Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Культура растений in vitro - продуцент физиологически активных веществ
1.1. Вторичный метаболизм клеточных культур растений семейства Ranunculaceae in vitro 10
1.2. Тритерпеновые гликозиды 13
1.3. Суспензионные культуры растений - продуценты биологически активных веществ 18
1.4. Влияние экзогенных гормонов и ростстимулирующих веществ на рост и накопление биологически активных веществ in vitro
1.4.1. Жасмоновая кислота .20
1.4.2. Брассиностероиды 23
1.4.3. Гуми новые кислоты и препарат «С ил к» 26
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Ботаническая характеристика княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) 28
2.2. Фармакологическое описание Atragene speciosa Weinm 30
2.3. Культивирование клеточных культур и оптимизация режима выращивания 32
2.4. Исследования вторичных метаболитов 37
2.4.1. Сапонины 38
2.4.2. Флавоноиды 40
2.5. Фотосинтетические пигменты каллусной культуры Atragene speciosa Weinm 41
2.6. Морфометрические исследования клеточной культуры Atragene speciosa Weinm 43
Глава 3. Ростовая активность каллусной и суспензинной культур Atragene speciosa Weinm .
3.1 Динамика роста каллусной культуры Atragene speciosa Weinm. и оптимизация условий культивирования 45
3.2 Введение в суспензионную культуру Atragene speciosa Weinm. и его рост на модифицированных питательных средах 69
Глава 4. Влияние физиологически активных веществ на рост клеточных культур Atragene speciosa Weinm .
4.1. Жасмоновая кислота 80
4.2. 24 - Эпибрассинолид 90
4.3. Гуминовые кислоты и препарат «Силк» 97
Глава 5. Физиологически активные вещества каллусной и суспензионной культур Atragene speciosa Weinm .
5.1. Тритерпеновые гликозиды 104
5.2. Флавоноиды 117
Заключение 119
В ывод ы 121
Список используемой литературы 122
- Тритерпеновые гликозиды
- Брассиностероиды
- Исследования вторичных метаболитов
- Введение в суспензионную культуру Atragene speciosa Weinm. и его рост на модифицированных питательных средах
Введение к работе
Актуальность проблемы. Более 25% всех применяемых в медицине препаратов содержат соединения растительного происхождения. Это различные вторичные соединения: алкалоиды, стероиды, тритерпеновые гликозиды и другие. Однако, природные источники лекарственного сырья имеют ограниченные ареалы, либо запасы их быстро оскудевают вследствие антропогенного воздействия.
Поэтому возможный путь получения ценного и дефицитного сырья для медицинской промышленности - это метод культуры тканей и клеток лекарственных растений. Так, успешно культивируются в качестве источников алкалоидов - Atropa belladonna L., Symphytum officinale, Aconitum sp.; алкалоидов и сапонинов - Nigella sp.; витамина E - Carthamus tinctorius L.; эфирных масел - Lavandula sp. и многие другие растения (Shoyama Y. et al., 1991; Schmaauder H.-P. et al., 1991). Известно о способности генетически трансформированных культур «бородатых корней» (hairy root) к биосинтезу вторичных соединений (Yamamoto Н. et al., 1986, 1991; Кузовкина И.Н., 1992). Например, в трансформированных корнях шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi.) обнаружены флавоноиды: байкалин и байкалеин (Гусева А.В. и др., 1999).
Технология in vitro позволяет увеличить выход биологически активных веществ (БАВ) и регулировать их накопление в культуре, получая экологически чистые продукты. Данный метод имеет ряд преимуществ перед использованием интактного растения. Он позволяет получать сырьё независимо от климатических условий, трудностей сбора сырья, даёт возможность поддерживать рост растений круглый год, что важно для имеющих в цикле своего развития периоды покоя.
На основе изучения биосинтетических процессов можно получить наиболее богатые тканевые клоны биологически действующих веществ, а также заменить интактные растения, природный ареал которых недостаточен для использования в практических целях.
К таким растениям относится княжик сибирский - Atragene speciosa Weinm. (A. sibirica L.), семейство Лютиковые (Ranunculaceae). Княжик сибирский - это ценное лекарственное растение, показано анксиолитическое, антистрессовое, противоневротическое, проти воишемическое и антиоксидантное действие экстрактов из травы княжика. Основными группами веществ, ответственными за фармакологическую активность являются тритерпеновые гликозиды (сапонины), высокополярные О-гликозиды органических кислот и производные фенилэтанола. Однако, Atragene speciosa Weinm. - вид с азиатским ареалом, природные заросли которого разрежены и занимают небольшие площади. Поэтому, введение Atragene speciosa Weinm. в асептическую культуру in vitro позволяет, во-первых, сохранить и поддерживать данный вид, во-вторых, получать в стабильных условиях культивирования стандартную биомассу. В Томском государственном университете на кафедре физиологии растений и биотехнологии впервые получена каллусная культура этого вида in vitro (Карначук Р.А. и др., 1997). Но для промышленного использования имеет интерес введение княжика сибирского в условия стерильной суспензионной культуры, разработка способов ее поддержания и определение условий получения продуктивной биомассы клеток. Кроме того, особое внимание должно быть уделено продуктам вторичного метаболизма, в качестве источников физиологически активных веществ, а также способам регулирования их синтеза в суспензии.
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы было получение суспензионной культуры клеток княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.), оптимизация режимов культивирования каллусной и суспензионной культур, и исследование влияния условий выращивания на накопление биологически активных веществ. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
1) получить суспензионную культуру клеток княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) и подобрать оптимальный состав питательной среды и режим культивирования;
2) изучить динамику роста клеточных (каллусной и суспензионной) культур Atragene speciosa Weinm. на модифицированных нами питательных средах в темноте и на свету;
3) исследовать влияние экзогенных гормонов и ростстимулирующих веществ (жасмоновая кислота, 24-эпибрассинолид, гуминовые кислоты и препарат «Силк») на ростовую активность клеточных культур (каллусной и суспензионной) Atragene speciosa Weinm.;
4) изучить динамику накопления физиологически активных веществ (тритерпеновые гликозиды, флавоноиды) в клеточных культурах Atragene speciosa Weinm.
5) исследовать влияние экзогенных гормонов и ростстимулирующих веществ (жасмоновая кислота, 24-эпибрассинолид, гуминовые кислоты и препарат «Силк») на накопление физиологически активных веществ (тритерпеновые гликозиды, флавоноиды) в клеточных культурах Atragene speciosa Weinm.
Научная новизна. Впервые нами получена суспензионная культура клеток княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) и оптимизированы условия ее культивирования. Показана способность клеточной культуры к активному росту, высокой продуктивности и возможности синтеза тритерпеновых гликозидов (сапонинов), состав которых соответствует таковому в интактном растении. Получен новый штамм каллусной культуры, у которого изучены продукционная способность и динамика накопления сапонинов и флавоноидов. Впервые исследовано влияние ряда физиологически активных веществ: жасмоновой кислоты, 24-эпибрассинолида, гуминовых кислот и препарата «Силк» на рост и накопление тритерпеновых гликозидов и флавоноидов клеточными культурами (каллусной и суспензионной) княжика сибирского.
Изучены динамика роста и морфометрические характеристики клеточных культур (каллусной и суспензионной) княжика сибирского при культивировании на модифицированных нами питательных средах, Проведена оценка содержания фотосинтетических пигментов каллусной культуры княжика сибирского при выращивании на свету и в темноте.
Практическая значимость. Полученная нами суспензионная культура княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) может служить основой для коммерческого производства физиологически активных веществ и создания на их основе препарата ноотропного действия.
Результаты исследований используются при чтении курсов «Биотехнология», «Клеточная культура растительных тканей» для студентов -биологов Томского государственного университета.
Положения, выносимые на защиту.
1. Впервые получена суспензионная культура княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) путем введения каллус ных клеток на модифицированную питательную среду.
2. Показано, что клеточная культура княжика сибирского является продуцентом тритерпеновых сапонинов и флавоноидов.
3. Физиологически активные соединения (жасмоновая кислота, 24-эпибрассинолид, гуминовые кислоты и препарат «Силк») и свет (белый и красный) активно влияют на рост каллусной и суспензионной культур Atragene speciosa Weinm. и накопление высокополярных тритерпеновых гликозидов, суммы флавоноидов in vitrot ассортимент которых увеличивается при длительности культивирования. Обнаруженные соединения соответствуют таковым интактного растения. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском совещании «Физиология и биотехнология растений», посвященном 120-летию Томского государственного университета (Томск, 1998); IV съезде Общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - наука III тысячелетия» (Москва, 1999); Городской конференции молодых учёных и специалистов «Региональные проблемы экологии и природопользования» (Томск, 1999); Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000); IV Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва, 2001); Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001); LX Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2002); I, II и III Московских Международных Конгрессах «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005); VI Общероссийской межвузовской конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Наука и образование» (Томск, 2002); VIII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003); V съезде Общества физиологов растений России и международной конференции «Физиология растений -основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003); II Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии» (Караганда, 2003).
Публикации по теме диссертации. По теме диссертации было опубликовано 19 печатных работ, из них - 2 в реферируемых изданиях.
Работа выполнена на кафедре физиологии растений и биотехнологии биолого-почвенного факультета Томского государственного университета.
Тритерпеновые гликозиды
Тритерпеновые гликозиды как вещества экзогенного происхождения проявляют физиологическую активность в отношении теплокровных животных: влияют на обмен веществ, функциональное состояние органов и организма в целом. Тритерпеновые гликозиды состоят из агликона (гении) тритерпеновой природы и углеводной части. По структуре сапогенина (агликона) сапонины разделяют на две группы: стероидные и тритерпеновые гликозиды (Гринкевич Н.И., 1983; Максютина Н.П., 1985) (рис. 1).
Почти все тритерпеновые гликозиды растительного происхождения можно подразделить на четыре группы: производные а - амирина, В - амирина, лупеола и дамарана. Широко распространены в природе производные р -амирина, присутствующие и в Atragene speciosa Weinm., например, олеаноловая кислота - агликон сапонинов, выделенных из многих лекарственных растений. У р - амирина в случае наличия одного гидроксила, последний находится у С-3. Карбоксильная группа чаще находится у С-28 (олеаноловая кислота) (рис. 2). В сахарных компонентах могут находиться от I до 10 различных моносахаридов. Присоединение сахарных компонентов может быть в одном или нескольких местах: в положении 3 или 23 у сапонинов аралии. Раздвоение цепи происходит у моносахарида, связанного с агликоном. В состав углеводной части молекулы сапонина входят моносахариды: D -глюкоза, D - галактоза, D -ксилоза, D - глюкуроновая, D - галактуроновая кислоты, L - рамноза.
С увеличением количества моносахаридов повышается растворимость сапонинов в воде. Сапонины с 1 - 4 - моносахаридными остатками в воде растворяются плохо. Сапонины - вещества, обладающие сильной поверхностной (что связано с наличием в одной молекуле гидрофильного и гидрофобного остатков) и оптической активностью (Дасон Р. и др., 1991).Широкий спектр биологического действия сапонинов является причиной растущего интереса к ним как к потенциальным лекарственным средствам. По-видимому, сапонины играют значительную роль и в повышении растворимости многих биологически активных растительных веществ, способствуя этим их распределению в жидкостях организма и лучшему всасыванию.Эмульгирующие свойства сапонинов используются для стабилизации разных лекарственных форм и в других целях (Сафронич А.Н., 1987).
Тритерпеновые гликозиды широко распространены в растениях. Они используются организмами для борьбы за существование и поддержания равновесия при антагонистических взаимоотношениях биологических систем и служат факторами невосприимчивости растений к грибковым заболеваниям. В результате многочисленных исследований отечественных и зарубежных учёных можно считать, что наличие тритерпеновых гликозидов в отдельных семействах растений может служить хемотаксономическим признаком. Наиболее богаты этими веществами следующие семейства: гвоздичные Cariophylaceae, лютиковые Ranunculaceae, бобовые Fabaceae, араливые Araliaceae, сложноцветные Asteraceae, сапиндовые Sapindaceae и другие. Показано, что тритерпеновые гликозиды локализуются в жизненно важных органах и тканях. В больших количествах они обнаружены в листьях, цветках, семенах, плодах, корнях, корневищах и стеблях (Черникова З.В., 1949; Запрометов М.Н., 1993).
Тритерпеновые гликозиды и родственные им соединения в больших количествах обнаруживаются в тех органах и тканях, которые интенсивно функционируют или содержат большое количество интенсивно делящихся клеток: хлоропласты, меристематические участки, семена растений и яйцеклетки голотурий. В зависимости от состояния организма содержание и скорость биосинтеза гликозидов изменяются в достаточно больших пределах, что указывает на их активную роль в растениях и, следовательно, они не являются балластными веществами. Можно предположить, что они включаются в метаболизм в процессе роста и развития организма, выполняя не изученные до настоящего времени регуляторные функции.
На биосинтез тритерпеновых гликозидов в растениях большое влияние оказывает интенсивность света, при этом обнаруживается прямая зависимость между интенсивностью фотосинтеза и скоростью синтеза тритерпеноидов (Сафронич А.Н., Сироткина Е.Е., 1987).Сапонины играют роль в жизнедеятельности растений: подавляют развитие некоторых организмов (особенно грибов), защищая при этом растения от различных заболеваний. Определённые концентрации сапонинов ускоряют прорастание семян, рост и развитие растений, а концентрированные растворы, наоборот, тормозят эти процессы (Максютина Н.П., 1985).
Культуры тканей лекарственных растений, в частности продуцирующие гликозиды, тщательно изучаются, как перспективный способ получения лекарственного сырья. В том числе, были получены культуры тканей лекарственных растений, содержащие гликозиды: кендыря коноплевого (Apocinum cannabinum), наперстянки шерстистой (Digitalis lanata Ehrh.), наперстянки пурпурной (Digitalis purpurea), лимона (Citrus limon Burn.), ландыша майского {Convallaria majalis L.), женьшеня {Panax ginseng C.A. Meg.), диоскореи дельтовидной {Dioscorea deltoidea L.), ортосифона тычиночного (Orthosiphon stamineus Benth.), гоькуши Фролова (Saussurect frolovii Ledeb.) (Смирнов A.M., 1970; Каранова Л.С., 1977; Чайко А.Л. и др., 1999; Смирнов А.В и др., 2000; Старцева Д.М., Дорофеев В.Ю., 2002; Старцева Д.М., Дорофеев В.Ю., 2003; Дорофеев В.Ю. и др., 2003). Литературные данные говорят о том, что для каллусных тканей, продуцирующих гликозиды, характерно сохранение свойства органа, от которого получена ткань, к накоплению в ней продуктов биосинтеза, свойственных интактному растению. Примером является каллусная ткань женьшеня, или каллусные культуры могут синтезировать какие-либо иные соединения (Бутенко Р.Г., 1967J. В культуре ткани Digitalis lanata и Digitalis purpurea синтезировались совершенно другие вещества, а не те, которые содержались в интактном растении. Показано, что сумма гликозидов Digitalis merthonensis, выделенная из культуры ткани, гораздо активнее гликозидов подземных частей (York W.S. et al.» 1986). Кроме того, большую роль в биосинтезе действующих веществ играет состав питательной среды. Это объясняется тем, что клетки в культуре ткани находятся в принципиально иных условиях, чем в целом растении. Известно, что ионы калия и серебра, внесённые в питательную среду, усиливают выход сердечных гликозидов в культуре ткани ландыша майского (Convallaria majalis L.). Некоторые тритерпеновые сапонины обладают гормоноподобным действием. Например, сапонины солодки и других растений обладают экстрогенной активностью. Сапонины элеутерококка (элеутерозиды) обладают стимулирующим действием, способствуют повышению сопротивляемости организма неблагоприятным воздействиям. Тетрациклические тритерпеновые сапонины женьшеня (панаксозиды) обуславливают его адаптогенное действие (Бутенко Р.Г., 1999).
Брассиностероиды
В последние годы среди синтетических регуляторов роста все большее внимание уделяется брассиностероидам (БС) - новому классу фитогормонов с широким спектром биологической активности. Это группа полигидроксильных стероидов. Все БС относятся к а-хлорэтан производным и могутклассифицироваться как С-27; С-28. БС были выделены из пыльцы, семян, галлов, фруктов, побегов. Известно несколько десятков БС, выделенных из покрытосеменных, голосеменных и из других растений. Наиболее изучен брассинолид (рис. 4). Физиологические эффекты данного гормона разнообразны. Брассиностероиды взаимодействует с другими гормонами, такими как ауксины и гиббереллины (Khnpach V.A. et al., 1999). БС активны в различных биотестах специфичных для других гормонов. Некоторые тесты показывают, что БС и гиббереллины независимы друг от друга, но могут проявлять синергический или аддитивный эффект.
Существует сравнительно немного данных по исследованию действия БС на культуры тканей растений, причем эффекты, как правило, противоречивы (Ikekawa N„ Zhao Y.L, 1991; Verpoorte R.s 1996; Roddick I.G. et al., 1993). Это в свою очередь может быть связано с тем, что в клетках in vitro и в целом растении процесс метаболизма существенно различается, что обусловлено спецификой культуры клеток как искусственной биологической системы (Зубарев А.В., 2000). В работе О.А. Кудряшовой с соавторами (2003 г.) исследовалось действие эпибрассинолида (ЭП) на каллусообразование. Для этого в качестве исходного материала использовались листья среднего яруса табака (Nicotiana tabacum cv. Samsun), находящегося на 9- 12-л исто вой стадии (возраст растения 56-58 дней). Изучалось влияние ЭП и гомобрассинолида (ГБ) в разных концентрациях (10"7 -10"9 М) на образование, рост и развитие каллуса Nicotiana tabacum., при этом в среду добавляли либо ЭБ, либо ГБ в соответствующей концентрации. Как для ЭБ, так и для ГБ были отмечены похожие тенденции в ростовой активности культуры в зависимости от концентрации. Рост каллуса быстрее индуцировался на среде с ЭБ или ГБ в концентрации 10"9М. Дальнейшее развитие каллуса в этих вариантах опыта происходило более интенсивно, чем при культивировании эксплантов на среде с концентрацией ЭБ или ГБ 10" М. На 21-ый день после начала культивирования средняя масса экспланта составляла 0,08 и 0,06 г соответственно. На пятой неделе культивирования масса и ростовой индекс эксплантов на средах с ЭБ или ГБ в 10"9 М на 643 и 535% превышали соответствующие показатели эксплантов на средах с концентрацией брассинолидов 10" М. Через 7 недель эти различия уменьшались до 385 для ГБ и 120% для ЭБ. Для всех концентраций ЭБ и ГБ (10" - 10" М), показатели сырой и сухой массы, ростового индекса были значительно меньше, чем в контроле. Исследуемые брассинолиды оказывали ингибирующий эффект на процесс формирования биомассы каллусов табака в широком диапазоне концентраций. Наибольший ингибирующий эффект наблюдался для концентрации брассинолидов 10 7 М, а наименьший - в концентрации 10"9М. Это противоречит точке зрения Gaudinova с соавторами, что физиологический ответ растительной клетки на действие брассинолидов происходит по принципу «всё или ничего». Степень ингибирования зависит от структурных особенностей брассинолида (Кудряшова О.А. и др., 2003). Использование нетрадиционных стимуляторов роста растений находит применение при выращивании клеточных культур in vitro (Комисарова И.Д., Грехова И.В., 2003). Применяют гуминовые кислоты (ГК) для стимуляции каллусообразования у рапса (Brassica napus L.) и регенерации побегов и корней у люцерны (Medicago varia Mart.). Изолированная ткань рапса в контрольном варианте приступала к недифференцированному росту в течение первой недели культивирования. Каллус жёлтого цвета зернистой структуры и плотной консистенции формировался вдоль надрезов и постепенно покрывал всю площадь экспланта. На среде МС с ГК 1 и 10 мг/л каллусная ткань отсутствовала, экспланты обесцвечивались и погибали. Результаты опыта говорят о том, что стимулирующее влияние ГК на рост каллусных тканей проявляется только в присутствии ауксина, но сами по себе ГК не являются индуктором каллусообразования. Полученные каллусные ткани были пассированы на среде для регенерации. За шесть недель культивирования частота регенерации побегов в варианте с 1 мг/л ГК на фоне БАП (16,1%) почти вдвое превысила уровень контроля (8,7%), а в варианте без БАП с 10 мг/л ГК -более чем вдвое (20%). В варианте без БАП с 1 мг/л ГК регенерация имела место с небольшой частотой (2,2%). Авторы предположили, что в отношении процесса регенерации стимулирующее влияние ГК функционально подобно действию цитокининов, при более высокой эффективной концентрации. При микроразмножении люцерны добавление в среду 10 мг/л ГК вызывало увеличение размеров побегов и ускорение образования корней. Через три недели большинство побегов на средах со стимуляторами были готовы к высадке почву, тогда как в контрольном варианте побеги достигли такого развития на неделю позже. Стимуляторы достоверно увеличивали длину корней и количество листьев на побегах (Рожанская О.А. и др., неопубликованные данные 2003).
Исследования вторичных метаболитов
Для обнаружения вторичных метаболитов была использована клеточная культура (каллусная и суспензионная) княжика сибирского, выращенная в условиях освещения и темноты, в присутствии в питательной среде регуляторов роста (жасмоновой кислоты, 24-эпибрассинолида, гуми новых кислот и препарата «Силк»). С этой целью брали сухую массу клеток, полученную при высушивании в термостате (50 - 60С). Предварительно сырую массу клеток отмывали дистиллированной водой от остатков питательной среды.
Навеску сырья (1,0 г) экстрагировали метанолом при температуре 60 -65С на водяной бане с обратным холодильником в течение часа. Затем отгоняли растворитель под вакуумом при температуре 40-60С.Для определения влажности 3 - 5 г (с погрешностью не более 0,1 г) сырья, измельчённого до размера частиц около 10 мм, помещали в предварительно высушенный и взвешенный бюкс. Бюкс с навеской (вместе со снятой крышкой) ставили в нагретый до 100 - 105С сушильный шкаф. При этом температура в шкафу падает. Время, в течение которого сырьё должно сушиться, отсчитывается с момента, когда температура в шкафу вновь достигнет 100 -105С.Первое взвешивание проводили через 2-3 часа. Сырьё высушивали до постоянной массы. Постоянная масса считается достигнутой, если разница между двумя взвешиваниями после 30 мин высушивания и 30 мин охлаждения в эксикаторе не превышает 0,01 г.
Определение влаги сырья для пересчёта содержания действующих веществ в абсолютно сухом сырье проводили в навесках 1 - 2 г (точная навеска), взятых из аналитических проб, предназначенных для определения содержания золы и действующих веществ, но при разнице между двумя взвешиваниями, не превышающей 0,0005 г. Сапонины в растительном сырье определяют методом ТСХ. Для разделения нейтральных сапонинов пользуются в основном водноспиртовыми системами, например, хлороформ - метанол - вода (65:35:10). Соотношение растворителей можно изменять в зависимости от полярности разделяемых веществ; для слабо полярных сапонинов воду в смесь не добавляют, причём органические растворители берут в соотношении 8:2. Удобной, менее полярной смесью является система этилацетат-четырёххлористый углерод. Кислые сапонины делят в смесях, содержащих бутанол, например, н-бутанол - этанол -25% раствор аммиака (7:2:5). Получены хорошие результаты при БХ нейтральных гликозидов в системе растворителей хлороформ - пиридин -тетрагидрофуран (10:10:2). Эту систему можно использовать и при ТСХ. Для БХ нейтральных гликозидов подходящими оказались также системы: бутанол-1 - этанол - вода (10:2:5) и бутанол-1 - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:5). Напротив, кислые гликозиды можно хроматографировать в системах растворителей, имеющих значение рН 7; например, в системе бутанол-1 -этанол - 15% раствор аммиака (18:3,5:18). Таким образом, для нейтральных сапонинов наиболее подходящие системы: н-бутиловый спирт - этиловый спирт - вода; н-бутиловый спирт - уксусная кислота - вода (в различных соотношениях верхний слой); хлороформ - метиловый спирт - вода (65:35:10). В отличие от других классов природных соединений (аминокислот, углеводов и т. п.) для сапонинов нет универсальных систем элюирования (Сафронич А.Н., Сироткина Е.Е., 1987).
Для обнаружения тритерпенових гликозидов на хроматограммах используют сильнокислые реагенты, насыщенный хлороформный раствор пятихлористой и трёххлористой сурьмы, 25% спиртовой раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты, серную кислоту и другие. Последняя реагирует, главным образом с сапогениновой частью. Однако, чем больше сахарная цепь, тем меньше относительная доля генина и, следовательно, чувствительность реакции, Среди перечисленных реактивов предпочтение отдаётся раствору фосфорно-вольфрамовой кислоты, так как при этом получается более отчётливое окрашивание пятен, сохраняющееся продолжительное время.Для ТСХ нейтральных гликозидов рекомендуется использовать систему хлороформ - метанол - вода (65:35:10). Хорошие результаты были достигнуты при использовании смеси бутанол-1 - метанол (1:1), насыщенной 2 н. раствором аммиака. Пластинки при этом предварительно опрыскивали неподвижной фазой системы растворителя. Р. Чеше и Г. Вульфф считают возможным ТСХ кислых гликозидов в системе хлороформ - метанол - вода провести после этерификации карбоксильных групп (МаксютинаН.П., 1985).
Таким образом, при исследовании сырья на наличие тритерпеновых гликозидов наиболее достоверные результаты дают хроматографические методы, которыми в основном пользуются в последнее время для обнаружения и идентификации тритерпеновых сапонинов. Для анализа широко используют как бумажную (БХ), так и тонкослойную хроматографию (ТСХ) (Мотл О., Новотный Л., 1982). Эта методика была использована и при работе с культурой клеток княжика сибирского.Количественное определение суммы флавоноидов в экстракте (извлечении 70% спиртом) производится спектрофотометрически при определённой длине волны с использованием в качестве стандарта рутина. Наряду с общей суммой флавоноидов определяется и содержание флавоноидных гликозидов после отделения агликонов при экстракции этиловым эфиром. Необходимость в определении гликозидов обусловлена возможностью их гидролиза при сушке и хранении сырья.
Спектрофотометрическое определение суммарного содержания флавоноидов в лекарственном сырье проводили в присутствии комплексообразователя АІСЬ в виде 2% спиртового раствора при длине волны 415 нм (Минаева В.ҐЛ, 1991). Замечено, что эта область спектра достаточно удалена от максимумов поглощения сопутствующих фенольных соединений. Сапонины, полисахариды, органические кислоты, эфирные масла и соединения других классов, содержащиеся в исходном растворе, не реагируют с хлоридом алюминия (III).300 мг измельчённого (величина частиц не более 2 мм) сухого сырья, заливали и исчерпывающе экстрагировали 50% этанолом на водяной бане (2 часа при температуре 60С, затем 30 мин при температуре воды в бане 80С и 5 мин на кипящей бане). Тёплый экстракт фильтровали в мерные колбы на 25 мл, и после охлаждения до комнатной температуры доводили объём до метки 50% этанолом.Для определения суммарного содержания флавоноидов использовали
Введение в суспензионную культуру Atragene speciosa Weinm. и его рост на модифицированных питательных средах
Переход к периодическому культивированию (суспензионным культурам) в первую очередь был вызван тем, что при таком режиме культивирования, как правило, происходит интенсификация ростовых процессов, а в ряде случаев увеличивается биосинтетический потенциал культур. Суспензионные культуры сохраняют ряд свойств, характерных для исходного организма. И одним из таких свойств является способность к синтезу вторичных метаболитов (Simmonds D. et al., 1983; Seo W.T. et al., 1993). Быстрое получение биомассы растительных клеток суспензионных культур позволяет использовать крупномасштабное промышленное оборудование (ферментеры) для культивирования (Svatos А., Масек Т., 1994). Материалом для исследования являлась культура клеток княжика сибирского, полученная на кафедре физиологии растений и биотехнологии
Томского госуниверситета при использовании в качестве экспланта сегментов черешков молодых листьев интактных растений из республики Хакасия (Ширинский район) в 2003 году (штамм 2Д) (Карначук Р.А. и др., 2003). Каллусную культуру выращивали на агаризованной среде Мурасиге и Скуга (МС) с добавлением витаминов: тиамин-НС! 0,5 мг/л, пиридоксин-НС1 0,5 мг/л, никотиновая кислота-НС1 0,5 мг/л; 100 мг/л мезоинозита; 30 г/л сахарозы; 8 г/л агара: рН среды 5,8. Для оптимизации роста добавляли фитогормоны разных концентраций (2,4-Д, НУ К и БАП). При культивировании каллусной культуры использовали сосуды ёмкостью 50 и 250 мл, с содержанием среды 15-20 мл. После ряда пересадок на данную среду каллус становился более рыхлым. Суспензионную культуру получали путём переноса кусочков рыхлого каллуса в перемешиваемую жидкую среду того же состава, что и среда, на которой выращивался каллус. Переносили относительно крупные кусочки, поскольку это обеспечивало достаточно большое число отдельных клеток и маленьких кусочков каллуса в среде, необходимых для последующего роста. При первом переносе на свежую питательную среду, удаляли крупные кусочки исходного каллуса и крупные агрегаты клеток, пропуская материал через пипетку с соответствующим отверстием. Было обнаружено, что суспензия лучше образовывалась из рыхлого каллуса, полученного на средах с 2,4-Д (0,6 мг/л).
Поскольку суспензионная культура клеток этого вида получена впервые, начальным этапом работы было оптимизация условий выращивания, изучение её цитологических и физиологических характеристик, в частности размера клеток, агрегированное, скорости роста суспензии, оптимального времени субкультивирования. Культуру клеток, выращенную на среде с 2,4-Д, имеющую рыхлую структуру и достаточно высокую интенсивность роста по сухой биомассе, использовали для получения суспензии клеток. При переносе каллуса на жидкую питательную среду в колбы сначала образовывалась крупноагрегированная суспензия, а диаметр некоторых глобул достигал 5 мм и более. При последующем субкультивировании в колбах суспензия отбиралась по типу мелкой агрегированности. Микросокпирование показало, что для клеток характерно содержание крупных вакуолей. В основном размер таких вакуолизированньгх клеток был в пределах 40-70 мкм (78%), но встречались и более крупные клетки размером до 100-130 мкм (10%). Для каждой линии культуры клеток существует минимальный размер инокулюма (числа пересеваемых клеток), при меньшем размере которого культура не растёт (Singh B.D. et al., 1974; Pech J.C. et al.s 1975). Поэтому важно определить: а) плотность активно растущей суспензии; б) соотношение объёмов суспензии и свежей среды; в) времени инкубации (Phillips R., Doods J.H., 1977; Svatos А., MacekT.,1994). При втором субкультивировании в жидкой среде МС была получена культура с удовлетворительными ростовыми характеристиками. Соотношение инокулюм : среда было равно 1:10, 1:5, 1:2, возраст инокулюма 25-30 суток. Деление суспензионных клеток поддерживалось при наличии ауксинов и цитокининов, то есть тех гормонов, которые необходимы для индукции и роста как каллусных клеток, так и клеток в суспензии (Карначук Р.А., Дорофеев В.Ю., 2003). Поэтому проведено изучение влияния различных концентраций 2,4-Д и НУК на рост суспензионной культуры при одновременном присутствии в среде цитокинина (БАП) по схеме (табл. 12).
