Введение к работе
Актуальность темы. В вивариях медицинских и научно-исследова-едьских институтов, а также в специализированных питомниках со-ержигся огромное разнообразие лабораторных мкшей. Многие из них уієгот наследственную предрасположенность к различным заболеваниям, сть линии с хромосомными нарушениями. На этих животных изучак>т элеэни человека и способы их лечения. Однако' жизнеспособность ли-ейных мышей обычно снижена. Кроме того, всегда существует опас-эсть потери ценных признаков в результате неконтролируемых скре-иааний, мутаций, генетического дрейфа или случайных инфекций. Потому разведение, а тем более постоянное поддержание генетического тандарта линий, представляет собой экономически и технически спакую задачу. В связи с этим существующая система поддержания лабо-аторных мышей должна быть дополнена системой низкотемпературных анкоз, где эмбрионы могут сохраняться в глубокозамороженном виде
течение нескольких лет (Whittingham, 1974; Veprintsev, Rott, 979,* Рогт, Вепринцев, 1981).
ГГзвестные в настоящее время способы криоконсервации эмбрионов азработаны на основе чисто эмпирического подбора криопротекторов
их концентраций в среде, скоростей замораживания и оттаивания. В зучекных случаях для каждой конкретно взятой линии или даже стани развития выявлены оптимальные условия и режимы криоконсервации Whittingham, 1979,1981; Mazur, 19S4; Белоус и др., 1986), В то же рекя создание крнобанкоз предполагает тиражирование универсальных
достаточно простых способов криоконсервации, применимых к различим объектам. Эмбрионы мышей являются наиболее удобно:! моделью для зучения механизмов криоповреждений и разработки на их основе опти-альных для создания крнобанка способов криоконсервации.
Криобанки расширят возможности питомников в деле создания обшир-ых коллекций генетически чистых линий лабораторных животных, обес-ечат высокую однородность эмбриологического материала для проведе-ия современных работ по биохимии, биологии развития, генной и кле-очной инженерии, упростят задачу транспортировки животных на отда-енны-з расстояния, что несомненно окажет положительное влияние на ешение проблем, принципиально важных для медицины, сельского хо-яяства а фундаментальной науки.
Цель настоящего исследования: подобрать для генетически раэлича-дихся линий лабораторных мышей оптимальные условия проведения всех тапов криоконсервации, выявить наличке или отсутствие меялинейных азличий в чувствительности эмбрионов к действию повреждающих фак-оров в процесса замораживания-оттаивания и определить возможность
использования єдиного для всех линий способа криоконсервации.
Работа выполнена в соответствии с плановой тематикой Института биологической физики АН СССР "Длительное сохранение генетической информации. Физико-химические основы замораживания клеточных систем". '':.
Задачи исследованияг <
-
Для различных ланий лабораторных мышей подобрать условия проведения гормональной суперовуляции, обеспечивающие получение максимального количества жизнеспособных эмбрионов.
-
Определить! оптимальные условия и режимы замораживания-оттаива-
ния для эмбрионов различных стадий доимплантационного развития
-
Провести трансплантацию криоконсервированных эмбрионов и подобрать оптимальное сочетание пар "донор-реципиент",
-
Провести количественный анализ возможных повреждения и гибели эмбрионов на всех этапах криоконсервации.
Научная новизна. Обоснована возможность использования модифицированной среды Виттена с органическим буфером Hepes на всех этг пах криоконсервации эмбрионов лабораторных мышей, включая их заме раживание. Подобраны оптимальные условия проведения замораживания -оттаивания и выявлены различия в эффективности криозащиты и токсическом действии трех протекторов - ДИСО, глицерина и этиленгли-коля. Показано,, что существующие между инбредными линиями генетик ческие различия не влияют на выживаемость эмбрионов после криокон сервации. Все морфо-функцнональные повреждения, вызванные замораживанием-оттаиванием, проявляются в доимплантационном периоде. Обнаружено, что.остановка развития происходит в результате нарушениі регуляции делений дробления и ранних морфогенетических процессов. Посла криоконсервации поздних морул, и бластоцист повреждаются пре-. имущественно клетки трофобласта, ответственные за имплантацию в , матку. Постимплантационное развитие проходит без отклонений от нормы. Мыши, восстановленные из криоконсервированных эмбрионов,не обраруживают фенотипических отклонений в трех поколениях. Установлено, что при синхронизации и строго определенном сочетании пар . "донор-реципиент" эффективность трансплантации криоконсервированных эмбрионов повышается.
Практическое значение. Подобран универсальный способ криоконсервации для эмбрионов разных линий и стадий доимпалнтационного развития мышей и дана рекомендации по его использованию при созда-; вин ,генетического криобанка.
Полученные результаты могут найти применение в экспериментальной эмбриологии при решении вопросов поддержания и разведения ге-
етически чистых линий мышей, при использовании криокрнсервирован-ых эмбрионов для тестирования биологически активных препаратов, ри изучении процессов регуляции в раннем эмбриогенезе, в опытах о генной и клеточной инженерии.
Апробация работы. Материалы диссертадии доложены на П Всесоюзен конференции "Механизмы криоповреждениЯ и криозащиты биологи-еских объектов" (Харьков, 1984), П Всесоюзном совещании по куль-ивированию клеток животных и человека (Пущино, 19 35), Рабочих со-еианиях по криоконсервации генетических ресурсов (Пукино, 1986, 988), Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы стандартизации абораторных живогньгх для медико-биологнческих исследований" (Мос-ва, 1987) , международной конференции "Достижения и перспективы азвития криобиологии и криомедицины (Харьков, 1988), Международом совещании "Создание генетических коллекций лабораторных живот-их" (Пущино, 1989).-
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных абот в виде статей и тезисов докладов.
Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена на 127 границах машинописного текста и состоит из введения, обзора лите-зтуры, описания методов исследования, экспериментальной части, 5суждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована 15 рисун-ами, содержит 19 таблиц. Список цитируемой литературы включает 35 отечественных и зарубежных названий.