Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы
Произошедший за последние 20 лет прорыв в области молекулярной биологии,
завершившийся расшифровкой структуры геномов разных видов живых организмов, в том числе животных и человека, перевернул многие традиционные представления классической генетики. На сегодняшний день стала очевидна необходимость исследования функционального значения эпигенетических модификаций генома в регуляции генной экспрессии, процессах цитодифференцировки и возникновении геномных болезней, включая злокачественные новообразования. Известно, что эпигенегические модификации действуют подобно переключателям, контролирующим генную активность таким образом, что в отдельной клетке будут эксирессироваться только 1 гены, продукты экспрессии которых необходимы в данный момент. Более того, такие модификации обеспечивают "память" о генной активности, передающуюся в ходе последующих клеточных делений.
К основным эпигенетическим изменениям генома относятся мегилирование ДНК (Bird, 2002), обычно коррелирующее с "выключением" генной экспрессии, а также изменения структуры хроматина, обусловленные модификациями гистонов в составе нуклеосом (Lachner, Jenuwein, 2002; Hashimshony ct al., 2003). Классическими примерами эпигенетической регуляции генной экспрессии у млекопитающих являются моноаллельная экспрессия одной из X хромосом и геномный импринтинг. В первом случае имеет место случайное выключение одной из X хромосом в раннем эмбриогенезе (исключая клетки трофоэктодермы, в которых инактивируется ощовская Х-хромосома); во втором случае моноаллельная экспрессия отдельных генов зависит от пола родителя, от которого они были унаследованы. Кроме того, в после/шее время были выявлены различия в экспрессии между аллелями неимпринтированных аутосомных генов млекопитающих (Knight, 2004; Chess, 2005).
На сегодняшний день до конца не ясны молекулярные механизмы, лежащие в основе аллель-специфической экспрессии. Показано, что основную роль в эпигенетической регуляции моноаллельной экспрессии генов X хромосомы и имприитнрованных генов играют повторяющиеся последовательности ДНК (Cullen, 2004; Tupler и Gabellini, 2004). Причем, такие повторы могут быть локализованы как внутри генной последовательности (экэонах или нитронах), гак и вне генов В последнем случае действие noi tojjqb. ЙІІііЙШІЙЖ'" <*се-'ч|их и> возможно,
БИБЛИОТЕКА |
отдаленных генов может осуществляться при участии интсрстициалыюго гетерохроматнна (Dillon. Festenstein, 2002). Кроме влияния на возникновение аллель-специфической структуры хроматина, некодирующие повторы ДНК могут влиять на время репликации и расположение генов и хромосом в интерфазном ядре (Rizzi et al., 2004; Ensminger et al., 2004; Osborne ct al., 2004).
Следует подчеркнуть, что существует определенная сложность в изучении описанных выше феноменов в природе, обусловленная вариабельностью как числа повторяющихся единиц в составе пучков повторов, так и их структуры. Кроме того, по крайней мере, для тринуклеотидных повторов и минисателлитов, показана как межгенерационная, так и соматическая нестабильность (Hsieh, Fire, 2000; Bois, 2003). В некоторых случаях наблюдается зависимость характера и степени нестабильности повторяющихся последовательностей ДНК от пола родителя (Гайцхоки, Паткин, 2000). Исходя из этого, трансгенные животные и культуры трансфектных клеток являются удобными моделями для исследования возможной роли повторяющихся ДНК в реализации межаллельных (межхромосомных) различий в экспрессии, обусловленных наличием в одной из гомологичных хромосом чужеродных нскодирующих сателлитных ДНК. При этом у гемизиготных по трансгенам животных можно исследовать межгенерационную нестабильность повторов, зависимость их возможной нестабильности и фенотипических проявлений от пола родителя и стадии развития носителя трансгена, а культуры трансфектных по сателлитным ДНК клеток позволяют оценить соматическую нестабильность и цитологические проявления инсерции.
Анализ родословных многих линий трансгенных как по кодирующей ДНК, так и по мини- и микросателлитам мышей показал, что одним из проявлений инсерции трансгена может быть отклонение от классического менделевского расщепления при межгенерационной передаче трансгена (Lyon, 2005). Кроме определения типа наследования трансгена, анализ родословных, особенно в сочетании с молекулярным и цитологическим анализом дает возможность оценить фенотипический эффект встроенных последовательностей ДНК, т.е. влияние трансгенов на экспрессию генов реципиентного организма.
Молекулярно-генетические исследования последних лет показали связь между
межгенерационной нестабильностью микро- и минисагеллитных
з последовательностей и возникновением ряда тяжелых нейромышечных и нейродегеперативных наследственных болезней человека (Гайцхоки, Паткин, 2000), а также эпилепсии, инсулинозависимого диабета, эмбриональной летальности и многих других патологий (Bois, 2003). В то же время, на сегодняшний день идентифицировано только два наследственных заболевания, связанных с нарушениями в сателлитной ДНК - это ICF синдром (Xu et al, 1999) и синдром Робертса (Barbasa ct al, 2000) В первом случае, нестабильность центромерной сателлитной ДНК обусловлена гипометилированием данной последовательности в раннем эмбриогенезе, которое приводит к аномальной хромосомной организации центромер, проявляющейся в виде цитологически регистрируемых пара- и перицентромерных перестроек (Xu ct al, 1999) Во втором случае, изменения в а-сателлитной ДНК являются причиной нарушений в структуре гетерохроматина и асинхронной репликации этой ДНК в сестринских хроматидах. Кроме того, был описан случай амплификации а-сателлитной ДНК, приводящей к хромосомным перестройкам в опухолевых клетках (Gissclsson et al, 1999). Относительно небольшое количество описанных патологий, вызванных нестабильностью макросателлитной ДНК, может быть обусловлено, в первую очередь, методическими трудностями выявления структурных изменений сателлитной ДНК. Кроме того, даже незначительные, цитологически нерегистрируемые изменения в структуре макросателлитов могут быть существенными для нормального эмбрионального развития, и поэтому зародыши с мутантной сателлигной ДНК, вероятнее всего, будут нежизнеспособны.
Ранее в Отделе молекулярной генетики ИЭМ было показано, что в двух линиях мышей, трансгенных по повторяющейся единице бычьей центромерной сателлитной ДНК IV (Sat), не имеющей гомолога в мышином геноме, на протяжении 2-х поколений наблюдается межгенерационная структурная нестабильность трансгена (Попов и др., 2000, Сучкова и др., 2004,). Интересно отметить, чго в одной из линий происходило формирование эктопического интерстициального, выявляемого при помощи С-окрашивания гетерохроматина на одной из хромосом с интегрировавшим Sat (Попов и др., 2000,). В то же время, не меньший интерес представляет характер наследования Sat-трансгена в дальнейших скрещиваниях, т.е. возможные отдаленные
последствия инссрціш некодируюіних гетерогенных по своему нуклеотидному составу последовательностей ДНК.
Суммируя вышесказанное, можно сделать вывод, что иисерция чужеродных негомологичных сателлитных последовательностей в геном мышей и клеток мышиной эмбриональной карциномы, подобных клеткам ВКМ, дает возможность оценить относительную роль межгенерационной и соматической нестабильности таких ДНК в возникновении фенотипических нарушений, в том числе в формировании эктопического гетерохроматина, на ранних стадиях эмбриогенеза. Кроме того, исследование транссателлитных мышей позволяет выявить возможные зависимые от пола носителя іранссателлита и пола родителя отличия в стабильности чужеродного сателлита и последствиях его интеграции. Учитывая, с одной стороны, твердо установленную связь между уровнем метилирования ДНК и эпигенетической регуляцией генной экспрессии, особенно моноаллельной, а с другой стороны, влияние метилирования на стабильность повторов (Nichol, Pearson, 2002), важно также исследовать уровень метилирования чужеродного сателлита как у трангненных по нему мышей, так и в траенфектных по нему клеточных клонах.
Таким образом, представляется актуальным комплексное исследование чужеродной сатеЛлитной ДНК in vivo, на примере трансгенных мышей как минимум на протяжении 4-6 поколений, и in vitro, ira примере трансфектных клеточных клонов с различными сайтами интеграции и числом копий транссателлита. 1.2. Цель и задачи исследования
Целью работы явилось изучение особенностей межгенерационной и соматической передачи нскодирующей повторяющейся ДНК на примере бычьей ценіромерной сателлитиой ДНК и связанных с эгим эффектов у трансгенных мышей и в трансфектных клетках мышиной эмбриональной карциномы линии F9.
В задачи работы входило:
-
определить особенности наследования Sat-трансгена в линии №21 трансгенных мышей;
-
исследовать возможные эффекты, вызванные Sat-инсерцией, у трансгенных животных;
-
определить характер метилирования Sat у трансгенных мышей и в трансфектных клетках F9;
-
картировать Sat у трансгенных мышей и в трансфертных клонах F9;
-
изучить цитологически выявляемые эффекты в трансфектных клетках Г-'9, вызванные интеграцией Sat;
-
сопоставить эффекты и поведение Sat-трансгена in vivo и in vitro.
1.3. Научная новизна исследования
Впервые показано, что чужеродная сатсллитная ДНК'характеризуется подобным импринтированному наследованием у трансгенных по ней мышей.
Чужеродная некодирующая сателлитная ДНК в гемизиготном состоянии приводит к повышенной частоте образования опухоли молочной железы у трансгенных самок, а также к поведенческим нарушениям, не приводя при этом к фенотипическим отклонениям у трансгенных самцов.
Впервые показано, что в трансфектных по сателлитной ДНК клонах стволовых клеток эмбриональной карциномы F9 наблюдается полиморфизм по амплификации и элиминации сателлитной ДНК в зависимости от сайта ее интеграции и копийности. При амплификации транссателлита было выявлено формирование больших блоков эктопического гетерохроматииа ДНК клеток-реципиентов в одних случаях и последовательностью самого трансгена в другом.
1.4. Теоретическая и практическая значимость работы
Представленная работа по изучению поведения и последствий интеграции бычьей сателлитной ДНК в геном мыши in vivo и in vitro носит фундаментальный характер. Результаты исследования расширяют и дополняют сложившееся в настоящее время представление о нестабильном поведении повторяющихся последовательностей ДНК. Негатипные фенотипические эффекты у гемизиготных но чужеродной некодирующей повторяющейся ДНК трансгенных мышей служат подтверждением тому, что повторяющаяся ДНК может влиять на экспрессию прилегающих к ней генов, т.е. выступать в качестве г/ис_РегулятоРнои последовательности. Это указывает на важность исследования не только мутаций в кодирующих генах, но и различных повторяющихся последовательностей ДНК, особенно в гаметогенезе и раннем эмбриогенезе, в ходе дифференцировки клеток. Использование грансфектных клеток мышиной эмбриональной карциномы позволяет оценить повеление экзогенного сателлита и эффекты, вызванные его инсерцией на хромосомном уровне, и указьіваеі на необходимость комплексного исследования
6 повторяющихся последовательностей ДНК как in vivo, так и in vitro для понимания возможных эффектов нестабильности такой ДНК на экспрессию генов.
Результаты данной работы могут быть особенно интересны для практического применения в области генной терапии с использованием культуры стволовых клеток мышей и человека.
1.5. Основные положения, выносимые на защиту
-
Чужеродная сателлитная ДНК у трансгенных мышей в ряду поколений имеет разную стабильность в зависимости от пола прародителя.
-
В гемизиготном состоянии некодирующая центромерная бычья сателлитная ДНК приводит к повышенной частоте возникновения рака молочной железы, воспалительным процессам репродуктивной системы и каннибализму у трансгенных самок, не вызывая при этом каких-либо фенотипических отклонений у траснгенных самцов.
-
При трансфекции в клетки мышиной эмбриональной карциномы линии F9 бычья сателлитная ДНК интегрирует в различные участки генома в разных клонах, но, как правило, вблизи гетерохроматиновых районов.
4. Интегрировавшая в клетки F9 сателлитная ДНК способна к амплификации,
приводя к неогетерохроматинизации соседних первоначально эухроматиновых
участков хозяйской ДНК, не являясь при этом гетерохроматинизированной.
1.6. Личный вклад диссертанта
Диссертантом лично был проведен анализ трансгенных мышей линии №21 с 3-го по 5-е поколения, определено состояние метилирования чужеродного сателлита у трансгенных животных 1-5-го поколений и в трансфектных клетках F9, картирован транссателлит у трансгенных мышей и в трансфектных клонах, проведен молекулярно-цитогенетический анализ транссателлитных клонов F9. Автором самостоятельно выполнена статистическая обработка полученных результатов и подготовлен текст диссертации.
Автор признателен ст.н.с, к.б.н. Сучковой И.О. за определение копийности чужеродного сателлита у трансгенных мишей и в трансфектных клонах F9 и анализ 0-2-го поколений трансгенных мышей линии №21, н.с, к.б.н. Барановой Т.В. эа предоставленные результаты молекулярно-цитогенетического анализа двух субклонов одного из трансфектных клонов клеток F9, д.м н. Забежинскому М А. за
проведение гистологического анализа опухолей молочной железы трансгенных самок.
1.7. Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы из 309 источников, из них -296 зарубежных авторов. Текст диссертации иллюстрирован 23 рисунками и 1 таблицей.
1.8. Апробация работы
