Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 5
1.1. Факторы, определяющие ядерную детерминацию в раннем развитии эмбрионов Drosophila melanogaster 5
1.2. Эксперименты по генетической трансформации животных .. 13
Глава. II. Материалы и методы 23
Список сокращений 36
Глава III. Результаты 37
3.1. Развитие полярных клеток ранних эмбрионов Drosophila melanogaster в норме и при экспериментальных воздействиях (после коротковолнового ультрафиолетового облучения и микроинъекпий воды и раствора ДНК) 37
3.2. Инъекции интактного вируса саркомы Рауса и клонированных Фрагментов ретровирусных ДНК з ранние эмбрионы Drosophila melanogaster 75
3.3. Микроинъекции ДНК аденовируса Sa7 в ранние эмбрионы Drosophila melanogaster 142
Глава ІV. Обсуждение полученных результатов 170
Выводы 184
Список использованной литературы 185
- Факторы, определяющие ядерную детерминацию в раннем развитии эмбрионов Drosophila melanogaster
- Эксперименты по генетической трансформации животных
- Развитие полярных клеток ранних эмбрионов Drosophila melanogaster в норме и при экспериментальных воздействиях (после коротковолнового ультрафиолетового облучения и микроинъекпий воды и раствора ДНК)
Факторы, определяющие ядерную детерминацию в раннем развитии эмбрионов Drosophila melanogaster
Простота культивирования, короткий жизненный цикл, хорошо изученная генетика, особенности эмбрионального развития (отсутствие границ между ядрами в период синхронных делений дробления, четкая обособленность зоны формирования полярных клеток, наличие особых зачатков имагинальных органов) - позволяют проводить на Drosophila работы по изучению эмбриогенетических основ щ-ітодиффе-ренцировки на методическом уровне, который пока не доступен в экспериментах на других эукариотических организмах.
По содержанию и распределению желтка яйцо дрозофилы относится к центролецитальному типу (Sonnenblick,1950). Ядро на стадии метафазы первого деления созревания расположено в средней части яйца в островке чистой цитоплазмы, соединенном с кортикальной цитоплазмой (периплазмой) тонкими цитоплазматическшли тяжами.Кортикальная цитоплазма свободна от желтка и прослеживается по всей поверхности яйца,причем, на заднем полюсе она. несколько шире, чем на других участках, и отличается повышенной базофилией (так называемая, полярная плазма) (Mahowald,1968;Mahowald, 1971а,Ъ).
Первые 13 делений дробления ядер - очень быстрые (митотичес-кий цикл зашагает 10 минут), синхронные (в пределах одного мито-тического цикла) и сопровождаются разделением цитоплазматических островков. Клеточных границ (плазматических мембран) между делящимися ядрами не образуется, и яйцо Droeophila представляет собой на ранних стадиях развития многоядерный ci iH4HTini(Rabinowitz,194l). После 6-го деления дробления начинается миграция островков с ядрами, - на поверхность яйца. В этот момент происходит обособление трех групп ядер (бластодерма-льных, полярных и желточных) - первая морфологически выраженная дифференциация зародыша. Бластодермальные ядра дадут в будущем основную массу соматических клеток имаго, полярные - половые и часть кишечных клеток, а желточные ядра, не участвовавшие в миграции, останутся в центральной желточной массе и станут вителло-фагами ( Рои1воп,1950).
К 9-му делению дробления миграция заканчивается. Ядра лежат на поверхности яйца в широком кортикальном слое цитоплазмы, свободном от желточных гранул (синцитиальная бластодерма). На этой стадии они претерпевают ещё 4 деления дробления, но полярные ядра в отличие от соматических, делятся асинхронно ( Sonnenblick,t950).
Лишь к 3-му часу после оплодотворения между ядрами возникают клеточные стенки (клеточная бластодерма) и начинаются гаструляни-онные движения бластодермальных клеток (Rabinowitz,1941).
Формирование полярных клеток Droeophila происходит в период между 7 и 9 делениями дробления. На заднем полюсе яйца в это время образуются цитоплазматические бугорки, в которые и попадают ядра будущих полярных клеток ( Sonnenblick,1950).
Ядра полярных клеток выходят на поверхность яйца несколько раньше бластодермальных. Часть ядер полярных клеток (вторичные вителлофаги) возвращается в желток ( Poulson,l950),
Эксперименты по генетической трансформации животных
В серии экспериментов, выполненных Фоксом, Гермераад и др., в эмбрионы дрозофилы ( v bw - белоглазые мухи) вводили тотальную ДНК, выделенную из мух дикой линии. В потомстве мух, вылетевших из оперированных яиц, были обнаружены особи с пигментированными глазами. Хотя в ряде случаев в политенных хромосомах трансформантов выявлены структурные изменения (дупликации vermilion-диска), в целом объясняющие фенотипический эффект, тем не менее, остается неясным, связано исправление мутантного фенотипа с экспрессией введенного генетического материала или же просто с появлением супрес-сорной мутации, индуцированной экзогенной ДНК (Fox,Yoon, 1970;Fox et.al.,1975;Germeraad,1978;Liu et.al.,1979).
Использование в качестве трансформирующей ДНК индивидуальных генов или ДНК вирусов позволяет изучить методами молекулярной гибридизации состояние и структуру чужеродной ДНК и существенно упрощает интерпретацию полученных результатов.
С помощью микроинъекций интактного вируса саркомы Рауса удалось индуцировать у эмбрионов дикой линии дрозофилы мутацию edf , затрагивающую развитие глазо-антеннальных дисков. В ДНК мух этой мутантной линии обнаружены вирус-специфические последова стельности. Вирусная ДНК сохранялась в геноме измененных мух на протяжении 10 поколений, а её потеря совпала по времени с появлением в исходной мутантной линии новой мутации, тесно сцепленной с мутацией edf. Авторами было высказано предположение об инсер-ционной природе мутаций, индуцированных вирусной ДНК (Газарян и др., 1981).
Первые генетические трансформанты у млекопитающих были получены в работе Яниша и Минтц: у мышей, развившихся из бластоцист, в которые инъецировали ДНК вируса sv 40, в печени,почках и мозге были обнаружены вирус-специфические последовательности от 0,5 до 13 копий на диплоидный геном. Передача вирусной ДНК потомству в этих экспериментах не изучалась (Jaenisch,Mintz,1974).
Гордон с соавторами инъецировали в зиготы мышей плазмиды pST6 и plf ,содержащие; ген тимидинкиназы вируса "герпеса и кДНК гена лейкоцитарного интерферона человека. Частота генетической трансформации при таком способе введения экзогенной ДНК достигала 1-6$. Хотя плазмидная ДНК и интегрировала в геном реципиента, но, как показали эксперименты по блот-гибридизапди, была сильно перестроена и не экспрессировалась. В этой работе впервые удалось продемонстрировать передачу экзогенной ДНК потомству (до F, включительно), причем, наследовалась она как моногенный Менделевский признак (Gordon et.al.,1980;Gordon,Ruddle,1981)»
Аналогичные результаты были получены и при введении в мышиные зиготы р -глобинового гена кролика, клонированного в фаге (в одном случае был зарегистрирован интактный перенос глобинового гена в геном трансгенных мышей) (Costantini,Lacy,1981).
В 1981-83 годах была опубликована серия работ, в которых не только удалось добиться интактного переноса в геном млекопитающих гена тимидинкиназы вируса герпеса, ДНЕ аденовируса Sa7, гена инсулина, гена гормона роста крысы, у. -иммуноглобулинового гена и гена трансфертна цыпленка, но и была показана передача экзогенной ДНК потомству и её экспрессия в геноме трансгенных животных ( Wagner et.al.,1981a;Wagner et.al.,1981b; Palmiter et.al.,1982; Stewart et.al.,1982; Brineter et.al.,1983; Lacy et.al., 1983; Stanley et.al.,1983 ; Газарян и др., 1983).
Развитие полярных клеток ранних эмбрионов Drosophila melanogaster в норме и при экспериментальных воздействиях (после коротковолнового ультрафиолетового облучения и микроинъекпий воды и раствора ДНК
Для того, что ы получить более полное представление о формировании ПКл в раннем эмбриогенезе Drosophila melanogasterMH использовали и прижизненные наблюдения за развитием зародышей Drosophila (при 25С), и методы гистологического анализа. Ниже приводятся обобщенные результаты экспериментов, выполненных на эмбрионах дикой линии Oregon R и мутантной линии w sn , т.к. мы не обнаружили никаких различий в раннем развитии эмбрионов этих двух линий. 30 минут развития.
В центральной части яйца видны цитоплазматические островки с ядрами (в каждой энергиде одно ядро). В большинстве случаев все ядра зародыша находятся на стадии интерфазы или профазы, но иногда ядра одного зародыша могут быть на стадии профазы и метафазы или на стадиях профазы, метафазы и анафазы.
Желточные гранулы и вакуоли на этой стадии развития равномерно распределены по всему объему яйца. Слой кортикальной цитоплазмы свободен от желтка: на заднем полюсе зародыша он шире, чем на других участках ( полярная плазма)(рис.5; 6а,б).
