Содержание к диссертации
Введение
2. Введение
2.1. Актуальность темы исследования 5
2.2. Степень разработанности темы 6
2.3. Цель и задачи работы 7
2.4. Научная новизна работы 7
2.5. Апробация результатов 8
3. Обзор литературы 9
3.1. Клеточный каннибализм (КК) 9
3.1.1. Отличия клеточного каннибализма от фагоцитоза 10
3.2. Энтоз 13
3.2.1. Механизм внедрения клетки в клетку при энтозе 13
3.2.2. Судьба внедрившейся клетки 22
3.3. Эмпериполез 23
3.3.1. Механизм внедрения клетки в клетку при эмпериполезе 29
3.4. Биологическая роль клеточного каннибализма 32
4. Материалы и методы 34
4.1. Материалы 34
4.1.1. Оборудование 34
4.1.2. Расходные материалы 34
4.1.3. Биологический материал 35
4.1.4. Реагенты 35
4.2. Методы исследования 37
4.2.1. Культивирование клеток 37
4.2.2. Морфологический анализ клеток 37
4.2.3. Химические воздействия на клетки
4.2.3.1. Постановка эксперимента с цитохалазином В, нарушающим организацию актиновых филаментов 38
4.2.3.2. Постановка эксперимента с нокодазолом, вызывающим деполимеризацию микротрубочек 38
4.2.3.3. Постановка эксперимента с брефелдином А, нарушающим организацию аппарата Гольджи 38
4.2.4. Прижизненные наблюдения за клетками з
4.2.5. Мечение клеток бромдезоксиуридином 40
4.2.6. Окрашивание фиксированных клеток 4.2.6.1. Цитохимическое окрашивание 40
4.2.6.2. Иммуноцитохимическое окрашивание 4.2.7. Совместное культивирование клеток разных линий 41
4.2.8. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) 42
4.2.9. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) 4.2.10. Корреляционная микроскопия 43
4.2.11. Обработка и анализ результатов 44
5. Результаты 45
5.1. Картины “клетка-в-клетке” в исследуемых культурах 45
5.2. Доказательство локализации внедрившейся клетки внутри энтозной клетки 47
5.3. Частота встречаемости картин “клетка-в-клетке” при длительном культивировании в исследуемых культурах 48
5.4. Процесс внедрения одной клетки внутрь другой 50
5.5. Стадии энтоза в структурах “клетка-в-клетке” 5.5.1. Форма и размер внутренней клетки 52
5.5.2. Наличие пространства между плазматической мембраной внутренней клетки и мембраной энтозной вакуоли 53
5.5.3. Состояние ядра и цитоплазмы внутренней клетки 5.6. Межклеточное взаимодействие 54
5.7. Актиновый цитоскелет клеток и его участие в процессе энтоза 56
5.8. Система микротрубочек и её вклад в процесс энтоза 65
5.9. Центросома 69
5.10. Мембранные органеллы клеток 71
5.10.1. Аппарат Гольджи 71
5.10.2. Кислый везикулярный компартмент 72
5.10.3. Аутофагосомы 73
5.10.4. Митохондрии 5.11. Роль аппарата Гольджи при энтозе 77
5.12. Влияние ДМСО на морфологию клеток, а также на уровень митозов, апоптозов и энтозов в культуре клеток А431 82
5.13. Судьба внедрившейся клетки при энтозе 84
5.14. Цитохром с 86
5.15. Каспаза-3 87
5.16. Активные формы кислорода 88
5.17. Выявление гетеротипического энтоза при совместном культивировании разных клеточных линий 5.17.1. Влияние бромдезоксиуридина на клетки 90
5.17.2. Оценка пролиферативного пула при продолжительном мечении клеток бромдезоксиуридином 91
5.17.3. Совместное культивирование меченой и немеченой популяций клеток линии А431 92
5.17.4. Совместное культивирование клеток линий НаСаТ и А431 95
5.17.5. Совместное культивирование клеток линий НаСаТ HMCF7 102
5.17.6. Совместное культивирование опухолевых клеток линий MCF7 и А431 108
5.18. Доказательство локализации внедрившейся клетки внутри энтозной клетки при гетеротипическом энтозе 116
5.19. Исследование способа деградации внедрившейся клетки при гетеротипическом энтозе 118
6. Обсуждение результатов 121
7. Заключение 138
8. Выводы 143
9. Список сокращений 144
10. Список литературы
- Цель и задачи работы
- Механизм внедрения клетки в клетку при эмпериполезе
- Постановка эксперимента с нокодазолом, вызывающим деполимеризацию микротрубочек
- Частота встречаемости картин “клетка-в-клетке” при длительном культивировании в исследуемых культурах
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Программированная гибель клеток (ПКГ) -неотъемлемая часть жизни многоклеточных организмов. В 2009 г. в список разновидностей ПКГ был впервые включён энтоз - вариант клеточного каннибализма (КК), при котором клетка внедряется внутрь другой клетки и там погибает. До сих пор процессы, лежащие в его основе, детально не изучены. Имеющиеся данные получены, как правило, на опухолевых клетках, переведённых в суспензионное состояние. Существуют различные мнения о роли КК. Он может способствовать увеличению плоидности клеток и выживанию клеток злокачественной опухоли при неблагоприятных условиях среды. КК также позволяет опухолевым клеткам уходить от иммунного ответа организма. Всё это способствует росту и малигнизации опухоли. В связи с последним предполагается, что энтоз можно использовать для диагностики опухолевой прогрессии. Таким образом, исследование энтоза - это перспективное направление фундаментальной и прикладной биологии. В первом случае изучение данного типа КК позволит получить более полную и глубокую информацию о процессах, осуществляющих этот вариант ПКГ, что расширит представление о путях клеточной смерти. С точки зрения прикладной науки выявление процессов, включённых в реализацию энтоза, предоставит возможность управлять этим явлением, что может быть использовано для терапии злокачественных новообразований, а также откроет новый способ диагностики опухолей.
Степень разработанности темы. Описано два вида энтоза - гомо- и гетеротипический, при которых взаимодействуют клетки одного или разных типов, соответственно (Kroemer and Perfettini, 2014; Sun et al., 2014). Ключевую роль в обоих случаях играет акто-миозиновый комплекс внедряющейся клетки (Overholtzer et al., 2007). Для осуществления внедрения клетки в клетку необходима также динамическая реорганизация микротрубочек, регулирующая упругость клеток (Xia et al., 2014). Судьба же внедрившейся клетки - это, как правило, лизосомо-опосредованная деградация. Перечисленные выше данные в основном получены на клетках, экспериментально переведённых в суспензионное состояние.
Цель и задачи исследования. В связи с выше сказанным цель работы состояла в исследовании энтоза в субстрат-зависимых культурах нормальных и опухолевых клеток человека. Были поставлены следующие задачи:
-
изучить состояние адгезивных контактов между внутренней и наружной клетками в ходе гомотипического энтоза, а также исследовать локализацию и функциональное состояние ряда мембранных органелл клеток и компонентов цитоскелета;
-
установить роль элементов цитоскелета и мембранных органелл внутренней и наружной клеток в осуществлении гомотипического энтоза;
3. определить способ деградации внедрившейся клетки при гомотипическом энтозе;
-
выявить возможность гетеротипического энтоза при сокультивировании нормальных и опухолевых клеток субстрат-зависимых культур;
-
установить, какие варианты энтозов - гомо- или гетеротипический - преобладают в этих условиях;
-
определить способ деградации внедрившейся клетки в ходе гетеротипического энтоза.
Научная новизна. В работе впервые выявлен энтоз в человеческих культурах нормальных и опухолевых клеток эпидермального происхождения в прикреплённых к субстрату условиях. Получены новые данные о наличии десмосом между клетками-участницами энтоза. Установлено, что в процессе внедрения клетки в клетку важную роль играет актиновый цитоскелет как внедрившейся клетки, так и наружной. Получены оригинальные данные о роли микротрубочек и аппарата Гольджи при энтозе. На основе морфологических изменений клеток-участниц энтоза данный процесс разделён на 5 стадий после внедрения клетки в клетку, что позволит систематизировать описание исследуемого варианта ПКГ. Выявлена возможность гетеротипических взаимодействий между нормальными и опухолевыми клетками эпителиального происхождения и проведено сравнение частоты встречаемости различных вариантов энтоза при их сокультивировании. Предложен новый способ доказательства локализации одной клетки внутри другой. Составлена схема последовательности событий после внедрения клетки в клетку, связанных с особенностями строения энтозной вакуоли. Впервые разработан метод синхронизации вступления клеток в процесс энтоза.
Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты работы содержат новые сведения о поведении клеток, а также о функциях их органелл в ходе такого варианта ПКГ, как энтоз. Полученные данные могут быть использованы в исследованиях, направленных на изучение процессов ПКГ. Также они могут открыть новые возможности в разработке подходов противоопухолевой терапии.
Методология и методы исследования. В работе применяли классические цитологические методы получения и анализа данных, такие как: культивирование эукариотических клеток, прижизненное окрашивание и наблюдение за клетками, фиксация, цито- и иммуноцитохимическое окрашивание, ингибиторный анализ, мечение клеток бромдезоксиуридином, метод конфокальной сканирующей лазерной микроскопии, методы электронной микроскопии, статистический анализ результатов. Кроме того, был использован метод корреляционной микроскопии.
Личное участие автора. Работа полностью выполнена автором, включая анализ научной литературы, разработку экспериментальной части, получение и обработку результатов.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов данной диссертации подтверждается анализом современного состояния вопроса, адекватностью методических подходов, большим объёмом воспроизводимых результатов и статистическим анализом данных. Материалы работы представлены на 2 всероссийских и 4 международных конференциях: I всероссийская конференция «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (Санкт-Петербург, 2011), VIII конференция молодых учёных ИБР РАН (Москва, 2012), XVIII и XXI международные научные конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2011 и 2014), I международная научная конференция студентов и аспирантов Cell Technology Week (Киев, 2013), Международная научная конференция «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2014). По результатам диссертации опубликовано девять печатных работ, две из которых - статьи в рецензируемых журналах, соответствующих Перечню ВАК.
Структура диссертации. Работа изложена на 165 листах машинописного текста и дополнена иллюстративным материалом в количестве 81-ого рисунка и 13 таблиц. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений и библиографического списка.
Цель и задачи работы
Он участвует в формировании ламеллоподий (Yamada and Nelson, 2007; De Smet et al., 2009): активация Racl (за счёт связи с ГТФ) приводит к образованию сетчатой структуры из актиновых филаментов посредством белка IQGAP (Рисунок 5) (Noritake et al., 2005; Benseor et al., 2007). Работа данного белка необходима при энтозе: активация Rac1 способствует увеличению механической деформируемости наружной клетки, в результате чего она способна обхватывать внедряющуюся клетку (Sun et al., 2014).
Белок Cdc42 ответственен за реорганизацию актинового цитоскелета на протяжении всего клеточного цикла. Также он участвует в сигналинге и образовании филоподий (De Smet et al., 2009). Регуляция работы Cdc42 осуществляется Rho-ГТФазо-подобными белками.
IQGAP – строительный белок, связывающийся с сигнальными и структурными молекулами, участвует в регуляции клеточной миграции, клеточной адгезии и организации цитоскелета (Benseor et al., 2007; Brandt, Grosse, 2007; Bielak-Zmijewska et al., 2008). IQGAP колокализуется в непосредственной близости с актином в ламеллоподиях и повышает полимеризацию актина. Детальное изучение этого белка выявило, что активация цитоскелета идёт через активирование белков Rac1 и Cdc42. Кроме того, транслокация IQGAP из цитоплазмы в область плазматической мембраны клетки и его ассоциация с Е-кадгерином и -катенином способствует диссоциации кадгеринового комплекса с актиновым цитоскелетом, что приводит к ослаблению межклеточной адгезии. Стоит также отметить, что нарушения в работе Е-кадгерина и Е-кадгерин-катенинового комплекса может являться причиной образования опухолей у человека (Frixen et al., 1991).
Важным участником формирования структуры “клетка-в-клетке” является также актиновый цитоскелет. Во-первых, как уже говорилось, он обеспечивает механическую деформируемость наружной клетки. Во-вторых, при взаимодействии актинового цитоскелета с миозином II типа образуется акто-миозиновый комплекс, в результате работы которого создаётся контрактильная сила, осуществляющая внедрение клетки в клетку. Причём показано, что при энтозе в суспензии работа акто-миозинового комплекса необходима именно во внедряющейся клетке (Overholtzer et al., 2007).
Известно, что в прикреплённых клетках актиновые филаменты могут быть связаны как с адгезивными белками Е-кадгеринами (обеспечивающими межклеточное взаимодействие), так и с интегринами (контакт между клеткой и субстратом) (Calderwood et al., 2000; Weber et al., 2011). Как следствие обеспечивается уравновешивание контрактильных сил, создаваемых акто-миозиновым комплексом. При откреплении клетки от матрикса данное равновесие нарушается. Существует гипотеза, что в результате такого нарушения в клетке, перешедшей в суспензионное состояние, активируется Rho 17 ROCK-сигнальный путь (Rho-ГТФаза активирует киназу ROCK, которая, в свою очередь, воздействует на акто-миозиновый комплекс (Amano et al., 1996; Kimura et al., 1996; Katoh et al., 2011; Ramachandran et al., 2011)). После этого клетка за счёт контрактильных сил, обеспечивающихся актином и миозином, внедряется в другую клетку, которая оказывает меньшее механическое сопротивление (Рисунок 6) (Overholtzer et al., 2007; Yang and Li, 2012; Wen et al., 2013).
Рисунок 6. Модель энтоза в откреплённых от субстрата клетках. При образовании межклеточных контактов, опосредованных кадгеринами, в одной из клеток активируется ROCK, регулирующая акто-миозиновые взаимодействия. Это вызывает контрактильную силу, которая перемещает данную клетку в сторону формирующегося контакта. Возможно, интегриновый контакт работает как уравновешивающая сила, которая предотвращает энтоз в течение межклеточных взаимодействий прикреплённых клеток. Когда клетки, открепившиеся от матрикса, взаимодействуют между собой, дисбаланс в контрактильной силе между двумя клетками может привести к тому, что одна из них начнёт внедряться в другую, и таким образом, образуется структура “клетка-в-клетке” (Overholtzer et al., 2007; Doukoumetzidis and Hengartner, 2008).
Роль акто-миозинового комплекса во внедрении клетки в клетку была доказана в ходе экспериментов по ингибированию Rho-ROCK-пути с помощью Tat-C3 (Rho ГТФазного ингибитора), Y-27632 и H-1152 (двух отличающихся по структуре ингибиторов ROCK белков), а также в экспериментах по обработке клеток латрункулином Б (ингибитором полимеризации актина), либо блеббистатином (ингибитором миозина II). Каждое из этих воздействий приводило к значительному снижению количества внедряющихся клеток в культуре (Overholtzer et al., 2007). Недавно было показано, что инициация энтоза связана с поляризованным распределением активности Rho и акто-миозинового комплекса во внедряющейся клетке. Последнее связано с работой белка p190A RhoGAP в области адгезивного контакта между клетками-участницами данного варианта клеточной гибели (Рисунок 7) (Sun et al., 2014). p190A RhoGAP оказывает негативное влияние на активность RhoA, в результате которого последняя переходит в неактивную ГДФ форму (Mori et al., 2009). Подавление экспрессии гена p190A RhoGAP так же, как и ингибирование ROCK снижает вероятность вступления клеток в процесс энтоза. Так, изучая данный вариант клеточной гибели, Сан с коллегами использовали FRET биосенсор, который определяет количество Rho и иллюстрирует цветовой гаммой, где его концентрация больше, а где меньше. Оказалось, что большая концентрация Rho при энтозе наблюдается в кортикальных зонах клетки, в дистальной части от межклеточных контактов. Наибольшее количество фосфорилированных по серину 19 лёгких цепей миозина II (pMLC2) наблюдалось также в дистальной части клетки относительно межклеточных контактов. Эти наблюдения позволяют предположить, что внедряющаяся клетка приводится в движение за счёт поляризованности ROCK-регулируемого кортикального акто-миозинового комплекса. Также были проведены эксперименты по ингибированию разных RhoGAP (Cont.si, DLC si, p190A si, LARG si). Оказалось, что только при ингибировании белка p190A GAP происходит значительное снижение процента энтозов в культуре.
Механизм внедрения клетки в клетку при эмпериполезе
При этом плазматическая мембрана таких наружных клеток образует вырасты (псевдоподии), которые постепенно окружают соседнюю клетку. Для обеспечения этого процесса необходима работа ROCK (Abreu and Sealy, 2012). Результатом такого типа гомотипического КК является неапоптотическая гибель внутренней клетки. Интересно, что по данным Оверхольцера с коллегами энтоз в данной клеточной линии отсутствует.
Кроме того, в 2012 году Кано с соавторами описали гомотипический вариант КК в клетках аденокарциномы протока поджелудочной железы человека, в ходе которого происходит поглощение одной клетки другой и который не зависит от активности ROCK и наличия Е-кадгеринов (Cano et al., 2012). Нокдаун экспрессии данных молекул в клетках с помощью siRNA не повлиял на уровень КК в культуре. При таком варианте клеточной гибели формирование структуры “клетка-в-клетке” связано с работой cdc42 GTPase. В ходе исследования было показано, что клетки, принимающие участие в данном варианте клеточной гибели, были положительны на виментин, мезенхимальный маркёр, характерный для TGF-опосредованного эпителио-мезенхимального перехода (ЭМП) (Xu et al., 2009; Kim et al., 2014). Однако в них не выявлялся гладко-мышечный актин (SMA) и локализация -катенина на мембране. Это свидетельствовало о том, что данные клетки-участницы КК не достигли классического ЭМП. Кроме того, в этих клетках отсутствовала экспрессия белка Nupr1, активация которого в клетках связана с увеличением метастатического потенциала последних (Kim et al., 2012) – Nupr1 обеспечивает ЭМП клеток, способствуя метастазированию. На основе полученных результатов было высказано предположение, что при низких уровнях белка Nupr1 в клетках может запускаться TGF-опосредованная активация р38МАРК пути, сопровождающаяся транскрипцией генов CD68, CDC42, CXCL1 и CXCL6, присущих фагоцитам. Как следствие, такие клетки могут поглощать соседние клетки. Таким образом, механизм формирования структуры “клетка-в-клетке” в данном случае отличается от описанного выше энтоза. Интересно, что ингибирование экспрессии белка Nupr1 в клетках аденокарциномы поджелудочной железы человека при их совместном культивировании с лимфоцитами не повлияло на уровень КК (в данном случае – эмпериполеза). В работе также высказывается предположение, что такой вариант КК может быть использован для ингибирования метастазирования при данном смертельном заболевании.
Таким образом, возникает вопрос, являются ли энтоз и два последних описанных варианта КК отдельными видами гибели клеток, или это один тип ПКГ, в котором задействованы обе клетки-участницы, каждая из которых вносит свой вклад в этот процесс. Немаловажную роль в процессе энтоза играют микротрубочки (Xia et al., 2014), от динамики которых зависит упругость клетки (Рисунок 9). Показано, что внутренняя клетка обладает большей упругостью по сравнению с наружной клеткой. Динамика и пластичность микротрубочек в свою очередь регулируются работой белка МСАК, который способен вызывать их деполимеризацию (Hunter et al., 2003; Domnitz et al., 2012). Так, Ксиа с соавторами показали, что внедрение одной клетки внутрь другой зависит от конформации данного белка. Закрытая конформация обеспечивает связывание МСАК с белком TIP150 и локализацию на +-концах микротрубочек. В таком случае МСАК способен уменьшать упругость клетки за счёт обеспечения лабильности микротрубочек, что способствует энтозу. Открытая конформация МСАК, напротив, препятствует его связыванию с белком ТГР150, в результате чего упругость (жёсткость) клетки сохраняется. Как следствие, внедрение клетки в клетку не происходит.
Конформация белка МСАК зависит от киназы Aurora А: фосфорилирование МСАК данной киназой приводит к образованию открытой конформации.
Схематическая модель, иллюстрирующая роль киназы Aurora А, МСАК и белка TIP 150 в процессе энтоза. МСАК, митотический кинезин, ассоциированный с центромерой, находясь в закрытой конформации, связывается с +-концами микротрубочек посредством белка TIP150, что способствует уменьшению упругости клетки за счёт сохранения лабильности микротрубочек. В результате может сформироваться структура “клетка-в-клетке”. Aurora A киназа фосфорилирует N-концевой домен МСАК, что приводит к нарушению его взаимодействия с С-концевым участком. В результате связывание МСАК с TIP150 не происходит, и, как следствие, МСАК не связывается с +-концом микротрубочки. При этом нарушается регуляторная функция МСАК: +-концы микротрубочек становятся статичными, динамика микротрубочек существенно снижается, регуляция упругости клетки нарушается, внедрение клетки в клетку не происходит. Стоит также отметить, что работа белка МСАК может регулироваться не только циклом фосфорилирования/дефосфорилирования, но и пространственным разобщением контакта фермент-субстрат. В последнем случае нефосфорилированный МСАК обладает бльшей деполимеразной активностью, что также приводит к нарушению регуляции упругости клетки. Помимо этого, отсутствие микротрубочек в данной ситуации приводит к тому, что снижается способность клетки трансформировать свою плазматическую мембрану (Travis and Bowser, 1990). В результате процесс энтоза блокируется. Таким образом, для формирования структуры “клетка-в-клетке” необходимым условием является динамическое состояние микротрубочек, от которого зависит степень упругости клетки. Нарушение же регуляции упругости клетки вследствие как сверхстабилизации микротрубочек, так и их дестабилизации, препятствует процессу энтоза (Xia et al., 2014).
Судьба внедрившейся клетки при энтозе может быть различной. Она может выйти из энтозной вакуоли, поделиться внутри неё (при этом обе дочерние клетки впоследствии выходят из энтозной вакуоли), но в большинстве случаев внедрившаяся клетка подвергается деградации внутри энтозной вакуоли (Рисунок 10). 23 внедрение "клетка-в-клетке" гибель внедрившейся клетки Рисунок 10. Судьба внедрившейся клетки при энтозе (Overholtzer and Brugge, 2008). Было показано, что деградация внедрившейся клетки, как правило, не связана с механизмами апоптоза, а осуществляется с помощью лизосомальных ферментов (Overholtzer et al., 2007; White, 2007). Кроме того, белки аутофагии, такие как Atg5, Atg7, Vps34 и LC3, принимают участие в формировании одномембраной энтозной вакуоли (Florey at al., 2011; Florey at al., 2015). Впоследствии они обеспечивают её слияние с лизосомами. Активация процессов аутофагии после формирования структуры "клетка-в-клетке" показана также на клетках линии MDA-MB-486 (Abreu and Sealy, 2012).
Известно, что в некоторых случаях небольшая часть внедрившихся клеток (порядка 25%) может погибать по пути апоптоза. При этом в них наблюдается активация каспазы-3 (Wan et al., 2012).
Данные о судьбе самой энтозной вакуоли после деградации внедрившейся клетки немногочисленны. Некоторые авторы отмечают лишь, что данная вакуоль со временем исчезает.
Постановка эксперимента с нокодазолом, вызывающим деполимеризацию микротрубочек
На ранней стадии энтоза плазматическая мембрана внутренней клетки тесно контактирует с мембраной энтозной вакуоли, поэтому пространство между ними не выявляется (Рисунок 21, а). На второй стадии энтоза, когда сохраняются лишь единичные места контакта двух мембран, начинают чётко выявляться границы внутренней клетки и энтозной вакуоли (Рисунок 21, б). На третьей и четвёртой стадиях энтоза расстояние между двумя мембранами достигает максимального значения из-за уменьшения размеров внутренней клетки (Рисунок 21, в, г). На последней стадии энтоза пространство между плазматической мембраной внутренней клетки и мембраной энтозной вакуоли вновь сокращается (Рисунок 21, д).
В большинстве случаев внутренняя клетка в ходе энтоза подвергается деградации (Overholtzer et al., 2007; White, 2007). Как следствие, изменяется морфология её ядра. На первой стадии энтоза оно имеет округлую форму, богато диффузным хроматином, в нём чётко выявляются несколько ядрышек (Рисунок 21, е). Такое состояние ядра внутренней клетки сохраняется также в течение второй стадии энтоза (Рисунок 21, ж). Однако на третьей стадии ядро внутренней клетки несколько деформируется, приобретая неправильную форму, хроматин начинает конденсироваться, ядрышки не всегда отчётливо видны (Рисунок 21, з). На четвёртой стадии ядро значительно сжимается, хроматин заметно конденсируется, ядрышки не выявляются (Рисунок 21, и). На заключительной стадии ядро внутренней клетки подвергается фрагментации (Рисунок 21, к). Параллельно изменениям морфологии ядра внутренней клетки происходит усиление вакуолизации её цитоплазмы.
Для того чтобы одна клетка смогла проникнуть внутрь другой клетки в процессе энтоза, им необходимо провзаимодействовать друг с другом. По данным литературы известно, что в популяции клеток MCF10А (эпителиальные клетки молочной железы человека) главную роль в процессе внедрения одной клетки в другую в суспензии играют контакты с высоким содержанием Е-кадгерина и -катенина (Overholtzer et al., 2007). Чтобы проверить, участвуют ли такие адгезивные контакты в процессе энтоза в субстрат-зависимых культурах клеток, мы окрашивали клетки линий А431 и НаСаТ антителами к -катенину. Наши результаты показали, что как в одноядерных клетках (т.е. клетках, не участвующих в процессе энтоза), так и в энтозных клетках данный белок выявлялся по всей периферии клеток. Однако при энтозе появлялись дополнительные места его локализации. Так, на ранней стадии данного явления антителами к -катенину окрашивалось толстое кольцо в области контакта внедрившейся клетки и энтозной вакуоли (Рисунок 23, в). На второй стадии энтоза -катенин выявлялся по периферии внутренней клетки и по периферии энтозной вакуоли (Рисунок 23, е). На третьей стадии обнаруживались единичные места контакта внедрившейся клетки с энтозной вакуолью, в состав которых входил данный белок. Однако такие картины встречались редко. Как правило, начиная с третьей стадии энтоза окрашивание антителами к -катенину между внедрившейся клеткой и энтозной вакуолью не обнаруживалось (Рисунок 23, и).
Адгезивные контакты между внутренней и наружной клетками на разных стадиях энтоза. Культура клеток А431. а-в - первая стадия энтоза; г-е - вторая стадия; ж-и - четвёртая стадия, а, г, ж - фазово-контрастная микроскопия; б, д, з -цитохимическое окрашивание ядер с помощью DAPI; в, е, и - иммуноцитохимическое окрашивание антителами к Р-катенину; конфокальная сканирующая лазерная микроскопия.
Кроме того, в ходе исследования клеток-участниц энтоза на ТЭМ было выявлено наличие специализированных контактов, десмосом, между ними (Рисунок 24, б). Для того чтобы исследовать расположение и целостность десмосом между клетками на разных стадиях энтоза, мы использовали антитела к белку плакоглобину, входящему в состав десмосом (Kowalczyk et al., 1994; Garrod and Chidgey, 2008). В культуре клеток A431 плакоглобин выявлялся по периферии клеток в монослое, что говорит о наличии большого числа десмосом между соседними клетками. На ранней стадии энтоза были выявлены плотно прилегающие друг к другу бляшки плакоглобина, расположенные по периферии внедрившейся клетки (Рисунок 24, в). Затем количество десмосом уменьшалось. При этом изменялась форма и размер внедрившейся клетки: она поджималась, а на поверхности появлялись выросты плазматической мембраны в виде шипиков, на вершине которых располагались отдельные десмосомы (вторая стадия энтоза). Впоследствии плакоглобин между внедрившейся клеткой и энтозной вакуолью не выявлялся.
Таким образом, в субстрат-зависимых культурах клеток человека, имеющих эпителиальное происхождение, на ранних стадиях энтоза между внедрившейся и энтозной клетками присутствует большое количество адгезивных контактов, опосредованных р-катенином. Кроме того, в культуре клеток А431 выявлено наличие специализированных контактов - десмосом - между клетками-участницами энтоза. Показано, что в ходе энтоза оба варианта адгезивных контактов разрушаются.
Согласно данным Оверхольцера с коллегами (Overholtzer et al., 2007), когда клетки находятся в суспензионном состоянии, внедрение одной клетки внутрь другой осуществляется за счёт актинового цитоскелета внедряющейся клетки. В субстрат-зависимых культурах клеток по нашим данным в процессе захвата внедряющейся клетки участвуют также актиновые филаменты энтозной клетки, которые необходимы для образования описанной ранее псевдоподии (Theriot, Mitchison, 1992; Charras and Paluch, 2008; Insall and Machesky, 2009). В связи с этим нашей задачей было установить роль актинового цитоскелета клеток в процессе энтоза. При окрашивании клеток фаллоидином, меченым TRITC, было выявлено, что в одноядерных клетках актиновые филаменты располагались по краю хорошо развитых ламелл в виде плотных пучков. Также присутствовали короткие микрофиламенты актина внутри цитоплазмы. Иногда встречались отдельные стресс-фибриллы. Нередко клетки образовывали небольшие филлоподии, в которых также присутствовали актиновые филаменты (Рисунок 25, Аа). На ранней стадии энтоза во внедрившейся клетке обнаруживались, как правило, две зоны с высоким содержанием актина в проксимальной части относительно ядра наружной клетки (Рисунок 25, Аб; Ба). Кроме того, актиновые филаменты располагались в кортикальной зоне внутренней клетки. На второй стадии энтоза актиновый цитоскелет внедрившейся клетки выявлялся преимущественно по ее периферии в виде плотных пучков, а также в цитоплазме в виде коротких хаотично расположенных микрофиламентов (Рисунок 25, Ав; Бб). На третьей стадии энтоза значительных изменений в состоянии и расположении актиновых филаментов внутренней клетки выявлено не было (Рисунок 25, Бв). На заключительной стадии энтоза во внедрившейся клетке сохранялись отдельные короткие актиновые филаменты в цитоплазме, либо актин не визуализировался (Рисунок 25, Бг).
Частота встречаемости картин “клетка-в-клетке” при длительном культивировании в исследуемых культурах
Агенты, использованные в данной работе, такие как цитохалазин В, нокодазол и брефелдин А, разводились на ДМСО. В связи с этим при постановке экспериментов с перечисленными веществами в качестве первого контроля были взяты клетки, культивировавшиеся в обычной среде. Вторым контролем служили клетки, в среду культивирования которых вносился ДМСО (до конечной концентрации 5 мкг/мл).
Было показано, что инкубация клеток с ДМСО не привела к каким-либо изменениям в состоянии актинового цитоскелета, системы микротрубочек, аппарата Гольджи и лизосом (Рисунок 51), а также не повлияла на число митозов, апоптозов и энтозов в культуре (Рисунок 52). Рисунок 51. ДМСО в концентрации 5 мкг/мл не оказывает влияние на органеллы клеток линии А431. а-в - актиновый цитоскелет клеток: а - одноядерные клетки; б, в - структура "клетка-в-клетке". а, в - цитохимическое окрашивание актиновых филаментов фаллоидином, меченым TRITC, и ядер с помощью DAPI, наложение, флуоресцентная микроскопия, г - система микротрубочек, окрашивание клеток антителами к а-тубулину, флуоресцентная микроскопия, д, е - аппарат Гольджи: е -окрашивание клеток антителами к белку аппарата Гольджи 58К и цитохимическое окрашивание ядер с помощью DAPI, наложение, флуоресцентная микроскопия, ж, з -кислый везикулярный компартмент: з - прижизненное окрашивание клеток акридиновым оранжевым, флуоресцентная микроскопия, б, д, ж - фазово-контрастная микроскопия.
Гистограммы частоты встречаемости митозов, апоптозов и энтозов при культивировании клеток линии А431 в присутствии ДМСО (5 мкг/мл). Стоит также отметить, что при постановке экспериментов по воздействию цитохалазином В, нокодазолом и брефелдином А на клетки линии А431 был предварительно проведён подбор концентрации данных агентов. При концентрации в среде культивирования ниже 5 мкг/мл для каждого из агентов не наблюдалось значительных изменений в структуре изучаемых компонентов клетки. Вероятно, это связано с тем, что клетки линии А431 устойчивы к различного рода воздействиям. Кроме того, в данной культуре наблюдается ярко выраженная гетерогенность клеточных популяций. 5.13. Судьба внедрившейся клетки при энтозе
Как уже говорилось ранее, внедрившаяся клетка в ходе энтоза, как правило, подвергается деградации. Однако до сих пор не было показано, как именно заканчивается процесс энтоза. В связи с этим мы провели прижизненное наблюдение за клетками линии MCF7.
В начале наблюдения энтозная клетка хорошо распластана по субстрату, наблюдается выраженная ламелла. Внедрившаяся клетка без каких-либо видимых морфологических изменений находится внутри крупной вакуоли (первая стадия энтоза) (Рисунок 53, 0 ч).
Через 9 часов с момента начала наблюдения происходит изменение формы и морфологии внутренней клетки: ядро поджимается, цитоплазма начинает вакуолизироваться (вторая стадия энтоза). Изменяется также и форма наружной клетки (она становится менее распластанной, поджимается). Через 19 часов наблюдается ярко выраженная деградация внедрившейся клетки: её размер уменьшается в несколько раз, ядро не выявляется, происходит сильная вакуолизация цитоплазмы (пятая стаддия энтоза). Через 28 часов с момента наблюдения продолжается процесс деградации внутренней клетки, размер энтознои вакуоли уменьшается. Через 48 часов происходит экструзия непереваренного материала, ядро наружной клетки вновь меняет свою форму с бобовидной на овальную. Через 78 часов энтозная клетка снова хорошо распластана по субстрату, а непереваренные остатки внедрившейся клетки остаются рядом с ней в виде клеточного дебриса. Впоследствии дебрис не обнаруживается.
Кроме того, в ходе наблюдения мы обнаружили альтернативный вариант судьбы внедрившейся клетки, а именно - её выход из энтознои клетки. На рисунке 54 представлена характерная структура "клетка-в-клетке": ошаренная внедрившаяся клетка находится внутри крупной вакуоли, энтозная клетка поджата, её ядро смещено к периферии и имеет бобовидную форму. Через 14 часов с момента наблюдения внутренняя клетка выходит из наружной клетки. При этом обе клетки вновь распластываются по стеклу и образуют ламеллы.
Таким образом, мы установили, что внедрившаяся клетка может как деградировать внутри энтознои клетки, так и выходить из неё, что соответствует данным литературы (Andrew and Collings, 1946; Overholtzer et al., 2007; Overholtzer and Brugge, 2008). Было также отмечено, что случаи выхода внутренней клетки довольно редки (2 случая из 10 исследуемых), обычно внедрившаяся клетка деградирует внутри энтознои клетки. Помимо этого, мы показали, что весь процесс энтоза (в случае деградации внедрившейся клетки) длится более 48 часов. Причём наиболее длительная стадия энтоза - пятая. В 2005 году Монкс с коллегами показали, что эпителиальные клетки молочной железы мыши проявляют фагоцитарную активность по отношению к апоптирующим клеткам (Monks et al., 2005). В связи с этим Оверхольцер с коллегами, изучая энтоз в культуре клеток MCF10A, проанализировали, не является ли внедрение открепившейся от матрикса клетки внутрь другой клетки следствием фагоцитарного ответа на программу апоптоза, запущенную в первой клетке. В ходе исследования было доказано, что поглощение MCF10А клеток происходит независимо от процессов апоптоза (Overholtzer et al., 2007).
Стоит также отметить, что в случае эмпериполеза, когда в роли наружной клетки выступала клетка линии А431, была выявлена активация каспазы-3 во внедрившейся клетке (Wang et al., 2009). В связи с этим для того, чтобы определить, включён ли механизм апоптоза в процесс деградации внедрившейся клетки в субстрат-зависимой культуре А431, мы провели окрашивания клеток данной линии антителами к цитохрому с и к активной каспазе-3.
Известно также, что апоптоз может индуцироваться продукцией активных форм кислорода (Simon et al., 2000). Кроме того, клетки способны продуцировать активные формы кислорода при фагоцитозе (Parlesak et al., 2003). Исходя из этого, с целью убедиться, что образование структур “клетка-в-клетке” в культуре А431 не является результатом фагоцитоза апоптотического тельца, мы окрашивали клетки 2 ,4 -дихлорофлуоресцеиндиацетатом (DCFH-DA). Данный краситель позволяет выявить активные формы кислорода в клетках.