Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕН ИИ 3
ЬВЕЗВДЕИИЕ 4
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
2.1. ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ФАКТОРТАТ 8
2.2. ПЕНЕТРА1ИНЫ 15
2.2.1. Характеристика пенетратинов 15
2.2.2. Пенетратииы как векторы доставки 21
23. Механизмы проникновения веществ в гэукариотическую клетку 23
2.3.1. Эидоцитоз-опосредованшле пути проникновения веществ в эукаргютическую клетку 23
2.3.2. Фагоцитоз 24
2.3.3. Макропиноцитоз 26
2.3.4. Клатрин-опосредоъанный эпдоцитоз 27
2.3.5. Рафт-опосредоваппый опдоцитоз 30
2.3.6. Клатрин- и кавеолин-иозависимый эндоцитоз 33
2.3.7. Судьбаэидоцитозиыхвезикул 33
2.4, СПОСОЬЫ ДОСТАВКИ ЧУЖЕРОДНЫХ МАКРОМОЛЕКУЛЕ КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 34
2.4.1. Системы доставки па основе вирусных векторов ;...'. 35
2.4.2. Невирусные системы доставки генетических конструкций 37
2.4.3. Катгюнныелипиды .-,; 39
3.4.4- Молекулярные коньюгаты 40
2,4.5. катиоиные пептиды ; 43
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 45
3.1. Материалы и объекты исследований 45
3.2. Формирование комплексов плазмидной ДНК с катионными пептидами 46
3.3. Определение стехиометрии комплексов ДНК с катионными пептидами 46
3.4. Трансфекпия культуры клеток катионными пептидами, их комплексами с плазмидной днк, кальций-фосфатная трансформация , 47
3-5. Определение активности ГЕНои-МАРКЕРОв 48
3.6. Конфокальная флюоресцентная микроскопия 49
3.7. Измерение уровня интерпализации флюоресцентно меченого пептида TAT-F и его комплексов с плазмидной ДНК ,.»-50
3.8. Измерение флюоресценции ДНК с этидиш бромидом 50
3.9. Взаимодействие BSA с флюоресцентно меченым ТАТ-пептидом 51
3.10. Внутривенное введение комплексов ДНК с катиоп'пыми пептидами мышам 51
3.11. Выделение рнк, реакция обратной транскрипции (КТ),полимеразіїая цепная реакция (PCR) 52
3.12. Определение уровня ApoA-ї человека в сыворотке крови мышей 52
ЗЛЗ. Статистическая обработка 52
4. РЕЗУЛЬТАТЫ 54
4.1. Изучение условий комшіЕКСооБРАЗОВЛНия ДНК с лизин-еоглтым пептидом К8 54
4.2. Оценка цитотоксичности комплексов ДНКЛС8 58
4.3 Факторы, влияющие нл эффективность трансфекции клеток HepG2 комплексами ДНКЖ8 61 4.4. Изучение взаимодействия и условий образования комплекса ТЛТ-пелтида с плазмидной ДНК 64
4.5 Механизм проникновения комплекса ДНК/TAT в клетки 68
4.6. РЛСПРЕДСЛЕІ ІИЕ КОМІ ІЛЕКСОВ ДНК/TAT В TKAI ІЯХ МЫШИ ПОСЛЕ ИХ ИНЪКК! іий в хвостовую вену мышей 77
4.7. Влияние сывороточного альбумина на интернализацию комплексов ДНК/TAT и экспрессию гена доставленного в КОМПЛЕКСЕ С НОСИТЕЛЕМ 80
5. ОБСУЖДЕНИЕ 85
6. ВЫВОДЫ 97
7.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 98
Введение к работе
Актуальность работы
Проникновение макромолекул в эукариотические клетки является фундаментальной основой ряда процессов, обеспечивающих поддержание интеїральной целостности организма. Исследование механизмов интернализации макромолекул [слетками имеет принципиальное значение для понимания функционирования многоклеточных организмов в норме и при различных патологиях.
Эндоцитоз представляет собой классический путь интернализации макромолекул. Тем не менее, в последнее время накапливаются данные, свидетельствующие о способности ряда внутриклеточных ядерных белков (активатора транскрипции Tat вируса иммунодефицита человека ] типа, гомеодомеп-содержащего фактора транскрипции Aiitp и др.) переноситься из.клетки в клетку без участия классического эндоцитоза. Механизм транслокации таких белков до сих пор остается мало понятным. По всей видимости, в проникновении этих белков через клеточную мембрану не участвуют какие-либо рецепторные молекулы (Prochiantz Ам 2000; Rubartelli A. el al„ 1998). В ряде работ делешюнным анализом установлено, что за интернализацию отвечают короткие фрагменты белковой молекулы, отличающиеся высоким содержанием положительно заряженных аминокислотных остатков - пенстратины (Wendcr P. ct а!., 2000). Более того, пенстратины, будучи ковалентно-сцепленпыми с белками-репортерами способны обеспечивать эффективную доставку последних в ткани экспериментальных животных (Fawell S. et al., 1994; Schwarze S. R. et al,, 1999). Показана важность остатков аргинина для процесса переноса через клеточные мембраны (Suzuki Т. et aL, 2002).
В последние годы значительное внимание уделяется разработке методов генетической коррекции ряда патологии человека. Применение с этой целью вирусных векторов имеет существенные ограничения» В связи с этим, актуальной является разработка невирусных методов переноса ДНК- Несмотря на более низкую эффективность, невирусные средства лишены ряда недостатков вирусных векторов. Высокая эффективность пенетратинов, в частности фрагмента (47-57) основного домена белка ТАТ вируса HIV-1 (ТЛТ-пептида), в качестве средства доставки ковалентно сцепленных с ними биологически активных макромолекул, а также наличие в их составе большого числа основных аминокислотных остатков позволило рассматривать ТАТ-пептид как перспективное средство переноса ДНК в клетки млекопитающих in vitro и in vivo. В этой связи, принципиальное значение имеют детальные исследования механизма проникновения комплексов ДНК с пепетраіинами в клетки млекопитающих.
Цель и задачи исследования
Целью рабогы является изучение условий формирования комплексов ДНК с катионными пептидами и исследование механизмов проникновения таких комплексов в ютстки млекопитающих. Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
1, Изучить условия образования комплексов катионных олиголептидов, таких как ТАТ и Kg, с плазмидной ДНК.
2. Выяснить возможную роль эндопкюза в поглощении клетками млекопитающих комплексов ДНК с катионными пептидами.
3. Разработать систему переноса ДНК в клетки млекопитающих на основе фрагмента (47-57) основного домеиа транскрипционного фактора ТАТ вируса HIV-1.
4, Апробировать комплексы ДНК/Т AT в качестве средства доставки ДНК в организм млекопитающих и выяснить факторы, препятствующие эффективной экспрессии перенесенных генов при системном введении комплексов. ,
Научная новизна
В результате настоящего исследования впервые показана способность фрагмента (47 57) основного домена белка ТАТ вируса HIV-1 (ТАТ-пептида) электростатически взаимодействовать с плазмидной ДНК, образуя полиэлектролитные комплексы. Такие комплексы способны проникать в культивируемые клетки млекопитающих, обеспечивая эффективную экспрессию перенесенных генов, В ходе работы.показан эндоцитоз-оиосредованный механизм проникновения комплекса ДНК/TAT в клетки, аналогично процессу интернализапии - комплексов плазмидной ДНК с лизин-богатым пептидом Кй и другими поликатионными носителями. Впервые выяснено стимулирующие влияние избытка свободного положительно заряженного пептида в реакционной смеси на эффективность трансфекции клеток в культуре комплексом катион и ый пептид /ДНК,
В то же время показано, что повышение содержания свободного пептида в реакционной среде при системном введении комплексов ДНК/TAT и ДНКЖв in vivo приводит к снижению экспрессии доставляемого гена. Полученные данные свидетельствуют, что низкий уровень экспрессии чужеродного гена в случае внутривенной доставки комплексов ДНК/Т AT объясняется их инактивацией в кровеносном русле животного в результате взаимодействия с сывороточным альбумином.
Практическая значимость
Практическая значимость работы заключается в разработке в ходе проведенного исследования системы переноса генов в культивируемые клетки млекопитающих на основе ТАТ-пептида. Изучение механизмов проникновения комплексов ДНК/пептид, а так же влияния свободного пептида на эффективность доставки таких комплексов представляет определенную ценность для понимания механизмов переноса макромолекул через цитоплазматическую мембрану. Выяснение причин, препятствующих эффективной работе векторов экспрессии доставляемых с помощью катионных пептидов в организм животных позволяет вести работу по усовершенствованию средств доставки генетических конструкций. Результаты настоящего исследования могут быть использованы при разработке и реализации проектов, направленных на создание невирусных методов переноса ДНК в организм млекопитающих и человека.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Фрагмент основного домена транскрипционного фактора ТАТ (47-57) вируса HIV-1 электростатически взаимодействует с плазмидной ДНК с образованием полиэлектролитных комплексов ДНК/TAT, которые способны проникать в клетки млекопитающих и обеспечивать эффективную экспрессию перенесенных генов.
2. Комплексы плазмидной ДНК с катионными пептидами ТАТ и FCg проникают в клетки млекопитающих путем эидоцитоза.
3. Низкая активность комплексов ДНК/TAT при системном введении мыщам обусловлена, в частности, взаимодействием комплексов с сывороточным альбумином, что приводит к изменению путей интернализации комплексов.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано две статьи и 9 тезисов докладов и сообщений на всероссийских и международных конференциях, симпозиумах и съездах. Результаты работы докладывались па международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 2000, 2002 гг.), между народ ной конференции «Human Genome Meeting» (Шанхай, 2002), третьем Съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002 г,), 39-м Съезде Федерации европейских биохимических обществ «FEBS special meeting on signal transduction» (Брюссель, 2003 г.), 5-й международной конференции по биофизике «1СВР-2004» (Стокгольм, 2004 г,) и других конференциях.
Структури и объем диссертации
Диссертация сосюитт введении, обзора литературы, материалов и методов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на ... страницах, содержит ... рисунка и ... таблиц. Список литературы содержим ... источника.
