижизненные наблюдения 48
3.3.2 Высокопроизводительный микроскопический скрининг 49
3.3.3 Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) 50
3.3.4 Широкопольная флуоресцентная микроскопия 51
3.3.5 Деконволюция 51
3.3.6 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 51
3.3.7 Оптическая микроскопия с суперразрешением 52
3.4 Электронная микроскопия 53
3.4.1 Пробоподготовка для корреляционной световой и электронной микроскопии 53
3.4.2 Пробоподготовка для иммуноэлектронная микроскопия 53
3.4.3 Реакция серебряного усиления 54
3.4.4 Обезвоживание и заключение в эпон 54
3.4.5 Получение срезов, получение изображений 55
3.5 Белковый электрофорез методом Вестерн-блот гибридизации 55
3.5.1 Подготовка лизатов клеточной культуры для белкового электрофореза 55
3.5.2 Белковый электрофорез в денатурирующих условиях 56
3.5.3 Окрашивание полиакриламидных гелей 56
3.5.4 Влажный перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану 56
3.5.5 Окрашивание антителами и проявление 57
3.6 Использованные антитела 57
3.7 Приготовление использованных в работе растворов и смесей
3.7.1 Приготовление формальдегидного фиксатора 57
3.7.2 Приготовление среды для заключения препаратов 58
3.7.3 Приготовление PBS 58
3.7.4 Приготовление буфера Зеренсена 58
4 Результаты 59
4.1 Рост ядерной оболочки происходит равномерно на протяжении интерфазы 59
4.1.1 Статистический анализ роста ядерной оболочки методом высокопроизводительного микроскопического скрининга 59
4.1.2 Прижизненный анализ роста ядра в клеточном цикле 64
4.2 Микродоменная структура ламины сохраняется неизменной на протяжении интерфазы 66
4.2.1 Ламины А и В типов образуют независимые, тесно перекрывающиеся сети с микродоменной структурой 66
4.2.2 Микродомены ламинов образованы не одним уникальным типом ламинов, а комбинацией нескольких типов ламинов в разных соотношениях 68
4.2.3 Совокупный анализ неоднородности ламины не выявил изменений ее структуры в течение интерфазы 70
4.2.4 Степень полимеризации ламинов остается неизменной в течение интерфазы... 73
4.2.5 Характер распределения ламинов А и В1 в составе ядерной оболочки отличается. 74
4.3 Моделирование роста ламины на свободной ядерной оболочке в интерфазном
ядре 76
4.3.1 Образование ядерных почек не приводит к значительным нарушениям внутриклеточных процессов 76
4.3.2 Образование ядерных почек происходит не во всех клетках 77
4.3.3 В ядерные почки мигрирует хроматин 78
4.3.4 Динамика установления взаимодействие хроматина и ядерной оболочки в почках 79
4.3.5 Динамика образования ламины в ядерной почке 82
4.4 Скорость обмена ламинов на разных стадиях интерфазы 83
4.4.1 Разработка метода оценки скорости обмена ламинов 83
4.4.2 Скорость обмена ламина А выше, чем ламина В1 84
4.4.3 Изменение скорости обмена ламинов в зависимости от стадии интерфазы 85
4.5 Количество ламина В1 в растворимой фракции меняется в течение интерфазы.. 87
4.6 Ламина и репликация периферического гетерохроматина
4.6.1 Скорость обмена ламинов В1 в течение S фазы постоянна 90
4.6.2 Суммарный анализ плотности мечения ламины относительно репликативных фокусов 91
4.6.3 Анализ плотности мечения ламины напротив индивидуальных фокусов репликации 96
4.6.4 Репликация периферического ГХ не требует открепления отЯО 98
4.6.5 Обратимое перемещение HSR во время репликации происходит без открепления локуса от ядерной оболочки
5 Обсуждение результатов 102
6 Заключение 112
7 Выводы 115
8 Список сокращений 116
9 Список цитируемой литературы
- Методология и методы диссертационного исследования
- Ламины как транскрипционные факторы
- Репликативное мечение, детекция репликативной метки
- Ламины А и В типов образуют независимые, тесно перекрывающиеся сети с микродоменной структурой
Методология и методы диссертационного исследования
Впервые ламины были охарактеризованы при помощи биохимических методов, как главные структурные белки ядра в 1975 году (Aaronson and Blobel, 1975). Ламины характерны для всех многоклеточных животных, начиная от гидры и заканчивая человеком, но они не были обнаружены в одноклеточных организмах и растениях. На биохимическом уровне в дифференцированных клетках многоклеточных животных выделяют два типа ламинов: А и В, которые различаются по аминокислотной последовательности, характеру экспрессии, биохимическим свойствам и локализации в клетке во время митоза (Burke and Gerace, 1986; Nigg, 1989; Peter et al., 1989). Ламины А-типа обладают нейтральной изоэлектрической точкой и не связаны с мембранными везикулами во время митоза (так называемые "растворимые" ламины). Ламины В-типа характеризуются кислой изоэлектрической точкой, экспрессируются во всех клетках и входят в состав одного из типов мембранных везикул, на которые разбирается ядерная оболочка во время митоза (Gerace and Burke, 1988). Экспрессия ламинов в клетках зависит от стадии онтогенеза. Ламин В синтезируется во всех клетках в течение всего развития, экспрессия ламинов А-типа меняется по мере развития организма: ламин А/С отсутствует в стволовых, эмбриональных клетках, обнаруживается только в дифференцированных клетках (Prather et al., 1991; Rber et al., 1990). Т.к. экспрессия ламина А/С начинается после коммитирования клеток, возможно, она служит для ограничения пластичности клеток на последующих стадиях дифференцировки (Mounkes et al., 2003; Rober et al., 1989)
В интерфазе ламины выявляются в ядре в составе разных структур. Большая часть ламинов ассоциирована с ядерной мембраной и входит в состав ламины. Однако часть этих белков находится в нуклеоплазме во время интерфазы. Были описаны два различных способа локализации ламинов внутри ядра: в виде внутренних фокусов (Bridger et al., 1993; Goldman et al., 1992; Moir et al., 1994), которые содержали ламины либо А, либо В-типа, или ламины, распределенные диффузно внутри ядра (Hozk et al., 1995).
Традиционное деление ламинов на ламины А и В типов связано с их биохимическими свойствами и не отражает принцип их генетического кодирования. По современным данным ламины А и В типов являются группами белков со сходными свойствами. К ламинам В относят ламин В1, В2 и ВЗ. В1 и В2 ламины закодированы двумя различными генами: LMNB1 и LMNB2, соответственно. Ламин ВЗ (экспрессируется в мужских половых клетках) является продуктом альтернативного сплайсинга гена ламина В2. К ламинам А типа относят 2 мажорных белка (ламин А и С) и 2 минорных белка (ламин АА10 и С2). Все эти белки являются продуктами альтернативного сплайсинга гена LMNA.
Сравнительный анализ последовательности генов ламинов свидетельствует об их принадлежности к семейству промежуточных филаментов. Белки ламины являются высококонсевативным белками и имеют типичное для промежуточных филаментов строение (рис. 2): обладают трехчастной структурой, состоящей из центрального а-спирального палочковидного центрального домена, фланкированного коротким глобулярным N- концевым доменом - «головой» и длинным С-концевым «хвостом». Центральный домен сложен из четырёх субспиральных областей, содержащих в себе повторы из семи аминокислот и называющихся 1А, 1В, 2А и 2В. Эти отдельные спирали отделены друг от друга короткими линкерами -Ы,Ы2иЬ2из которых L12 является самым гибким. «Голова» ламина достаточно неструктурирована, хвостовой же домен содержит высококонсервативный иммуноглобулиноподобный мотив: домен, вовлеченный в белок-белковые взаимодействия и взаимодействия между белком и ДНК (Schirmer et al., 2001). В отличие от других типов промежуточных филаментов, ламины имеют последовательность ядерной локализации (NLS) между С-концевым участком центрального домена и иммуноглобулиноподобным участком (Fuchs and Weber, 1994; McKeon et al, 1986).
Центральный альфа-спиральный палочковидный домен играет важнейшую роль в процессе полимеризации. Подобно белкам цитоплазматических промежуточных филаментов, ламины способны к полимеризации, однако механизмы полимеризации цитоплазматических и ядерных промежуточных филаментов различаются. В результате взаимодействия coiled-coil доменов ламины А и В типов формируют гомодимеры с параллельным расположением цепей, (Aebi et al., 1986; Hennekes and Nigg, 1994) Димеры ламинов взаимодействуют по принципу «голова к хвосту», что приводит к формированию тетрамерного протофиламента. Взаимодействие четырёх протофиламентов ведёт к образованию 10 нм фибрилл. (Stuurman et al, 1998). При in vitro сборке ламинов беспозвоночных животных на этой стадии процесс объединения протофиламентов завершается. При сборке же ламинов позвоночных животных происходит продолжение этого процесса - образование сложных высокоупорядоченных паракристаллических структур (Shimi et al., 2010). Таким образом, формирование промежуточных филаментов в ядре отличается от формирования цитоплазматических промежуточных филаментов.
Если за полимеризацию ламинов отвечает центральный палочковидный домен, то С-концевой домен обеспечивает специфические функции ламинов. Ламин А и все ламины В-типа содержат С-концевую СААХ-последовательность, где С - цистеин, А -алифатическая аминокислота, Х-любая аминокислота (чаще всего представленная метионином). По этим аминокислотам происходит ряд посттрансляционных модификаций, которые в том числе регулируют встраивание ламинов в ядерную оболочку. Модификация СААХ-бокса представляет собой высокоупорядоченный процесс, протекающий в несколько стадий, включающих фарнезилирование цистеина, удаление ААХ-остатка и карбоксиметилирование терминального цистеина (рис. 3) (Dechat et al., 2010). Дальнейшие стадии созревания различаются у разных типов ламинов, что обеспечивает их специфические свойства. Зрелый ламин А образуется в результате удаления 15 аминокислот с С-конца, из-за чего он теряет фарнезильную группу, тогда как у ламина В она сохраняется. Ламин С отличается от ламина А не имеет СААХ-последовательности, и таким образом не может быть фарнезилирован.
Ламины как транскрипционные факторы
Для проведения прижизненных наблюдений за динамикой роста ядерной оболочки в клеточном цикле и скорости обмена молекул были получены клеточные линии СПЭВ со стабильной экспрессией ламина A-GFP и ламина B1-GFP по стандартной методике с небольшими измениями (Green and Sambrook, 2012). Для этого клетки трансфецировали плазмидой, несущей соответствующий ген ламина и ген устойчивости к антибиотику (плазмиды любезно предоставлены Курчатовой С.Ю.). Через 2 дня после трансфекции для селекции трансфецированных клеток в среду культивирования добавляли антибиотик G418 (Invitrogen) в концентрации 800 мкг/мл, для поддержания экспрессии ламина A-GFP либо ламина В1-GFP клетки культивировали при 200 мкг/мл G418.
Для достижения одинакового уровня экспрессии клетки субклонировали. Для этого клетки рассаживали в 96-ячеечную плату по одной клетке методом лимитирующих разведений и отбирали для дальнейшей работы клоны с гомогенным невысоким уровнем экспрессии ламина.
Аналогичным способом для одновременного отслеживания морфологии ламины и положения и состояния HSR-локуса на основании линии СНОАОЗ была получена линия с экспрессией ламина Bl-mRFP. Плазмида с геном ламина Bl-mRFP и геном устойчивости к антибиотику G418 была любезно предоставлена Курчатовой СЮ. Для селекции использовали G418 в концентрации 800 мкг/мл, для поддержания экспрессии 200 мкг/мл.
Для отслеживания динамики ламины относительно реплицирующегося хроматина была получена клеточная линия НТ1080, стабильно экспрессирующая PCNA-mRFP и LaminBl-GFP. Плазмида, кодирующая LaminBl-GFP, была предоставлена Я. Элленбергом (J. Ellenberg) (Daigle et al., 2001). Плазмида, кодирующая PCNA-mRFP и гены устойчивости к эукариотическим антибиотикам (зеоцин), была получена на основе плазмиды, предоставленной М. Кардосо (М. Cardoso) (Leonhardt et al., 2000). Последовательность mRFP была получена при помощи ПЦР плазмиды, предоставленной М. Кардосо, с использованием праймеров cgatggatccatggcttcgtggggttccccgaaga (прямой) и aaagagctcttaggcgccggtggagtg (обратный). Последовательность PCNA была вырезана по сайтам Sbfl и Xbal и амплифицирована с использованием вектора pALA (Евроген). Полученные фрагменты mRFP и PCNA были лигированы в плазмиду pcDNA4/TO (Invitrogen) по сайтам BamHI и Xbal. Стабильная экспрессия PCNA-mRFP и LaminBl-GFP достигалась последовательно: сначала была получена культура клеток НТ1080, стабильно экспрессирующая PCNA-mRFP; на основе этой линии получали культуру клеток со стабильной экспрессией LaminBl-GFP. В качестве селективного антибиотика для PCNA-mRFP использовали зеоцин (Sigma) (20 мкг/мл для селекции и 5 мкг/мл в качестве поддерживающей концентрации). Для селекции клеток, положительных по LaminBl 45 GFP использовали антибиотик G418 в концентрации 800 мкг/мл, для поддержания экспрессии ламина B1-GFP клетки культивировали при 200 мкг/мл G418. Так же как и для линий СПЭВ со стабильной экспрессией ламина B1-GFP и ламина A-GFP, гомогенности уровня экспрессии добивались методом субклонирования.
Репликативное мечение осуществляли при помощи аналога тимидина EdU (5-ethynyl-2 -deoxyuridine, Invitrogen), который встраивается в ДНК во время активного ДНК-синтеза. В культуральную среду клеткам на короткое время (обычно 10 мин для пульсового мечения, если не указано иное) добавляли EdU в конечной концентрации 10 мкМ, после чего клетки подвергали процедурам в соответствии с нуждами эксперимента.
Детекцию репликативной метки осуществляли по стандартному протоколу производителя (Invitrogen) после стадии фиксации и блокирования неспецифического связывания антител. Детекция метки основана на клик-реакции, где взаимодействие между алкин-содержащим EdU и азид-содержащим флуорохромом катализируется при помощи меди Cu(I) и приводит к образованию прочной связи между ДНК и флуорохромом посредством триазольного гетероцикла. Этот метод не требует денатурации ДНК для обеспечения доступа флуорохрома к реакционной группе EdU, что позволяет сохранить нативную структуру хроматина.
Клик реакцию проводили в течение 30 мин во влажной камере, специфических отмывок после клик-реакции не проводили.
Для синхронизации клетки СНО культивировали в течение 66 ч в стандартных условиях в среде без добавления сыворотки. Клетки в отсутствие сыворотки выходили из цикла, переходили в Go. После этого клетки переводили в полную питательную среду, с 10% сыворотки, культивировали в течение 4 ч, в результате чего клетки переходили из Go в Gi фазу. После этого клетки инкубировали с 1,5 мМ гидроксимочевины в течение 14 ч. Присутствие гидроксимочевины приводило к накоплению клеток на границе Gi/S. Начиная с этого момента клетки считали синхронными. Для стимулирования хода клеток по циклу гидроксимочевину трижды отмывали большим количеством (5-7 мл) раствора Хэнкса (37С), клетки помещали в полную питательную среду. Клетки собирали в трех фазах: Gl, S и G2, G1 - непосредственно после отмывки гидроксимочевины, S - через 4 часа, G2 - через 8 часов. Для проверки эффективности синхронизации клеткам, выращенным на покровных стеклах, в том же эксперименте в каждой из фаз давали репликативную метку, после чего клетки фиксировали 3,7% раствором формальдегида на PBS в течение 10 мин, трижды отмывали PBS, 30 мин инкубировали в 1% растворе BSA на PBS с добавлением 0,1% Тритон Х-100 и детектировали репликативную метку. Препараты заключали в среду Mowiol 4-88 с 0,3 мкг/мл DAPI. На каждом препарате подсчитывали репликативный и митотический индекс.
Для стимулирования образования ядерных почек клетки культуры СПЭВ, выращенные на покровных стеклах толщиной 0,17 мм, подвергали гипотонии в течение 1 часа: инкубировали в 15% растворе Хэнкса на деионизованной воде. После этого клетки переводили в изотонические условия, снова помещая их в полную питательную среду. Все манипуляции проводили с использованием предварительно подогретых до 37С растворов.
Для получения компетентных клеток использовались бактерии Е. coli штамма XL-1. Клетки хранились при температуре -70С и высевались на чашки Петри с агаром на основе среды LB (10 г/л триптон (Helicon), 5 г/л дрожжевого экстракта (Helicon), 5 г/л хлорида натрия (Helicon), 15 г/л агара, 10 мкг/мл тетрациклин (Sigma). После инкубации в течение 16 часов при 37С индивидуальные колонии помещали в 5 мл среды на 16 часов при 37С при постоянном перемешивании (200 об./мин). Через 16 часов клеточную суспензию разбавляли средой LB в 100 раз. Бактериальную суспензию инкубировали при 37С при постоянном перемешивании (200 об./мин) до тех пор, пока ее оптическая плотность не достигала 0,6 оптических единиц при длине волны 600 нм. Далее все процедуры проводили на льду. Все растворы предварительно охлаждали до 4С. Клеточную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 830 g при 4С (ELMI). Супернатант удаляли; клетки ресуспендировали в 100 мМ растворе хлорида кальция (из расчета 100мл раствора на 5 мл ночной культуры) и оставляли на 30 минут. Процедуру центрифугирования повторяли, осадок ресуспендировали в растворе хлорида кальция (100 мМ) с добавлением 10% глицерина (Sigma) (10 мл смеси на 5 мл ночной культуры). Клетки быстро замораживали в азоте и хранили при - 70С.
Для получения плазмидной ДНК в препаративных количествах для последующей трансфекции клеточных линий производили трансформацию компетентных бактериальных клеток. Все процедуры проводились на льду. Компетентные клетки, подготовленные, как описано выше, размораживали на льду. Смесь компетентных клеток (100 мкл) и плазмидной ДНК 300 нг выдерживали при 4С в течение 30 мин. Клетки подвергали краткосрочному тепловому воздействию (42С 90 сек), после чего 2 мин охлаждали во льду. После этого бактериальные клетки инкубировали при 37С в течение часа в 1 мл среды LB при постоянном перемешивании (200 об./мин). Через час полученную клеточную суспензию центрифугировали 5 мин при 329,7g (MiniSpin, Eppendorf). Осадок ресуспендировали в небольшом количестве LB и рассаживали на чашки Петри с агаром с соответствующим антибиотиком (канамицин 30-50 мкг/мл либо ампицилин 35-50 мкг/мл) и инкубировали при 37С 16 часов. После этого индивидуальные колонии выращивали в 5 мл среды LB с 50 мкг/мл соответствующего антибиотика в течение 16 часов при 37С при постоянном перемешивании (200 об./мин).
Репликативное мечение, детекция репликативной метки
По результатам описанных выше экспериментов мы предположили, что способность ламина В1 встраиваться в ламину зависит от состояния периферического гетерохроматина. Известно, что ламина-ассоциированные домены хроматина устанавливают контакты с ядерной оболочкой в ранней Gl-фазе, и после timing decision point (Gilbert et al., 2010) глобальная реорганизация хроматина в пространстве ядра, по-видимому, не происходит. Исходя из этого, можно предположить, что хроматин, мигрировавший в ядерную почку, не способен образовывать контакты с ядерной оболочкой. Если способность ламина В1 встраиваться в ламину зависит от наличия контактов с хроматином, то это, с одной стороны, объясняет отсутствие ламина Вів ядерной оболочке почки, и с другой стороны, может влиять на скорость обмена ламинов в зависимости от репликативного статуса периферического хроматина. Ламин А при этом показал способность встраиваться ядерную оболочку почки без участия ламина В1 и хроматина, что, позволяет предположить отсутствие зависимости скорости обмена ламина А от стадии клеточного цикла.
Для того, чтобы проверить справедливость этой гипотезы, мы провели анализ скорости обмена ламина А и В1 в реплицирующихся и нереплицирующихся клетках. Подвижность ламинов измеряли по скорости восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). В этих экспериментах мы использовали клетки культуры СПЭВ со стабильной экспрессией ламина В1-GFP либо ламина A-GFP. Для того, чтобы отличить клетки в S фазе от нереплицирующих клеток, клеткам с начале эксперимента давали репликативную метку в течение 10 мин, после измерения скорости восстановления флуоресценции клетки фиксировали и проявляли репликативную метку. В каждой исследованной клетке определяли стадию S-фазы по характеру распределения репликативной метки в ядре. К сожалению, в описанной системе невозможно дискриминировать клетки в G1- и в 02-фазе.
В наших экспериментах было показано, что ламин В1 в S фазе демонстрирует более высокую скорость восстановления, по сравнению с нереплицирующимися клетками: скорость обмена ламинов В1 вне S фазы (п = 5) за 1 час составила 5.8% +/- 1.7%, тогда как в S фазе (п = 16) скорость обмена составила 10.1% +/-1.9% за час (р 0.01) (рис. 29).
Аналогичные измерения скорости обмена ламина А показали, что скорость восстановления флуоресценции не меняется в ходе клеточного цикла: скорость обмена ламина А составила 15.2% +/- 3.1% (п=9) за 1 час в нереплицирующих клетках, и 14.8% +/- 1.5% (п=21) в S фазе.
Для того, чтобы поверить универсальность наблюдаемого явления, скорость обмена ламина Вів зависимости от стадии клеточного цикла была исследования на клетках культуры НТ1080, стабильно экспрессирующих PCNA-mRFP и ламин B1-GFP. В этом случае мы определяли стадию интерфазы клетки по распредению PCNA в ядре. В отличие от клеток культуры СПЭВ, имеющих эпителиальное происхождение, клетки НТ1080 - фибробласты, склонные к активной миграции, что препятствует эффективному длительному наблюдению: из-за подвижности как целой клетки, так и ядра внутри нее, в данные вносится систематическая ошибка. Несмотря на описанные ограничения, в результате исследования 45 клеток мы обнаружили, что клетки в S фазе также демонстрируют более высокую скорость обмена ламина В1 3.7% +/- 0.8% за 1 час (п=26) по сравнению с клетками вне S фазы 1.4% +/- 0.4% (п=19).
Анализ скорости восстановления флуоресценции ламина А и В1 в клетках культуры СПЭВ в разные стадии клеточного цикла, (а) - скорость обмена ламина А в реплицирующих (синяя линия) и нереплицирующих (черная линия) клетках, (б) - скорость обмена ламина В1 в реплицирующих (красная линия) и нереплицирующих (черная линия) клетках.
Таким образом, наша гипотеза о разных механизмах регуляции встраивания ламинов А и В1 подтверждается. Действительно, способность ламина В1 встраиваться в ядерную оболочку зависит от наличия ламина-ассоциированных доменов хроматина (LADs), которые образуют контакты с ядерной оболочкой. Ламин А не зависит от хроматиновых контактов, поэтому сохраняет неизменную скорость обмена на протяжении всей интерфазы.
Проведенные эксперименты позволяют сделать вывод о зависимости встраивания ламина В1 в ядерную оболочку от синтеза хроматина. Возникает вопрос, каков механизм регуляции встраивания ламина В1 в состав ламины. Необходимо учитывать, что обмен ламина В1 происходит и вне S фазы. Мы предположили, что две наиболее вероятные возможности такой регуляции осуществляются на уровне экспрессии генов ламина В1, либо на уровне посттрансляционных модификаций белков. Для исследования вопроса о количестве синтезированных ламинов В1 в определенной стадии клеточного цикла мы проанализировали количество синтезированного белка методом Вестерн-блот. Для этого мы раздельно анализировали ламин В1 в полимеризованной форме в составе ламины и в растворимой фракции в разные стадии клеточного цикла. Для этой цели клетки СНО синхронизировали и собирали фракцию Gl, S и G2 клеток. Для того, чтобы различить ламин В1 в полимеризованной и неполимеризованной форме, клетки пермеабилизовали для экстракции растворимых белков, центрифугировали и параллельно анализировали осадочную и растворимую фракции. Для нормализации сигналов на количество нанесенного белка использовали белок GAPDH.
Результаты синхронизации клеток СНО представлены на рисунке 30. Из представленного графика можно заключить, что синхронизация прошла, в ходе эксперимента происходит смена фаз клеточного цикла: до отмывки гидроксимочевины мы не наблюдаем лишь клетки без репликативной метки и небольшой процент клеток в ранней S-фазе. Через 4 ч после отмывки гидроксимочевины появляются клетки в средней S-фазе (16%), увеличивается доля клеток в ранней S-фазе (31%). Через 8 ч после отмывки гидроксимочевины доля клеток в ранней и средней S-фазе снижается (до 10% и 9%, соответственно), появляется значительное количество клеток в поздней S-фазе. Также, только в этой пробе обнаружено небольшое количество митозов (2%). Таким образом, измеряя содержание ламинов в растворимой фракции в трех полученных пробах, мы можем судить о преимущественном вкладе клеток в известной стадии клеточного цикла.
На рисунке 31 представлены результаты анализа содержания ламина А и В1 в растворимой фракции в трех точках синхронизации, соответствующим преобладанию клеток в Gl, S и G2 фазах клеточного цикла. Для ламинов А и В типов удалось обнаружить как общие закономерности поведения, так и некоторые различия. Для ламинов обоего типа характерно накопление в G2 фазе в растворимой фракции. Увеличение концентрации растворимого ламина А и В1 может объясняться двумя причинами: во-первых, это может быть связано с незначительным присутствием митотических клеток (2%). Известно, что в митозе происходит деполимеризация ядерной оболочки, что приводит к переходу ламинов в растворимую фракцию клетки. Однако, нельзя исключить вклада G2 фазы в накопление ламинов. Так как мы показали связь между встраиванием ламина В1 в состав ядерной оболочки и репликацией хроматина, накопление, по крайней мере, ламина В1 в G2 фазе может быть отчасти обусловлено невозможностью его встраивания. В таком случае, регуляция встраивания ламина В1 происходит не на уровне синтеза (и, соответственно, количества присутствующего в клетке невстроившегося белка), а за счет других мезанизмов.
Это предположение подтверждает наблюдение за количеством ламинов в растворимой фракции в G1 и S фазах. Если ламин В1 присутствует в G1 и S фазах в незначительном количестве, то ламин А на этих стадиях вовсе не удалось обнаружить. Вероятно, наблюдаемая разница связана с разной динамикой обмена ламинов в составе ламины. Ламин А обменивается быстрее, чем ламин В1, что приводит к его быстрой утилизации. Однако, в любом случае, наличие ламина Вів растворимой фракции в G1 и S фазах подтверждает наше предположение о регуляции встраивания ламинов не на уровне синтеза белка.
Таким образом, было показано, что наличие растворимого ламина В1 не является достаточным условием для его встраивания в ядерную оболочку. По-видимому, для роста сети ламина В1 необходимы дополнительные условия,что приводит к его накоплению в растворимом состоянии. Для ламина А подобного накопления в растворимой фракции обнаружить не удалось, по-видимому, в связи с его свободной и более быстрой интеграцией в состав ламиновой сети.
Ламины А и В типов образуют независимые, тесно перекрывающиеся сети с микродоменной структурой
Ламина, являясь сложно устроенной, многокомпонентной структурой, выполняет разнообразные функции: во-первых, защитную функцию, особенно востребованную у клеток с большим геномом, и во-вторых, регуляторную функцию, проявляющуюся при дифференцировке клеток. Механизмы, позволяющие ламине сочетать механическую прочность и активное участие в регуляции геномной активности до сих пор были не выяснены. Помимо регуляции активности генов и обеспечении защиты хроматина ламина удваивает свою площадь в ходе интерфазы для поддержания постоянства размеров ядра в ряду клеточных поколений.
В настоящей работе была впервые изучен механизм роста ламины в интерфазе. Было выяснено, что рост ламины происходит непрерывно на протяжении всей интерфазы. В процессе роста ламины ее основные структурные компоненты - сети ламинов А и В типов - не претерпевают значительных изменений строения и степени полимеризации. Таким образом, несмотря на разнообразие выполняемых функций в клеточном цикле, микроархитектура ламины поддерживается неизменной.
Тщательное изучение структуры ламиновых сетей методами микроскопии с суперразрешением и иммуноэлектронной микроскопии показало, что микродомены образованы не одним уникальным типом ламинов, а комбинацией нескольких типов ламинов в разных соотношениях. Таким образом традиционное представление о микродоменной структуре ламиновых сетей, наблюдаемой во флуоресцентный микроскоп, требует аккуратной интерпретации с учетом ограничений метода. Представление о ламине как о комбинации ламинов разного типа с различной локальной концентрацией позволяет предположить возможность локальных изменений ее характеристик (степени полимеризации, пластичности, плотности) без утери базовых свойств ламины как целого.
Отдельное исследование структуры ламины в контексте удвоения прикрепленного к ней периферического гетерохроматина показало, что функционирование репликативных комплексов не требует ни открепления хроматиновых доменов от ядерной оболочки, ни локальной деполимеризации ламины в непосредственной близости от фокуса репликации. При этом в модельной системе перемещение прикрепленного к ядерной оболочке локуса к центру сопровождается значительным изменением конфигурации ламины, что свидетельствует о ее высокой пластичности. Эти данные демонстрируют новые особенности функционирования ламины, противоречащие традиционному представлению о ламине как о чрезвычайно стабильной, жесткой структуре. Прочная связь ламины и хроматина сочетается со способностью быстро образовывать и нарушать контакты между хроматином и ядерной оболочкой, а также не препятствует быстрым обменным процессам и перестройкам ламины, необходимым для обеспечения пластичности.
В ходе моделирования роста ламины на свободной ядерной оболочке и измерения скорости обмена ламинов А и В типов было выяснено, что встраивание ламина В1 регулируется наличием контактов специфической фракции хроматина с ядерной оболочкой и происходит преимущественно в S-фазе, тогда как ламин А встраивается в ядерную оболочку независимо от хроматина. По-видимому, встраивание ламина В1 «лицензируется» только после образования ламина-ассоциированных доменов, способных к контактц с ламиной. В таком случае не только ламина как эпигенетический фактор регулирует поведение хроматина, но и хроматин напрямую влияет на строение ламины. Сложный механизм регуляции встраивания ламина Вів ламину подтверждается не только его активным обменом в S-фазе, но и накоплением ламина В1 в растворимой фракции клетки.
Таким образом, по результатам проделанной работы был предложен механизм роста ламины в интерфазе, где ламин В и хроматин находятся в тесной взаимосвязи, тогда как поведение ламина А не столь жестко связано с функционированием хроматина. Полученные данные интересны с эволюционной точки зрения: для ламина В1, в первую очередь обеспечивающего механическую прочность ядра, эволюционно более древнего, логично ожидать тесную связь с хроматином, тогда как ламин А, появляющийся и в филогенезе и в онтогенезе позже, с усложнением генома, действительно должен демонстрировать большую независимость от хроматина для выполнения регуляторных функций, что мы и показали в нашей работе.
Полученные результаты позволяют предположить дальнейшие перспективы разработки данной тематики. Выявленная микродоменная архитектура ламины и различные механизмы роста микродоменов в клеточном цикле заставляют обратить более пристальное внимание на их структуру. Доступные на данный момент технологии не позволяют обеспечить необходимого разрешения, что требует разработки новых подходов для перехода на нанометровый уровень. Для применения этой методики необходимо разработать методы прямого мечения интересующих белков устойчивыми флуорохромами. Одним из возможным подходов может служить применение экспрессируемых в исследуемых клетках наноантител. Данный способ мечения может обеспечить прижизненное наблюдение за структурой ламинов с применением современных методов локализационной световой микроскопии с точностью локализации до 3-4 нм.
Разработка новых методов мечения и адаптация существующих технологий локализационной микроскопии для изучения структуры ламины позволит прогнозировать поведение клеточной оболочки в различных функциональных состояниях клетки. В частности, изучение ламины может предоставить информацию о способах глобального переключения активности генов. Таким образом, поиск способов направленного воздействия на ламину раскроет новые возможности для разработки терапевтических подходов в лечении ламинопатий, в противоопухолевой терапии и репрограммировании клеток.