Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Кариотипы турбеллярий и использование признаков кариотипа в целях таксономии и филогении 10-25
1.1. Кариотип как таксономический признак 10-13
1.2. История изучения и основные результаты исследования хромосом турбеллярий 13-25
Глава 2. Материал и методики 26-38
2.1. Материал 26-28
2.2. Методики 28-38
2.2.1. Сбор, определение и фиксация материала 28-33
2.2.2. Методы приготовления и окрашивания препаратов хромосом 33-36
2.2.3. Анализ кариотипа 36-37
2.2.4. Метод стабильных изотопов 37-38
Глава 3. Систематика, кариотипы и особенности биологии турбеллярий рода Geocentrophora 39-61
3.1. Литературные данные по систематике и кариотипам 39-42
3.2. Собственные данные по кариотипам байкальских геоцентрофор 42-49
3.3. Особенности биологии геоцентрофор 49-61
Глава 4. История исследования, систематика, кариотипы и некоторые экологические особенности планарий рода Bdellocephala 62-101
4.1. История исследования и систематика 62-69
4.2. Литературные данные по кариотипам бделлоцефал 69-72
4.3. Собственные данные по морфологии и кариотипам байкальских бделлоцефал 72-93
4.4. Собственные данные по дальневосточным бделлоцефалам 93-95
4.5. Распространение, распределение по глубинам и питание байкальских бделлоцефал 95-101
Глава 5. Кариотипическая эволюция и родственные связи турбеллярий родов Geocentrophora и Bdellocephala 102-118
5.1. Род Geocentrophora 102-109
5.2. Род Bdellocephala 109-118
Заключение 118-120
Выводы 121-122
Список использованной литературы 123-142
Приложение 143-159
- История изучения и основные результаты исследования хромосом турбеллярий
- Методы приготовления и окрашивания препаратов хромосом
- Собственные данные по кариотипам байкальских геоцентрофор
- Собственные данные по морфологии и кариотипам байкальских бделлоцефал
Введение к работе
Байкал является крупнейшим центром видообразования многих организмов, в том числе турбеллярий, занимающих по числу видов четвертое место среди бентосных животных после амфипод, олигохет и моллюсков (Тимошкин, 1995). Настоящая работа является частью комплексных исследований систематики и филогении эндемичной фауны ресничных червей Байкала, проводимых в Лимнологическом институте. Для многих таксономически сложных групп турбеллярий представляется актуальным поиск дополнительных признаков, которые наряду с морфологическими характеристиками могут внести вклад в решение вопросов их систематики, эволюции и филогении. Один из таких признаков - кариотип, нередко являющийся надежным "маркером" вида, все шире применяемый в исследованиях турбеллярий. В последнее время входит в практику описание новых видов ресничных червей с привлечением сведений о кариотипе (Kawakatsu et al., 1984; Kawakatsu, Oki, Tamura, 1986; Curini-Galletti, Puccinelli, 1998). Известно, что изучение кариотипа не только имеет таксономическую значимость, но и дает ценную информацию для анализа проблемы видообразования. Использование кариотипических признаков часто оказывается полезным как для выяснения родственных связей между близкими видами (Лухтанов, Кузнецова, 1989; Gokhman, Timokhov, 2002; Петрова, Чубарева, 2004), так и для решения вопросов филогении таксонов более высокого ранга (Кузнецова, 1985; Petitpierre, 1997; Kuznetsova et al., 2002, 2004). Информация о кариотипах байкальских турбеллярий очень ограничена: единственным опытом изучения их хромосом являются работы Н.А. Умылиной (1971, 1973, 1979), в которых представлены мейотические хромосомы 15-ти видов семейства Dendrocoelidae.
Для настоящей работы были отобраны роды Geocentrophora (Lecithoepitheliata, Prorhynchidae) и Bdellocephala (Tricladida, Dendrocoelidae), включающие наряду с байкальскими эндемичными "букетами видов" также виды с более широким распространением, обнаружившие, согласно нашим предварительным данным, существенную дифференциацию по числу и морфологии хромосом. Байкальские представители Geocentrophora -хорошо изученная в морфологическом отношении группа, включающая 8 видов. Это сравнительно молодая, типично неоэндемичная фауна, сохранившая близкое морфологическое сходство с современными космополитическими видами этого рода. Около трети видов мировой фауны проринхид являются байкальскими эндемиками (Timoshkin, 1994). Систематика рода хорошо разработана (Тимошкин, 1984 а, б; Тимошкин, 1991), что позволило использовать эту группу в качестве модельной для постановки кариологических исследований байкальских турбеллярий и приложения их результатов для решения вопросов эволюции и филогении.
Род Bdellocephala - единственный неэндемичный род планарий, давший начало наиболее интересному очагу видообразования в Байкале (Порфирьева, 1977). Несмотря на то, что история исследования байкальских бделлоцефал начата Герштфельдтом почти полтора века назад (Gerstfeldt, 1858) и продолжена целым рядом замечательных исследователей - зоологов, систематический состав группы изучен недостаточно. Прежде всего, это связано с наличием трудно различимых морфологически близких форм, большим сходством в строении копулятивного аппарата - основного таксономического признака в систематике планарий - у многих бделлоцефал. Существуют и субъективные причины, связанные с тем, что одни авторы основывали свою классификацию на признаках внешней морфологии и окраски, другие совсем не имели живого материала и исследовали только гистологическое строение тех или иных органов. Поэтому кариологические исследования проводились нами параллельно с изучением морфологии, гистологии, а также структуры фрагмента гена 18S рРНК в целях таксономической ревизии и установления филогенетических связей внутри рода. Бделлоцефалы широко распространены в Евразии; многие из них изучены кариологически (Dahm, 1963; Yagichaschi et al., 1998; Nishitani et al., 1995; Oki et al, 1998). Более половины видов бделлоцефал являются эндемиками Байкала.
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы явилось изучение строения хромосомных наборов турбеллярий родов Geocentrophora и Bdellocephala и особенностей эволюции их кариотипов, а также интерпретация полученных результатов для решения проблем систематики и филогении этих групп животных. Цель исследования определила следующие задачи:
1. Изучить и описать кариотипы эндемичных байкальских турбеллярий рода Geocentrophora.
2. Изучить особенности биологии и пролиферативных циклов байкальских геоцентрофор.
3. Изучить кариотипы и особенности экологии планарий рода Bdellocephala из Байкала и с Дальнего Востока, применить полученные данные в целях таксономической ревизии рода.
4. Сопоставить собственные и литературные данные о кариотипах исследованных видов с филогенетическими деревами, построенными на основе морфологических и биохимических признаков.
5. Сравнить пути и механизмы эволюции кариотипов в двух исследованных группах плоских червей.
Научная новизна. На основе полученных данных о кариотипах наряду с данными морфологических, биохимических и экологических исследований проведена таксономическая ревизия рода Bdellocephala. Для фауны Байкала описаны новые эндемичные виды В. roseocula и В. ushkaniensis (Тимошкин, Наумова, Новикова, 2001); виды В. melanocinerea и, В. stellomaculatd) переописаны с восстановлением видового статуса (Тимошкин, Наумова, Новикова, 2001, Novikova et al., 2002). Показана самостоятельность вида В. agrillosa, ранее сведенного в синонимы В. angarensis. Впервые описаны кариотипы 14 видов и 25 цветовых форм свободноживущих плоских червей. У 6 видов Geocentrophora обнаружено 4 варианта хромосомных чисел: 2п=26, 2п=28, 2п=30 и 2п=32; число плеч хромосом (NF) у изученных видов варьирует от 36 до 60. Показано, что для исследованных видов признаки кариотипа являются видоспецифичными. Показано, что байкальские эндемичные представители Bdellocephala отличаются кариотипически от изученных видов бделлоцефал, населяющих Евразию - первые имеют 2п = 20, 24 и 26, в то время как последние — 2n = 16, 28 и 56.
Разработан экспресс-метод приготовления временных препаратов хромосом, позволивший впервые выявить особенности суточной динамики митотической активности у литоральных турбеллярий-проринхид. Установлена связь динамики пролиферативной активности с фотопериодичностью.
Комплексный подход к изучению двух родов эндемичных байкальских турбеллярий позволил составить представление о путях и механизмах их эволюции и о роли преобразований хромосомных наборов в становлении эндемичных «букетов» видов на примере исследованных групп.
Теоретическая и практическая значимость. Получены новые данные о кариотипах родов Geocentrophora и Bdellocephala, они применены для развитии концепции видообразования байкальской эндемичной фауны свободноживущих ресничных червей. Показана перспективность использования комплекса независимых методов и маркеров для решения вопросов филогении и систематики на примере двух родов турбеллярий. Результаты проведенных кариологических исследований создают базу для цитогенетического мониторинга изученных групп. Разработанные методики приготовления препаратов хромосом с обязательным учетом особенностей суточной динамики пролиферативной активности, необходимость которого отражена в работе, могут быть рекомендованы для применения на других группах организмов.
Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на 5 международных и одном Всероссийском совещаниях, конференциях и симпозиумах: на международном совещании "Baikal as a natural laboratory for global changes" (Иркутск, 1994); на второй Верещагинской байкальской конференции (Иркутск, 1995); на VIII международном симпозиуме по биологии турбеллярий (Брисбан, Австралия, 1996); на III Всероссийском совещании по кариосистематике беспозвоночных животных (Москва, 1997); на третьей Верещагинской Байкальской конференции (Иркутск, 2000); на 43-ей международной конференции по Великим озерам ("Great Lakes, Great Rivers") (Корнвелл, Канада, 2000); на III международном симпозиуме "Speciation in ancient Lakes" (Иркутск, 2002). Результаты работы неоднократно докладывались и обсуждались на научных семинарах и отчетных сессиях Лимнологического института СО РАН в 1995-2004 гг и на заседании Отдела зоологии БПИ ДВО РАН в 2004 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы (191 источник, из них 122 на иностранных языках) и приложения. Работа изложена на 159 страницах, содержит 8 таблиц и 55 рисунков.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научным руководителям доктору биологических наук, профессору Валентине Григорьевне Кузнецовой (Зоологический институт РАН) и кандидату биологических наук Олегу Анатольевичу Тимошкину (Лимнологический институт СО РАН) за неоценимую помощь и внимание. Я глубоко благодарна сотрудникам лаборатории биологии водных организмов -кандидатам биологических наук Татьяне Яковлевне Ситниковой, Валентине Ивановне Провиз, Ольге Тимофеевне Русинек и Зое Васильевне Слугиной за ценные замечания и постоянную поддержку. Моя искренняя признательность кандидату биологических наук Татьяне Владимировне Наумовой и Алене Александровне Широкой за каждодневную помощь и содействие. Я благодарна сотрудникам Лимнологического института -кандидатам биологических наук Наталье Григорьевне Мельник, Ольге Ивановне Белых и Антонине Валентиновне Натягановой за консультации по теме работы. Пользуюсь случаем выразить благодарность командам научно-исследовательских судов "Титов", "Верещагин" и "Обручев", а также всем замечательным водолазам, без которых был бы невозможен сбор байкальских турбеллярий. Работа выполнена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант N 98-04-49851).
История изучения и основные результаты исследования хромосом турбеллярий
Как показывает анализ мировой литературы, использование характеристик кариотипа в качестве таксономических признаков перспективно при таксономических, эколого-генетических, эволюционных исследованиях низших Metazoa вообще и ресничных червей в частности. Число хромсом турбеллярий не является консервативным признаком и варьирует в гаплоидном наборе от 2-3 у Gyratrix hermaphroditus Ehrenberg, 1831 (L Hardy, 1986) до 19 у Phagocata fawsetti (Ball, Gourbalt, 1975). Если имеет место полиплоидия, количество хромосом может достигать 96, как у гексаплоидных Phagocata velata XStringer, 1909) (Ball, Gourbault, 1975). Имеются случаи появления дополнительных, или В - хромосом в кариотипах плоских червей, особенно многочисленные у планарий родов Dugesia и Microplana (Kawakatsu et al; 1988 a, Tamura et al, 1988; Deri et al, 1999; Batistoni et al, 2001). У многих видов турбеллярий описан соматический мозаицизм по числу хромосом. Планарий Microplana terrestris (Muller, 1774), эудиплоидный кариотип которых состоит из трех пар хромосом (2п=2х=6), обнаружили широкую вариабельность в числе хромосом как внутри, так и между особями, которая интерпретируется исследователями как явление миксоплоидной гипердиплоидии (Ball, de Vries, 1983). У 17 планарий этого вида, подвергнутых кариологическому анализу, обнаружено 9 вариантов хромосомных наборов. Небольшое число хромосом основного кариотипа и проведенный кариометрический анализ позволили авторам установить, какие именно хромосомы продублированы на различных пластинках более чем в двух копиях и трактовать эти вариации как случаи трисомической анеуплоидии (рис. 1В, С), двойной трисомической анеуплоидии (рис. ID), тетрасомической анеуплоидии (рис. IE), тройной трисомической анеуплоидии и пентасомической анеуплоидии (рис. IF). Значение этих вариаций неизвестно.
Интересно, что другой вид планарий Poly cells auriculata Ijima et Kaburaki 1916 из Японии, базикариотип которого состоит из 3 пар хромосом, тоже обнаруживает высокую степень хромосомного полиморфизма в различных популяциях. Для этого вида описано 17 вариантов кариотипов, в это число входят варианты ди-, три-, тетра- и гексаплоидных наборов хромосом, некоторые образуются за счет делеций отдельных хромосом или одного-двух центрических слияний. У некоторых особей клетки разных тканей имеют одинаковый кариотип, у других обнаружены различные миксоплоидные мозаики внутри одной особи (Teshirogi, 1991).
В связи с частыми случаями вариабельности хромосомных наборов плоских червей как у разных особей одного вида или популяции, так и в тканях одной особи, становится ясна необходимость точного первичного описания эудиплоидного кариотипа с привлечением достаточно обширного материала. Данные о числе и морфологии хромосом помогают решить многие вопросы в таксономии турбеллярий. Наряду с другими признаками характеристики кариотипа используются при филогенетических реконструкциях, служат критерием правильности филогенетических схем, построенных, как правило, на основе морфологических данных (Kawakatsu et al, 1988 b, 1989).
В соответствии с появлением и совершенствованием методов исследования хромосом в истории изучения кариотипов турбеллярий можно выделить несколько особенных дат и этапов. Первые исследования в этой области были предприняты Арнольдом и Маттиесоном (Arnold, Mattieson, 1909) на Dendrocoelum lacteum ((Muller 1774) .
В течение первого этапа, несмотря на его продолжительность (1909-1952 гг.), исследования хромосом оставались единичными, определение их количества - часто неточным; качество кариологических препаратов было низким. И все же в это время началось накопление данных о кариотипах и приобретение опыта кариологических исследований ресничных червей. В значительной мере это заслуга таких авторов, как Пеннипакер (Pennypacker, 1938, 1949) иБеназзи (Benazzi 1948, 1951).
Второй этап был коротким и длился от 1952 до 1958 года. В это время происходит значительный прогресс в развитии общей методики кариологических исследований. В становление современных методов приготовления препаратов хромосом значительный вклад внесли такие усовершенствования, как получение суспензии клеток и обработка их в гипотоническом растворе (Hsu, 1952), применение в качестве фиксатора спирт-уксусной смеси (Sachs, 1953), предварительное колхицинирование ткани (Ford, Hamerton, 1956) и воздушное высушивание препаратов (Rothfels, Siminowich, 1958). Усовершенствование методов позволило получать гораздо более качественные препараты хромосом.
Методы приготовления и окрашивания препаратов хромосом
Одной из основных особенностей приготовления кариологических препаратов турбеллярий является использование их высокой регенеративной способности. Большинство исследователей используют для изучения хромосом ткани регенеративной бластемы, в которых велико количество делящихся клеток.
Наиболее полно методика приготовления препаратов хромосом плоских червей в митозе описана в работах Оки, Тамура и Кавакацу (Oki et al, 1987, 1988, 1998, 1999).
Сначала животные адаптируются к лабораторным условиям. Они содержатся в закрытых емкостях с водой и питаются печенью цыплят. Затем здоровые животные лишаются пищи более чем на 4 дня перед разрезанием. Для приготовления кариологических препаратов используют обычно следующие приемы: 1. Животные, разрезанные поперечно на уровне позади ротового отверстия содержатся в культуральных емкостях; половозрелые экземпляры разрезаются на среднем уровне между ртом и половым отверстием. 2. После 2-4 дней культивирования отделяют передние части регенерировавших кусков (каждый кусок - не менее 1мм3). 3. Кусочки погружаются в5мл1-10М раствора колхицина на 1-3 часа. 4. Кусочки переносятся в 5 мл 0,1 % КС1 на 30 минут. 5. Затем каждый кусочек переносится на предметное стекло и окрашивается ацето-орсеином 10-30 минут.
Окрашенные кусочки раздавливаются под покровным стеклом и изолируются парафиновым бальзамом. Для приготовления хромосомных препаратов использовали ткани регенеративной бластемы (Новикова, Тимошкин, 1996). Червя разрезали поперек между глоткой и половым аппаратом и культивировали 4 -7 дней до образования регенеративной бластемы. Затем новообразованную ткань (около 1 мм шириной) отрезали от обеих половин планарии и делили на кусочки размером примерно 1мм3.
Для ускоренного приготовления временных кариологических препаратов был разработан экспресс-метод (Новикова, Тимошкин, 1996). Целого червя помещали на предметное стекло в каплю ацетоорсеина, слегка придавливали покровным стеклом, оставляли на 1 мин., давая краске проникнуть в ткань, затем тщательно додавливали препарат.
Процедура приготовления постоянных кариологических препаратов турбеллярий рода Geocentrophora отличалась от общепринятой тем, что не применялось колхицинирование. Выдерживание целых животных или кусочков ткани в растворах колхицина разной концентрации (от 0,1 % до 2%) в течение различных периодов времени (от 30 мин до 40 часов) никогда не давало положительного результата в отношении количества делящихся клеток и улучшения разброса и морфологии хромосом. Поэтому для увеличения количества делящихся клеток препараты приготавливали в часы пиков митотической активности, для чего был изучен суточный ритм пролиферативной активности (см. гл. 3.3.). В случае планарии рода Bdellocephala кусочки ткани выдерживали в 0,01 % колхицине 1 - 2 ч. Затем переносили в гипотонический 0,1% раствор цитрата натрия на 30 мин и фиксировали смесью метилового спирта и уксусной кислоты (3:1) около 60 мин. Постоянные кариологические препараты приготавливали двух типов: давленные с использованием целлофана (Анисимов, 1992) и печатанные (Побережный, 1987).
Сущность использованной нами модификации способа получения постоянных давленых препаратов состоит в замене покровного стекла кусочком целлофана (Van Breugei, 1980). В данной методике большинство процедур известны как общепринятые, существо модификаций состоит лишь в операциях с целлофаном.
Метод приготовления давленных препаратов с использованием целлофана. Фиксированный кусочек ткани мацерируют на предметном стекле в 45%-ной уксусной кислоте, меняя мацерирующую смесь 2 раза по 2-3 минуты, до просветления ткани. Избыток кислоты удаляют и объект накрывают кусочком гидрофильного целлофана (примерно 2 см2), предварительно замоченного в 45% уксусной кислоте в течение нескольких часов. Поверх целлофана помещают сухое покровное стекло, фильтровальную бумагу и раздавливают ткань - сначала легким постукиванием, потом сильным нажатием. Затем по краям покровного стекла наносят несколько капель 96%-ного этанола (или метанола) и через 1-2 минуты стекло убирают. Препарат с целлофаном помещают в стакан с 96%-ным (или абсолютным) спиртом на 5-10 минут, после чего стекло вынимают из стакана и целлофан снимают, взяв за уголок пинцетом. Препарат проводят через свежую порцию спирта и высушивают на воздухе.
Метод отпечатка. Фиксированный кусочек ткани помещали в мацерирующую смесь 60%-ной молочной и ледяной уксусной кислот в соотношении 1:15-1:30 (пропорция подбирается опытным путем в каждом случае) на 1-2 минуты. Кусочки ткани переносят на предметное стекло в каплю мацерирующей смеси. С помощью тонкого пинцета кусочек ткани «печатают» на предметном стекле. Молочную кислоту вытесняют путем последовательного прикапывания сначала 2-3 капель свежего фиксатора, а затем чистого этанола (или метанола) в центр «пятна» клеток. Затем спирт отжигается на пламени спиртовки (Побережный, Островская, 1984). Препараты окрашивали ацетоорсеином, приготовленным по стандартной методике, в течение нескольких часов, споласкивали спиртом и высушивали.
Были предприняты попытки изучения тонкого строения хромосом планарий с применением методов дифференциального окрашивания. Для Ag-бэндинга (Howell, Black, 1980) препараты инкубировались в AgNC 3 с желатином во влажной камере при температуре 60 С в течение 7 минут (согласно Kuznetsova et al, 2001). Для С-бэндинга (Sumner, 1972) препараты выдерживались в 0,2 N НС1 в течение 20 минут, после промывания дистиллятом помещались в Ва(ОН)2, температуру и время экспозиции варьировали. Затем трижды споласкивали в дистиллированной воде, выдерживали в 2XSSC буфере при температуре 60С в течение одного часа, высушивали на воздухе и окрашивали 4%-ным раствором Гимза в фосфатном буфере Соренсена, рН 6,8 (по методике Kuznetsova et al, 1997).
Однако, блоки гетерохроматина удалось визуализировать только у планарий рода АгтШа, исследование которого не входило в рамки данной работы. В хромосомах планарий рода Bdellocephala не удалось выявить гетерохроматиновые блоки. Возможно, это свидетельствует об отсутствии или незначительном содержании гетерохроматина в хромосомах планарий данного рода.
Собственные данные по кариотипам байкальских геоцентрофор
Из 8 видов Geocentrophora, обитающих в озере Байкал, автором впервые изучены кариотипы шести видов Geocentrophora фауны Байкала (Novikova, 1999). Geocentrophora wasiliewb, Timoshkin, 1991: 2n=26 (8m+4sm+14sta) или (12msm+14 sta); NF=38.
В диплоидном наборе обнаружено 26 хромосом, в метафазе первого деления мейоза (Ml) - 13 бивалентов (рис.5). Хромосомы очень крупные, составляют плавно убывающий размерный ряд. Длина хромосом в самой крупной паре достигает 14 мкм, в самой мелкой — 5 мкм; общая длина гаплоидного генома (формулу см. в главе 2) - 112,4±8,22 мкм. Средняя частота хиазм в мейозе - 27±1,23. В кариотипе имеются 4 пары метацентрических хромосом, из них две пары крупных и две пары мелких, две пары субметацентрических хромосом и семь пар акроцентрических (субтелоцентрических) хромосом. Для этого вида приведена и полная, и сокращенная формула кариотипа, для большинства других видов рода -только сокращенная, без разделения двуплечих хромосом на мета- и субметацентрические, так как у многих видов имеются хромосомы, по соотношению плеч занимающие промежуточное положение между первыми и вторыми. Geocentrophora wagini, Timoshkin, 1984: 2n = 26 (10msm+16sta), NF=36.
В метафазе митоза обнаружено 26 хромосом, в метафазе I мейоза 13 бивалентов (Рис. 6). В размерном ряду хромосомы плавно убывают по длине от пары к паре, лишь две пары самых мелких хромосом существенно меньше предыдущих. Хромосомы также крупные, но несколько меньше, чем у предыдущего вида, размер самой большой пары хромосом около 12 мкм, общая длина гаплоидного генома - 104,3±5,92 мкм. Более половины хромосом (8 пар) - акроцентрические, двуплечих хромосом - 5 пар. Средняя частота хиазм в мейозе - 26±1,57. Geocentrophora porfirievae, Timoshkin et Sabrovskaya, 1984: 2n=30 (30 msm), NF=60.
Диплоидный набор состоит из 30 хромосом, в метафазе I мейоза обнаружено 15 бивалентов (Рис. 7). 6 из 40 изученных особей были мозаиками по числу хромосом. У них в подавляющем большинстве проанализированных клеток число хромосом было стандартным (2n = 30), но в отдельных клетках (суммарно - 13) число хромосом отличалось от стандартного и было равно 18 (5 клеток) или 24 (8 клеток). В стандартном наборе хромосомы по величине распределяются в три группы. Первая группа представлена одной очень крупной парой хромосом; вторая группа включает 7 пар хромосом среднего размера (2-8 - ая пары); третья группа включает 7 пар мелких хромосом (9-15 - ая пары). Все хромосомы двуплечие, акроцентрические элементы отсутствуют. Размер первой пары хромосом - 13,5 мкм. Остальные хромосомы мельче, чем у предыдущих видов, длина гаплоидного генома - 91,7±6,31 мкм. Средняя частота хиазм в мейозе - 26±2,68. Geocentrophora levanidorum, Timoshkin, 1984: 2n = 28 (26msm+2sta), NF=54.
Метафаза митоза включает 28 хромосом, метафаза 1-14 бивалентов (Рис. 8). Первая размерная группа представлена тремя парами крупных хромосом (пары 1-3), вторая размерная группа включает восемь пар хромосом среднего размера (4-11 пары), третья размерная группа включает три пары мелких хромосом (12-14 пары). В этом наборе все хромосомы двуплечие, за исключением единственной пары акроцентриков - девятой хромосомной пары. Хромосомы мельче, чем у первых двух видов (G. wagini и G. wasiliewi), по размерам они сопоставимы с хромосомами G. porfirievae. Первая, самая крупная пара хромосом, не так сильно отличается от остальных хромосом набора, как у предыдущего вида и ее размер составляет около 9, 5 мкм. Общая длина гаплоидного генома составляет 85,0±6,58. Средняя частота хиазм в мейозе 25±0,5. Geocentrophora intersticialis Timoshkin,1984: 2n=30, (12msm+18sta), NF=42.
Метафаза митоза включает ЗО хромосом, метафаза І мейоза - 15 бивалентов (Рис.9). Первая размерная группа включает одну относительно крупную хромосому (около 9,6 мкм, 1-ая пара), вторая группа - тринадцать пар хромосом (2-ая - 14-ая пары), которые убывают в размерном ряду очень плавно. Третья размерная группа включает одну мелкую пару хромосом (15-ая пара). В кариотипе преобладают одноплечие хромосомы, их насчитывается 9 пар, а двуплечих - 6 пар. По абсолютным размерам хромосомы значительно мельче, чем у всех остальных видов, длина гаплоидного генома 78,1 ±4,64 мкм. Средняя частота хиазм - 16±0,96. Geocentrophora incognita Timoshkin et Sabrovskaya, 1984: n=13.
Метафаза І мейоза включает 13 бивалентов (Рис. 10). Методические трудности работы с турбелляриями данного вида (их ткани не выдерживают процедур гипотонирования и колхицинирования и лизируются даже при низких концентрациях растворов) не позволили получить качественных митотических метафазных пластинок с хорошим разбросом хромосом. Средняя частота хиазм 18±1,33.
Собственные данные по морфологии и кариотипам байкальских бделлоцефал
Были проанализированы 115 планарии рода Bdellocephala, собранных по всему Байкалу (см. табл.2, глава 2). Морфология каждой планарии была детально описана. Из 97 особей были приготовлены кариологические препараты. Было выделено 25 форм байкальских эндемичных бделлоцефал. При выделении форм учитывались место обитания, размеры тела, форма головы и присоски, форма глаз, наличие или отсутствие ошейника (интенсивно окрашенной полосы, разделяющей голову и тело) и особенности окраски. Распределение видов и форм байкальских эндемичных бделлоцефал по озеру показано на рис. 3.
По размеру (длине тела) всех половозрелых байкальских бделлоцефал можно условно разделить на 4 группы: 1. Мелкие - до 3 см длиной 2. Средние - от 3 до 4,5 см 3. Крупные - от 4,5 см до 6 см 4. Очень крупные - более 6 см. У двух цветовых форм обнаружен кариотип I; у 11 цветовых форм - кариотип II, который является самым распространенным; у трех форм обнаружены, соответственно, кариотипы III, IV и VI; у двух форм - кариотип V. После сопоставления комплекса данных по морфологии, гистологии, кариотипам и биохимии большинство цветовых форм бделлоцефал были соотнесены с известными видами, в том числе с видами, описанными нами впервые или переописанными. k Кариотип I (В. a. angarensis) - цветовые формы 12, 25; кариотип II {В. a. olivacea) - цветовые формы 1, 2, 3, 4, 6, 7, 9, 11, 18, 20 и 24; кариотип III (В. stellomaculata) - форма 10; кариотип IV {В. agrillosa) - форма 15; кариотип V (В. melanocinerea) — формы 13 и 17; (В. roseocula) - форма 22; кариотип VI {В. baicalensis) — форма 5. В кариотипах многих видов бделлоцефал встречаются один, два или три спутника у некоторых хромосом, которые, вероятно, являются ядрышкообразующими. Спутники особенно распространены у обоих подвидов В. angarensis и у В. agrillosa и встречаются у них более чем в 60 % клеток. Обнаружен внутривидовой полиморфизм и соматический мозаицизм по числу и положению спутников, поэтому при описании стандартных кариотипов наличие спутников не отражено. В. angarensis angarensis (Gerstfeldt 1858). На стадии метафазы митоза 24 хромосомы (2п), в мейозе - 12 бивалентов (п). Формула кариотипа: 18m+6sm, субметацентрические хромосомы - пары 4, 8 и 12; NF=48. Первая пара хромосом значительно крупнее остальных (рис.12). В. angarensis olivacea (Korotneff 1912).
На стадии метафазы митоза 24 хромосомы, в Ml - 12 бивалентов. Формула кариотипа - 20m+4sm; субметацентрические хромосомы - пары 2 и 8; NF=48. Первая пара хромосом значительно крупнее остальных (рис.13, 14, 15). В. a. angarensis и В. a. olivacea - подвиды полиморфного вида В. angarensis (Порфирьева, 1979), а не самостоятельные виды (Коротнев, 1912). Их подвидовой статус подтверждается небольшими различиями в окраске и в кариотипах, сходством в гистологическом строении и структуре фрагмента гена 18S рРНК (Кузнеделов, Новикова, Наумова, 2000; Наумова, 2003; Novikova, Naumova, Timoshkin, в печати). В. stellomaculata (Korotneff 1912). На стадии метафазы митоза 24 хромосомы, в Ml - 12 бивалентов. У двух особей обнаружены В - хромосомы - по одной в нескольких метафазных пластинках. Формула кариотипа: 20m+4sm; субметацентрические хромосомы - пары 4 и 6; NF=48. Первая пара хромосом значительно крупнее остальных (рис.16). Сделано переописание вида на основании особенностей окраски, морфологии головы и глаз, гистологического строения и признаков кариотипа (Тимошкин, Наумова, Новикова, 2001). По биохимическим признакам не выделяется (попадает в группу видов, очень различных морфологически и экологически). В. agrillosa (Korotneff 1912). На стадии метафазы митоза 24 хромосомы, в Ml - 12 бивалентов.
Формула кариотипа: 20m+2sm+2st. Этот вид имеет одну (пара 6) пару субтелоцентрических хромосом, хромосомы 10-ой пары - субметацентрические; NF=46. Первая пара хромосом значительно крупнее остальных (рис.17). Н.А. Порфирьева (1977) свела этот вид в синонимы В. angarensis, однако, наличие характерной окраски, передающейся из поколения Б поколение, небольшого изолированного ареала, а также перечисленные выше особенности кариотипа свидетельствуют о видовой самостоятельности В. agrillosa. В. baicalensis (Sabussov 1903). На стадии метафазы митоза 20 хромосом, из них 16 хромосом метацентрических, две субметацентрических (пара 4), 6-ая пара по морфологии занимает промежуточное положение между субметацентрическими и акроцентрическими хромосомами, но ближе к акроцентрическим. Формула кариотипа: 16m+2sm+2st. Первая пара хромосом не такая крупная, как у остальных байкальских бделлоцефал.
