Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Гистофизиология супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса некоторых млекопитающих животных и человека 11
1.2. Клиническая морфология алкогольной болезни 20
1.3. Патоморфология гипоталамических структур при хронической алкогольной интоксикации 29
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 .Общая характеристика материала исследования 34
2.2.Методы исследования
2.2.1 . Иммуногистохимические методы 37
2.2.2. Методы морфометрического исследования и статистической обработки 40
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1 .Клинико-морфологический анализ алкогольной энцефалопатии в структуре летальности и патоморфология крупноклеточных ядер гипоталамуса 43
3.2. Морфометрические и иммуногистохимические изменения супраоптического ядра гипоталамуса человека при алкогольной болезни 50
3.3. Морфометрические и иммуногистохимические изменения паравентрикулярного ялра гипоталамуса человека при алкогольной болезни 64
3.4. Морфологические изменения гипофиза при алкогольной болезни 78
3.5. Экспериментальное исследование супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса при хронической алкогольной интоксикации
3.5.1. Морфометрические и иммуногистохимические изменения супраоптического, паравентрикулярного ядер гипоталамуса и задней доли гипофиза крыс при хронической алкогольной интоксикации 86
3.5.2. Морфометрические и иммуногистохимические изменения супраоптического, паравентрикулярного ядер гипоталамуса и задней доли гипофиза крыс при алкогольной и водной депривации 105
Заключение 136
Выводы 142
Указатель литературы 144
- Клиническая морфология алкогольной болезни
- Иммуногистохимические методы
- Морфометрические и иммуногистохимические изменения супраоптического ядра гипоталамуса человека при алкогольной болезни
- Морфометрические и иммуногистохимические изменения супраоптического, паравентрикулярного ядер гипоталамуса и задней доли гипофиза крыс при хронической алкогольной интоксикации
Введение к работе
Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), связанные с употреблением алкоголя заболевания поражают 5-10% мирового населения ежегодно и являются причиной около 2 млн. летальных исходов, что составляет 5% от общего числа смертей (Огурцов П.П. с соавт., 1998). По многим критериям злоупотребление алкоголем уже достигло уровня, при котором происходит нарушение самих основ существования общества. Показатель потребления алкоголя за один год в расчете на душу населения увеличился за минувшее столетие в 3,8 раза и составляет в настоящее время 13 литров абсолютного алкоголя, что в 1,6 раза выше уровня, который ВОЗ считает особо опасным для здоровья, при этом только за 90-е годы XX века он увеличился на одну четверть (Заиграев Г.Г., 2002).
Судить же об истинной распространенности алкогольной патологии в России по данным официальной статистики крайне сложно, поскольку особенности учета алкогольной болезни во врачебном свидетельстве о смерти и возможные социальные и материальные санкции против родственников умершего неизбежно приводят к гиподиагностике данной патологии. Несмотря на то, что по некоторым данным в органах статистического учета наблюдается десятикратное занижение частоты алкогольной патологии в структуре смертности и летальности в сравнении с данными патологоанато-мических исследований, различные клинико-морфологические формы алкогольной болезни, являющиеся первоначальной причиной смерти, составляют 9% от общего числа аутопсий, приближаясь к смертности от новообразований (Зайратьянц О.В., 2002).
При этом необходимо отметить, что доля летальных исходов, связанных со злоупотреблением алкоголем, ежегодно неуклонно растет (Моисеев B.C. с соавт., 1998), и свыше 60% умерших составляют лица из наиболее трудоспособной возрастной группы 35-54 лет, независимо от их социальной принадлежности (Зайратьянц О.В., 2002).
Несмотря на достаточную изученность основных механизмов пато- и морфогенеза алкогольных поражений внутренних органов, имеется целый ряд нерешенных вопросов. Если морфологические изменения таких органов-мишеней для алкоголя, как печень, поджелудочная железа и сердце в достаточной степени изучены (Хохрина Н.Т., 1983; Пауков B.C., Угрюмов А.И., 1985; Серов В.В., Лебедев СП., 1985; Пуков B.C., 1994; Меденцов А.А. с со-авт., 2001), то природа и специфичные для действия алкоголя изменения мозговых структур известны далеко не полностью. Особенно это относится к гипоталамусу с учетом его нейросекреторной функции.
Также многочисленны исследования механизмов развития алкогольной зависимости (являющейся лишь формой или стадией алкогольной болезни), патогенеза острой алкогольной интоксикации (Rivier С, 1993; Rivest S., Rivier С, 1994; Rivier С, 1995; Inder W.J. et al., 1995; Harding A.J. et al., 1996; Rivier C, 1996; Ogilvie K. et al., 1997; Kinoshita H. et al., 2001; Lee S. et al., 2001; Rivier C, 1999; Lee S. et al., 2000; Laszlo F.A. et al., 2001). Однако до сих пор не определены пределы возможной обратимости изменений органов при хронической алкогольной интоксикации, что имеет безусловное значение для разработки методов их коррекции и прогноза заболевания.
Кроме того, практически все выполненные в данном направлении исследования не учитывают возрастные особенности развития и течения алкогольной болезни.
По объективным причинам (обратимость изменений) недостаточно изучены ранние изменения гипоталамических структур при хронической алкогольной интоксикации, а также не проведен полный сопоставительный анализ экспериментальных и клинико-морфологических данных изменений внутренних органов и структур гипоталамо-гипофизарно-нейросекреторной системы при хронической алкогольной интоксикации.
Указанное и определило цель и задачи настоящего исследования.
6 Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилось клинико-морфологическое и экспериментальное изучение структурных и функциональных изменений нейросекреторных нейронов супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса и задней доли гипофиза при хронической алкогольной интоксикации.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Провести клинико-морфологический анализ случаев смерти от алкогольной энцефалопатии.
Изучить крупноклеточные ядра гипоталамуса и заднюю долю гипофиза человека при алкогольной болезни в разных возрастных группах с помощью общеморфологических, морфометрических и иммуногистохимиче-ских методов.
Исследовать структуры гипоталамо-гипофизарно-нейросекреторной системы у крыс в экспериментальной модели хронической алкогольной интоксикации с последующей алкогольной или водной депривацией.
Установить морфологические критерии, характеризующие специфичность изменений структур гшюталамо-гипофизарно-нейросекреторной системы при хронической алкогольной интоксикации и их возможные механизмы.
Научная новизна полученных результатов
Впервые проведено комплексное морфометрическое и иммуногистохи-мическое исследование крупноклеточных ядер гипоталамуса (супраоптического и паравентрикулярного) при алкогольной болезни у человека и при хронической алкогольной интоксикации в эксперименте на крысах.
Полученные морфологические и экспериментальные данные раскрывают закономерности изменений нонапептидэргических нейронов и путей транспорта вазопрессина и окситоцина при алкогольной энцефалопатии на ранних стадиях ее развития в эксперименте и во второй и третьей стадиях алкогольной болезни у человека. При этом впервые учтены возрастные особен-
ности изменений супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса.
Показано, что одним из ведущих механизмов повреждений гипоталами-ческих структур при хронической алкогольной интоксикации является разба-лансировка синтеза и транспорта нейрогормонов, происходящие как в вазо-прессин-, так и в окситоцинэргических нейронах супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса.
Впервые показано, что при хронической алкогольной интоксикации у человека и экспериментальных животных в паравентрикулярном ядре происходит значительное усиление синтеза кортиколиберина, связанное, по-видимому, с характерной для алкогольной болезни атрофией коркового вещества надпочечников и «выключением» отрицательной обратной связи.
Показано, что изменения супраоптического и паравентрикулярного ядер обладают отличительными особенностями, несмотря на стереотипность отдельных патоморфологических признаков.
Впервые полученные экспериментальные данные и проведенные сопоставления их с клинико-морфологическими результатами свидетельствуют о возможной необратимости алкогольных повреждений крупноклеточных ядер гипоталамуса, несмотря на прекращение действия этиологического фактора-алкоголя, что является одной из вероятных основ неизлечимости висцеральных проявлений поздних стадий алкогольной болезни.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты исследования, полученные с использованием адекватного комплекса традиционных патоморфологических, морфометрических методов, современных иммуногистохимических методов и многомерного статистического анализа раскрывают новые закономерности гистофизиологии но-напептидэргических ядер гипоталамуса (супраоптического и паравентрикулярного), специфичности их изменений при хронической алкогольной интоксикации с учетом возрастных особенностей.
Полученные морфологические данные имеют прикладное значение для диагностики и дифференциальной диагностики алкогольных поражений ги-поталамических структур, оценки степени их обратимости. Проведенный клинико-морфологический анализ свидетельствует о высокой медицинской и социальной значимости проблемы алкогольной болезни, в частности, ее мозговой формы.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
Изменения нейронов крупноклеточных ядер гипоталамуса при наличии повреждений кровеносных сосудов всех типов являются относительно специфичными для хронической алкогольной интоксикации. В нонапепти-дэргических нейронах и путях выведения вазопрессина и окситоцина при хронической алкогольной интоксикации развивается дисбаланс между ядерным и цитоплазматическим синтетическим аппаратами, а также между синтезом и выведением нонапептидов. Наибольшая выраженность изменений супраоптического и паравентрикулярного ядер наблюдается в возрасте до 40 лет.
Морфометрические, гистохимические и иммуногистохимические изменения нейронов супраоптического и паравентрикулярного ядер, наряду с активизацией одного из инициаторов апоптоза - каспазы-9, свидетельствуют о наличии критического уровня повреждений нонапептидэргических нейронов при хронической алкогольной интоксикации, после которого они могут прогрессировать вне зависимости от прекращения действия алкоголя.
Прекращение употребления алкоголя после хронической алкогольной интоксикации в эксперименте приводит в раннем периоде к прогрессирова-нию повреждений супраоптического и паравентиркулярного ядер гипоталамуса, которые частично уменьшаются при замене алкоголя водой в оксито-цинэргических нейронах, но не корригируются в вазопрессинэргических нейронах. Окситоцин крупноклеточных ядер гипоталамуса может участво-
вать в компенсации нарушенных функций вазопрессинэргических структур гипоталамуса на ранних сроках хронической алкогольной интоксикации.
Апробация работы Материалы исследования докладывались на итоговых научных конференциях Курского государственного медицинского университета (2001, 2002, 2003); V Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2002); IV Международной конференции по функциональной нейроморфолопш «Колосовские чтения-2002» (Санкт-Петербург, 2002); II научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения профессора М.Г. Колпакова, «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002); Всероссийской конференции с международным участием "Нейроэндокринология-2003" (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской научной конференции «Реактивность и пластичность гистологических структур в нормальных, экспериментальных и патологических условиях», посвященной памяти член-корреспондента АМН СССР Ф.М. Назаренко (Оренбург, 2003); заседании проблемной комиссии «Морфогенез и регенерация» Курского государственного медицинского университета 17.12.2003 г.
*
Публикация результатов исследования
Основные положения работы изложены в 10 научных публикациях, из которых 4 - в местной, 6 - в центральной печати.
Внедрение результатов исследования
Новые сведения о патофизиологических особенностях супраоптиче-ского и паравентрикулярного ядер гипоталамуса человека, их изменениях при хронической алкогольной интоксикации, комплекс методов количественного морфологического изучения' и математического анализа данных структур, иммуногистохимические методы внедрены в учебный процесс и научную работу кафедр гистологии, патологической анатомии и патологиче-
ской физиологии Курского государственного медицинского университета, практику отделения патологической анатомии больницы скорой медицинской помощи г.Курска.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, включающей 5 подглав, заключения, выводов и указателя литературы. Иллюстративный материал представлен 13 таблицами, 22 фотомонтажами, включающими 90 микрофотографий, и 43 графиками. Указатель литературы включает 210 источников: 96 отечественных и 114 зарубежных.
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ:
ВП - вазопрессин
ГГНС - гипоталамо-гипофизарно-нейросекреторная система
ЗДГ - задняя доля гипофиза
НСН — нейросекреторные нейроны
ОТ - окситоцин
ПВЯ - паравентрикулярное ядро гипоталамуса
СОЯ - супраоптическое ядро гипоталамуса
Клиническая морфология алкогольной болезни
Длительное время проблема алкоголизма была прерогативой в основном психиатров, для которых отрицательные последствия злоупотребления спиртными напитками были наиболее очевидными и убедительными. Хотя результаты некоторых исследований свидетельствуют о большей степени доверия больных с алкогольными проблемами врачам общей практики, чем наркологам (Moula Н. et al., 1997).
Поражения внутренних органов при систематическом злоупотреблении алкоголем были описаны еще в XIX веке, но, несмотря на это, они еще долго не привлекали внимания врачей-интернистов. Более того, значимость алкогольного фактора в развитии цирроза печени в 60-х годах прошлого века ставилась под сомнение, а вплоть до 70-х годов XX столетия у многих больных даже не поднимался вопрос о возможности поражения сердца именно алкогольной этиологии (Моисеев B.C., 1990). Современные же представления о роли алкоголя в патологии многих внутренних органов преимущественно формировались в последние 20 лет.
Результатом изучения пато- и морфогенеза острой и хронической алкогольной интоксикации стало выделение новой самостоятельной нозологической формы - алкогольной болезни, которая представляет собой «заболевание, при котором длительная повторяющаяся интоксикация этанолом приводит к возникновению органических изменений в органах и системах, начиная от минимальных поражений сосудов микроциркуляторного русла до полиорганной патологии с соответствующей клинической, в том числе и психиатрической симптоматикой» (Пауков B.C., 1994). Таким образом, данное определение алкогольной болезни сильно отличается от понимания ее М. Гуссом, который предложил его в 1849 году и рассматривал этот термин как синоним алкоголизма.
Согласно точке зрения B.C. Паукова (Пауков B.C., 1994; Пауков B.C., 1996), в патогенезе алкогольной болезни можно выделить 3 основные стадии, каждая из которых имеет свою отличительную морфологию. Этот же взгляд на данную проблему поддерживают и некоторые зарубежные исследователи (Woronowicz В.Т., 1997). Первая стадия - стадия повторных острых алкогольных интоксикаций, когда возникают морфологические изменения преимущественно в сосудах микроциркуляторного русла, в отдельных клетках, в результате поражения гистогематического барьера, но они еще достаточно легко обратимы. Иными словами, возникает алкогольная микроангиопатия, которая становится фоном для последующих органных изменениях. Органом-мишенью является сердце. Эта стадия может быть изучена в основном в эксперименте, поскольку еще нет выраженных клинических проявлений болезни (Пауков B.C., 1994; Пауков B.C., 1996). Вторая стадия - стадия пьянства, при которой органом-мишенью становится печень, от функционирования которой зависит длительность этой стадии. Именно на данной стадии алкогольной болезни развивается уже полисистемная патология, особенностью которой является то, что возникновение повреждений какого-либо одного органа через целый ряд сложных механизмов способствует развитию патологических изменении в остальных органах, замыкая, таким образом, порочный круг (Пауков B.C. с соавт., 1996; Пауков B.C. с соавт., 2001). Стадия пьянства может переходить в следующую, третью стадию алкогольной болезни - алкоголизм, который характеризуется наличием психической и физической зависимости от алкоголя. Возникновение этой стадии непосредственно связано с появлением в крови метаболита этанола - ацетальдегида. На данном этапе наблюдаются тяжелые органические изменения органов и тканей, которые уже становятся необратимыми и постепенно прогрессируют, даже при отсутствии алкоголя. Поэтому соматическое излечение от алкоголизма практически невозможно (Пауков B.C., 1994; Пауков B.C., 1997; Угрюмов А.И., 1992). Такими больными должны заниматься наркологи для того, чтобы попытаться подавить зависимость от алкоголя, в развитии которой в настоящее время выделяют токсический фактор, собственно фактор зависимости, фактор почвы и фактор фона (Валентин Ю.В., 1998). Затем данных больных необходимо переводить к терапевту уже для лечения соматических заболеваний, возникающих в результате хронической алкогольной интоксикации. Иными словами, основную работу по борьбе с алкогольной болезнью должны вести именно терапевты общесоматических больниц (Моисеев B.C. с соавт., 1996; Моисеев B.C., Огурцов П.П., 1997; Пауков B.C., 2001).
Несмотря на системный характер поражений при алкогольной болезни, на определенном этапе доминирует патология одного из органов-мишеней, но возможны и сочетанпые поражения. Однако, руководствуясь принципом преимущественного поражения органов, выделены определенные клинико-морфологические формы алкогольной болезни, среди которых наибольшее значение имеют мозговая, печеночная, сердечная, панкреатическая, почечная, желудочная и легочная формы (Серов В.В., Лебедев СП., 1985).
В последнее время в большинстве развитых стран наблюдается неуклонный рост числа поражений печени алкогольной этиологии, достигая 30-40% в общей структуре заболеваний печени (Виноградова Л.Г., 1990). Осложнения алкогольной болезни печени в США являются причиной смерти 13 тысяч человек ежегодно (Буеверов А.О. с соавт., 2001). Факторами риска АБП считаются степень потребления алкоголя, пороговые дозы и характер потребления алкоголя, генетические факторы, половые различия, роль соче-танного вирусного поражения, пищевые факторы, социальные и профессиональные факторы (Bellentani S. et al., 2000; Burra P. et al., 1995). Считается, что риск поражения печени значительно увеличивается при употреблении более 80 гр чистого этанола в день на протяжении не менее 5 лет, причем развитие алкоголыюйболезни печени не зависит от типа спиртных напитков (Буеверов А.О. с соавт., 2001).
В настоящее время установлено, что алкогольная болезнь печени включает в себя несколько последовательных стадий: алкогольный стеатоз, алкогольный гепатит и цирроз (Виноградова Л.Г., 1990; Мухин Н.А: с соавт., 1997; Мухин Н.А. с соавт., 1998). Стеатоз является наиболее частым морфологическим вариантом алкогольной гепатопатин и встречается у 60-75% больных АБ (Виноградова Л.Г., 1990). Жировые включения крупных размеров локализуются преимущественно во второй и третьей зонах печеночной дольки, но могут быть распределены и диффузно (Буеверов А.О. с соавт., 2001). Появляются жировые кисты, которые могут быть окружены макрофагами, лимфоцитами, нейтрофильными лейкоцитами (Серов В.В., Лапиш К., 1989). Клинические проявления алкогольного стеатоза скудные и малоспецифичные (Виноградова Л.Г., 1990). Стадией прогрессирования алкогольной гепатопатин является алкогольный гепатит, который может быть острым и хроническим (Пауков B.C., Угрюмов А.И., 1998). Для развернутой картины острого алкогольного гепатита характерно наличие гепатоцитов в состоянии баллонной и жировой дистрофии, с централыюлобулярными некрозами, воспалительной реакцией с инфильтрацией портальных полей полинуклеарными лейкоцитами и отложениями алкогольного гиалина - телец Мэллори (Серов В.В., Лебедев СП., 1985).
Иммуногистохимические методы
Для идентификации эргичности НСН, а также для оценки процессов синтеза и секреции ВП, ОТ и кортиколиберина последовательные срезы гипоталамуса, содержащие дорсолатерательную часть СОЯ и ПВЯ и срезы ЗДГ, окрашивали иммуногистохимически пероксидаза-антипероксидазным (ПАП)-методом с помощью поликлональных кроличьих антител к ВП (Chemicon International, USA) к ОТ (Chemicon International, USA) или к кортиколиберину (Peninsula Laboratories Inc., Division of Bachem, CA, USA) согласно следующему протоколу.
Исследование выполнено в Университете Фридриха Шиллера (Иена, Германия) и в Институте Макса Планка (Гейдельберг, Германия). Срезы были депарафинированы и гидратированы при проводке через ксилол (30 минут) и растворы этилового спирта нисходящей концентрации (20 минут), промыты в дистиллированной воде (10 минут) и растворе забуференной соли PBS (рН 7.4) в течение 30 минут. Далее срезы были преинкубированы с 5% нормальной сывороткой козы, разведенной в 1% растворе Тритона на PBS в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали с первичными поликлональными антителами к ВП (Chemicon), ОТ (Chemicon) или к кортнколиберину (Peninsula Laboratories Inc.), разведенными 1:1000 (для парафиновых срезов гипоталамуса и гипофиза человека) или 1:10000 (для парафиновых срезов гипоталамуса и гипофиза крысы) в рабочем буферном растворе PBS, содержащем 1% нормальной сыворотки козы, 0.3 % Тритона на PBS (рН 7.4), в течение ночи при комнатной температуре или 48 часов при температуре 4С. На следующий день все манипуляции осуществлялись при комнатной температуре. Срезы были промыты трижды по 10 минут в буферном растворе PBS, инкубированы в течение 2 часов в рабочем растворе со вторичными козьими биотинилированными антикроличьими антителами в разведении 1:500 в PBS (Vector, USA), после чего срезы трижды по 10 минут были промыты в PBS (рН 7.4). Затем срезы были инкубированы в течение 1 часа с авидин-биотиновым комплексом (Vector, USA) при комнатной температуре. Далее срезы были промыты в течение 10 минут в растворе PBS и окрашены глюкозо-оксидазо-диаминобензидином (ГОД-ДАБ), по описанному протоколу (Zaborski L., Heimer L., 1989). Наконец, срезы были дегидратированы через серию растворов алкоголя возрастающей концентрации (20 минут) и ксилол (около 20 минут) и заключены под покровные стекла в среде "ОТС compound" (Germany).
Иммуногистохимическое окрашивание каспазы-9, являющейся одним из инициирующих ферментов апоптоза, в СОЯ и ПВЯ гипоталамуса экспериментальных животных было проведено с использованием поликлональных антител к каспазе-9 (Santa Kruz Biotechnology Inc., USA) согласно следующему протоколу.
Исследование выполнено в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова РАН (Санкт-Петербург). Срезы были депарафиниро-ваны и гидратированы при проводке через ксилол (30 минут) и растворы этилового спирта нисходящей концентрации (20 минут), промыты в дистиллированной воде дважды по 5 минут), в 10 % растворе сахарозы в растворе за-буференной соли PBS (рН 7.4) в течение 20 минут, а затем в PBS (рН 7.4) трижды по 5 минут. После этого срезы инкубировались в 0,3% растворе Н2Ог в течение 30 минут с последующей промывкой в PBS (10 минут). Далее срезы были преннкубнрованы с 2% нормальной сывороткой козы, разведенной в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали с первичными поликлональными кроличьими антителами к каспазе-9 (Santa Kruz Biotechnology Inc.), разведенными 1:50 в буферном растворе PBS в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день все манипуляции осуществлялись также при комнатной температуре. Срезы были промыты трижды по 10 минут в буферном растворе PBS, инкубированы в течение 30 минут со вторичными козьими биотинилированными антикроличьими антителами, разведенными в PBS, после чего срезы трижды по 10 минут были промыты в PBS (рН 7.4). Затем срезы были инкубированы в течение 30 минут с авидин-биотиновым комплексом (ABC-kit) при комнатной температуре. Далее срезы были промыты трижды по 5 минут в растворе PBS и окрашены 0,05% раствором диаминобензидина в PBS (ДАБ) с 0,015% раствором Н2О2 в течение 5 минут. Наконец, срезы были промыты трижды по 10 минут в дистиллированной воде, дегидратированы через серию растворов алкоголя воз растающей концентрации (20 минут) и ксилол (около 20 минут) и заключены под покровные стекла в канадский бальзам.
Количественная оценка результатов осуществлялась с помощью винтового окуляр-микрометра «МОВ-1-15х» и компьютерных программ Imageool и ImageJ (США). Морфометрию выполняли на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином посредством винтового окуляр-микрометра. В каждом случае производили не менее 30 измерений. Первичные морфометрические данные представлены следующими показателями: максимальный и минимальный диаметры тел нейронов, максимальный и минимальный диаметры ядер, диаметр ядрышек. Данные показатели служили для определения объема тел, ядер и ядрышек НСН с последующим вычислением ядерно-цитоплазматического (ЯЦО) и ядрышко-ядерного (яЯО) отношений с проведением информационного анализа (Автандилов Г.Г., 1990). Объем тел и ядер рассчитывался инди-видуалыю для каждого анализируемого нейрона по формуле тс а Ь /6, где а -наибольший, a b - наименьший диаметры; а объем ядрышек нейронов - (тоже для каждого нейрона) - по формуле 4 7t r3/3, где г - радиус сферического ядра (Блинков СМ., Глезер И.И., 1964). Ядрышки также оценивали по их положению в ядре (центральное или эксцентричное), количеству и типу распределения AgNORs. Первый тип распределения AgNORs соответствует внутриядрышковому расположению гранул серебра, 2 тип - как внутрияд-рышковому, так и диспергированному в кариоплазме, 3 тип - только диспергированному в кариоплазме.
Морфометрические и иммуногистохимические изменения супраоптического ядра гипоталамуса человека при алкогольной болезни
Однако при хронической алкогольной интоксикации происходит увеличение парной корреляции тел нейронов с объемом их ядер, цитоплазмы с объемом ядра, а также объемов ядра и ядрышка (рис. 5). Между тем, анализ связи объема ядрышка с ядрышко-ядерным соотношением (г=0,459 - в группе сравнения, г=0,181 - при алкогольной болезни) и коэффициента эксцентричности расположения ядрышек с их объемом выявил значительное снижение их силы (г= - 0,208 и г= -0,647, соответственно). При информационном анализе производили вычисление относительной энтропии (h) и коэффициента избыточности (R). В группе с алкогольной болезнью выявлено увеличение относительной энтропии объемов всех структур НСН (рис. 6). При этом следует отметить, что в наибольшей степени возрастает относительная энтропия объема ядрышка (+16,6%), менее - объема тела (+13,62%) и объема ядра (+7,38%). Увеличение показателя h свидетельствует о существенном воздействии алкогольной интоксикации на структурную упорядоченность НСН СОЯ и их компонентов. Другой, не менее важной информационной характеристикой является коэффициент избыточности (R), снижение которого свидетельствует об опасности срыва компенсаторных возможностей биологической системы. Подобная динамика изменений этого показателя была выявлена при изучении объемов всех структур НСН СОЯ (рис. 7). При этом в наибольшей степени происходило уменьшение данного коэффициента также для объема ядрышек нейронов.
По результатам изучения зон ядрышковых организаторов (AgNORs) установлено, что для НСН СОЯ основным является 1-й тип расположения AgNORs - внутриядрышковый, причем как в исследуемой, так и в группе сравнения (рис. 8). Однако при алкогольной болезни наблюдается некоторое уменьшение числа AgNORs данного типа с одновременным возрастанием количества клеток со 2-м типом расположения ядрышковых организаторов (рис. 9).
Таким образом, совокупность полученных данных свидетельствует о сложном характере динамики изменений различных морфометрических параметров НСН СОЯ, связанной с разнообразием как морфологических, так и функциональных свойств этих нейронов. Окраска гематоксилином и эозином не позволяет верифицировать вазопрессин- (ВП) и окситоцинергические (ОТ) нейроны, для чего на параллельных срезах проведено иммуногистохи-мическое исследование.
Весь изучаемый материал был окрашен иммуногистохимически на ВП и ОТ (рис. 10, 11). На данных препаратах при помощи компьютерного анализатора «ImageTool» производилось измерение площади тел и ядер НСН с последующим вычислением абсолютной и относительной (в %) площадей, занятых иммунореактивным веществом (Sir). Установлено, что при алкогольной болезни происходит достоверное (р 0,05) уменьшение площади тел ВП нейронов на 15,43%, в сопоставлении с группой сравнения (1297,9 + 137,33 и 1498,15 + 110,2 пикселей, соответственно). Аналогично изменяются и площади ядер этих нейронов. Изменения ОТ нейронов имели противоположный характер. При алкогольной болезни выявлено увеличение площади тел нейронов на 3,13% (в группе сравнения - 1245,23 + 138,01 пикселей, а при алкогольной болезни -1284,21 + 54,34 пикселей) и ядер ОТ нейронов СОЯ на 8,03% (297,87 ± 35,35 и 321,8 + 22,77 пикселей, соответственно). Необходимо отметить, что в группе сравнения размеры тел ВП нейронов оказались значительно больше ОТ нейронов (1498,15 + 110,2 и 1245,23 + 138,01 пикселей, соответственно), в то время как при алкогольной болезни данная разница являлась не столь существенной (1297,9 + 137,33 и 1284,21 + 54,34 пикселей). Относительное значение площади, занятой ОТ-иммунореактивным веществом, при алкогольной болезни снижалось на 1,56%, а ВП-иммунореактивным веществом оставалось практически без изменений (рис. 12). Величина коэффициента эксцентричности расположения ядрышка также имела возрастные особенности изменений, выражающиеся в увеличении этого показателя с возрастом, причем как в контрольной группе (1,26 + 0,03 и 1,28 + 0,02, соответственно), так и при алкогольной болезни (1,33 ± 0,02 и 1,37 ±0,06). Изучение зон AgNORs позволило установить, что в группе сравнения происходит связанное с возрастом уменьшение числа клеток с 1-м типом расположения AgNORs - внутриядрышковым (в возрасте до 40 лет - 85,8%, более 40 лет - 81,5%). Выявлено также увеличение коэффициента диспергированности, связанное с возрастом (1,19 + 0,04 и 1,23 + 0,06, соответственно). ВП-ГС ВП-АБ ОТ-ГС ОТ-АБ Рисунок 13. Изменение относительной энтропии (h) и коэффициента избыточности (R) относительной площади, занятой иммунореактивным веществом в НСН в группе сравнения (ГС) и при алкогольной болезни (АБ)
Таким образом, анализ всех полученных данных свидетельствует, что при алкогольной болезни происходит увеличение объемов всех структур НСН СОЯ в сопоставлении с данными в группе сравнения. При этом возрастание объемов тел этих нейронов связано преимущественно с увеличением цитоплазмы, что может отражать, прежде всего, степень их отечных изменений. Увеличение объема ядрышек сопровождается одновременным повышением коэффициента эксцентричности их расположения.
Установлено, что для алкогольной болезни характерным является изменение некоторых интегральных показателей соотношения различных структур НСН СОЯ. Отличительным является увеличение парной корреляции объемов тел и ядер нейронов, объемов ядра и ядрышка, при одновременном снижении связи объема ядрышка с ядрышко-ядерным соотношением и коэффициента эксцентричности ядрышек с их объемом.
При проведении информационного анализа объемов тел, ядер и ядрышек НСН СОЯ выявлено увеличение относительной энтропии объемов всех
Установленное возрастание объемов всех структур нонапептидергиче-ских нейронов ПВЯ, наблюдаемые изменения этих нейронов полностью не характеризуют. Поэтому в данном случае также необходимым является использование различных интефальных показателей их соотношения, таких как ядерно-цитоплазматическое и ядрышко-ядерное соотношения, расположение ядрышек с последующим проведением корреляционного и информационного анализов. При корреляционном анализе у лиц, страдавших алкогольной болезнью, обнаружены существенные отклонения в связях между морфометриче-скими параметрами тел, цитоплазмы, ядра и ядрышка (рис. 15). Установлено, что в обеих изучаемых фуппах объем НСН в основном зависим от объема цитоплазмы (г=0,99 - в контроле и при алкогольной болезни). Однако при алкогольной болезни происходит увеличение парной корреляции тел нейронов с объемом их ядер, цитоплазмы с объемом ядра, а также объемов ядра и ядрышка (рис. 15). Учет топографии ядрышек с определением степени эксцентричности их расположения выявил противоположную (отрицательную) связи коэффициента эксцентричности с объемом ядрышка (г=0,377 - в группе сравнения, г= -0,342- при алкогольной болезни). Анализ связи объема ядрышка с ядрышко-ядерным соотношением также выявил ее снижение при алкогольной болезни (г=0,59 и г=0,36, соответственно). При проведении информационного анализа вычисляли относительную энтропию (h) и коэффициент избыточности (R). В группе с алкогольной болезнью выявлено увеличение относительной энтропии объемов всех структур НСН, за исключением ядрышек (рис. 16). При этом следует отметить, что в наибольшей степени возрастает относительная энтропия объема ядра (+10,97%), в меньшей - объема перикариона (+7,0%). Изменение же данного параметра для объема ядрышка имело противоположный характер (- 1,37%). При вычислении коэффициента избыточности (R) выявлено его снижение для объемов тел и ядер НСН ПВЯ, причем для последних в большей степени (рис. 17). Величина данного параметра для объема ядрышек даже несколько повысилась. С целью определения эргичности НСН ПВЯ изучаемый материал был окрашен иммуногистохимически на ВП и ОТ (рис. 18, 19). На данных препаратах при помощи компьютерного анализатора «ImageTool» производилось измерение площади тел и ядер НСН с последующим вычислением абсолютной и относительной (в %) площадей, занятых иммунореактивным веществом (Sir).
Морфометрические и иммуногистохимические изменения супраоптического, паравентрикулярного ядер гипоталамуса и задней доли гипофиза крыс при хронической алкогольной интоксикации
В эксперименте с моделированием хронической алкогольной интоксикации в течение 30 суток у крыс линии Вистар макроскопически выявлены выраженные общие изменения головного мозга: полнокровие мозговых оболочек, дряблость консистенции и повышенная влажность вещества мозга во всех отделах. Абсолютная масса головного мозга выросла до 1820,0 мг (в контроле - 1763,3 + 55,82 мг) и оказалась близко к достоверности увеличенной относительно массы тела животных (5,94 + 0,18 мг/гр против 5,68 + 0,06 мг/гр в контроле).
По данным морфометрии НСН СОЯ гипоталамуса установлено, что при хронической алкогольной интоксикации происходит достоверное увеличение объема их тел (на 12,98%), связанное с возрастанием как максимального, так и минимального диаметров этих нейронов (таблица 10).
Изменение объема ядер НСН в группе с хронической алкогольной интоксикацией имело противоположный характер - уменьшение на 1,84%). В тоже время линейные и объемные параметры их ядрышек несколько возросли (на 1,12%) в сравнении с контрольной группой (таблица 10). Кроме того, увеличилось количество нейронов с эксцентрично расположенными ядрышками (коэффициент эксцентричности в контрольной группе - 1,35 + 0,03 и 1,42 + 0,08 - при хронической алкогольной интоксикации).
Примечание: DT МИН - минимальный диаметр тел, DT макс - максимальный диаметр тел, VT - объём тел нейронов, DH мин - минимальный диаметр ядер, Вя макс - максимальный диаметр ядер, Уя - объем ядер нейронов, Уяк - объем ядрышек нейронов. - отличия достоверны (р 0,05). Для более детального анализа изменений всех структур НСН СОЯ использовали различные интегральные показатели их соотношения: ядерно-цитоплазматическое и ядрышко-ядерное соотношения, расположение ядрышек с последующим проведением корреляционного и информационного анализов.
При корреляционном анализе данных установлено, что в обеих изучаемых группах объем НСН в большей степени зависим от объема цитоплазмы (г=0,99 - в контроле и г=0,96 - при хронической алкогольной интоксикации). Однако при хронической алкогольной интоксикации происходит значительное уменьшение парной корреляции тел нейронов с объемом их ядер, цитоплазмы с объемом ядра, а также объемов ядра и ядрышка .
Утрачивается и изменяется характер связи между объемом ядра и величиной ядерно-цитоплазматического отношения (г= -0,928 - в контроле, г=0,398 - при хронической алкогольной интоксикации), а также между этим параметром и объемом цитоплазмы (г= -0,933 и г= -0,670, соответственно). Между тем анализ связи объема ядрышка с ядрышко-ядерным соотношением выявил значительное ее возрастание (г=0,305 - в контрольной группе, г=0,959 - при хронической алкогольной интоксикации). Учет топографии ядрышек с определением степени эксцентричности их расположения выявил снижение связи коэффициента эксцентричности с объемом ядрышка (г=0,977 и г=0,622, соответственно).
При вычислении коэффициента избыточности (R) выявлено его снижение для объемов тел и ядрышек НСН СОЯ, причем для последних в большей степени (+14,71% и +18,73%, соответственно). Величина данного параметра для объема ядер даже несколько повысилась (+15,76%) (рис. 31).
С целью определения эргичности НСН СОЯ изучаемый материал был окрашен иммуногистохимически на ВП и ОТ (рис. 32). На данных препаратах при помощи компьютерного анализатора производилось измерение площади тел и ядер НСН с последующим вычислением абсолютной и относительной (в %) площадей, занятых иммунореактивным веществом (Sir).
Обнаружено, что при хронической алкогольной интоксикации происходит некоторое увеличение площади тел ВП нейронов, в сопоставлении с контрольной группой (980,39 + 183,87 и 936,48 + 119,32 пикселей, соответственно). При этом наблюдалось более значительное увеличение площади ядер ВП нейронов (288 + 98,89 пикселей - в группе с хронической алкогольной интоксикацией и 197,55 + 52,7 пикселей - в контрольной группе). Рисунок 32. Содержание вазопрессина (а, б) и окситоцина (в, г) в НСН СОЯ при хронической алкогольной интоксикации (б, г); на риса, в - картина в контрольной группе. ПАП-метод с антителами против вазопрессина и окситоцина. Микрофото. X 240.
Изменения же ОТ нейронов имели другой характер. Так, при хронической алкогольной интоксикации выявлено некоторое снижение площади тел (в контрольной группе - 862,75 + 139,23 пикселей, а при хронической алкогольной интоксикации - 853,77 + 173,36 пикселей). Однако площадь ядер ОТ нейронов СОЯ в сравнении с данными в контрольной группе увеличивается, причем в большей степени (255,98 + 86,19 и 196,42 + 69,35 пикселей, соответственно).
Следует отметить, что в обеих изучаемых группах размеры ВП нейронов оказались больше ОТ нейронов (936,48 + 119,32 и 862,75 + 139,23 пикселей в контрольной группе, против 980,39 + 183,87 и 853,77 + 173,36 пикселей -при хронической алкогольной интоксикации), причем в последней данная разница являлась более существенной.
Относительные значения площадей, занятых ВП- и ОТ- иммунореактивным веществом, при хронической алкогольной интоксикации в сравнении с контрольной группой практически в равной степени достоверно снижались (на 10,47% и 10,6%, соответственно) (рис. 33).
При информационном анализе показателей относительных площадей, занятых иммунореактивным веществом, установлено, что ВП и ОТ нейроны СОЯ при хронической алкогольной интоксикации проявляют идентичный характер изменений, заключающийся в достоверном повышении величины относительной энтропии (h) данного показателя в обеих популяциях НСН, при соответствующем снижении коэффициента избыточности (R). Так, в ВП-эргических нейронах при хронической алкогольной интоксикации наблюдается увеличение h на 37,83%, при соответствующем снижении R на 77,14%, а в ОТ нейронах СОЯ данная разница является менее выраженной (на 10,58% и 20,97%, соответственно) (рис. 34).
Изменение относительной площади, занятой иммунореактивным веществом, в НСН СОЯ в контрольной группе (КГ) и при хронической алкогольной интоксикации (ХАИ). ВП-КГ ВП-ХАИ ОТ-КГ ОТ-ХАИ Изменение относительной энтропии (h) и коэффициента избыточности (R) относительной площади, занятой иммунореактивным веществом в НСН СОЯ в контрольной группе (КГ) и при хронической алкогольной интоксикации (ХАИ).
Количественная оценка одного из ферментов инициации апоптотическо-го каскада - каспазы 9 - проведена путем подсчета относительного числа каспаза - позитивных нейронов (соотношение иммунореактивных нейронов к общему числу нейронов на параллельных срезах, окрашенных гематоксилином и эозином). При хронической алкогольной интоксикации выявлено достоверное (хи-квадрат = 6,255 при критическом значении 3,84; р 0,05) увеличение каспаза-позитивных нейронов до 70% (в контроле - 51%).
По результатам морфометрического исследования НСН ПВЯ гипоталамуса установлено, что при хронической алкогольной интоксикации происходит достоверное увеличение объема их тел, связанное с преимущественным возрастанием максимального диаметра этих нейронов .
Изменения объемов ядер и ядрышек НСН в группе с хронической алкогольной интоксикацией имели идентичный характер (таблица 11). Кроме того, достоверно увеличилось количество нейронов с эксцентрично расположенными ядрышками (коэффициент эксцентричности в контрольной группе - 1,32 + 0,04 и 1,4 + 0,04 - при хронической алкогольной интоксикации). Необходимо отметить, что наибольшим изменениям при хронической алкогольной интоксикации подвергаются объемы ядер и ядрышек НСН (на 22,84% и 18,58%, соответственно), при менее выраженном изменении объема их тел (на 14,66%).
Для более детального анализа изменений всех структур НСН СОЯ в данном случае также необходимым является использование различных интегральных показателей их соотношения, таких как ядерно-цитоплазматическое и ядрышко-ядерное соотношения, расположение ядрышек с последующим проведением корреляционного и информационного анализов.
