Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Общая морфология, цитохимия и ультраструктура тучных клеток 10
2.2. Гипотезы происхождения тучных клеток 11
2.3. Локализация клеток-предшественников ТК 15
2.4. Миграция и дифференцировка предшественников ТК 19
2.5. Субпопуляции тучных клеток 21
2.6. Протеазы тучных клеток 23
2.7. Медиаторы тучных клеток и их биологические эффекты 26
2.8. Активация тучных клеток 27
2.9. Взаимосвязь тучных клеток и териналей нервных волокон 28
2.10. Характеристика тучных клеток тимуса 34
2.11. Заключение 37
3. Материалы и методы исследования 39
3.1. Характеристика исследованного материала 39
3.2. Подготовка материала для гистологического исследования 39
3.3. Обзорные окраски 39
3.4. Гистохимическое исследование тучных клеток тимуса 40
3.5. Иммуноцитохимическое исследование тучных клеток тимуса 41
3.6. Изучение пространственной взаимосвязи тучных клеток и нервных волокон в тимусе
3.6.1. Разработка оригинальной методики одновременного выявления тучных клеток и терминалей нервных волокон в тимусе
3.6.2. Изучение пространственной взаимосвязи тучных клеток с катехоламинергическими нервными волокнами в тимусе 46
3.7. Выявление в тимусе мыши фибронектина методом флуоресцентной микроскопии
3.8. Фотографирование объектов при микроскопии в проходящей свете и флуоресцентной микроскопии
3.9. Количественная обработка и статистический анализ данных 46
4. Результаты исследования 48
4.1. Результаты исследования популяции тучных клеток тимуса мыши на разных стадиях онтогенеза 57
4.1.1. Результаты окраски препаратов толуидиновым синим 48
4.1.2. Результаты окраски препаратов альциановым синим и сафранином
4.1.3. Результаты постановки иммуноцитохимической реакции на mMCP-4
4.1.4. Результаты применения оригинальной методики одновременного выявления тучных клеток и нервных терминалей
4.2. Результаты исследования препаратов тимуса на разных стадиях акцидентальной инволюции 72 84
4.2.1. Результаты гистохимического исследования общей морфологии тимуса (с применением окрасок гематоксилин- эозином и анилиновым синим)
4.2.2. Результаты выявления фибронектина в тимусе мыши методом флуоресцентной микроскопии
4.2.3. Результаты окрашивания тучных клеток тимуса толуидиновым синим
4.2.4. Результаты окрашивания тучных клеток тимуса альциановым синим и сафранином
4.2.5. Результаты иммуноцитохимической идентификации тучных клеток тимуса
5. Обсуждение результатов 89
6. Заключение 102
7. Выводы 103
8. Список сокращений 104
9. Список литературы
- Локализация клеток-предшественников ТК
- Гистохимическое исследование тучных клеток тимуса
- Результаты окраски препаратов альциановым синим и сафранином
- Результаты выявления фибронектина в тимусе мыши методом флуоресцентной микроскопии
Введение к работе
Актуальность темы исследования. После того, как в середине 1970-х гг окончательно сформировался взгляд на тимус как на центральный орган иммунной системы, его изучение стало одним из магистральных направлений иммунологических исследований, которое не теряет своей актуальности и в настоящее время (Zdrojewicz et al., 2016). На сегодняшний день накоплен огромный массив экспериментальных данных, касающихся изучения разных аспектов дифференцировки, селекции и миграции Т-лимфоцитов (Vacchio et al., 2016). Интенсивно изучаются также вовлеченные в данные процессы клетки тимического микроокружения – эпителиальные клетки, дендритные клетки, макрофаги (Кветной и соавт., 2005; Gameiro et al., 2010; Manley et al., 2011; Nitta, Suzuki, 2016). Однако, еще одна важнейшая клеточная популяция тимуса – тучные клетки (ТК) – остается на сегодняшний день слабо охарактеризованной. При этом тимус по количеству тучных клеток занимает второе место после кожи, а по функциональной активности ТК (степени дегрануляции и синтетической активности) сопоставим с ней (Арташян и соавт., 2006). Это, с одной стороны, ставит вопрос о возможной роли тимуса в развитии предшественников ТК (Ginsburg, 1963; Taghon et al., 2007; Winandy, Brown, 2007), что делает актуальным детальное изучение процессов генеза и созревания тучных клеток в тимусе как в ходе онтогенеза, так и в условиях развития патологического процесса. С другой стороны, столь значительное количество ТК в тимусе и их высокая функциональная активность косвенно свидетельствуют о важной, но остающейся на сегодняшний день не до конца понятной роли ТК в тимусе (Ribatti, Crivellato, 2016). Это особенно существенно в связи с имеющимися в литературе экспериментальными данными, свидетельствующими о том, что за счет содержания большого количества разнообразных биологически активных веществ тучные клетки могут функционировать в качестве местной и относительно автономной регуляторной системы. Иными словами, совокупность ТК конкретного органа может быть рассмотрена в качестве самостоятельной инкреторной системы, играющей важную роль в жизнедеятельности конкретного органа как в норме, так и при развитии патологического процесса (Мотавкин, Черток, 1980; Черток, Коцюба, 1993; Жданов и соавт., 2003; Коцюба и соавт., 2008; Арташян и соавт., 2012). В связи с этим изучение органных особенностей структурно-функциональной организации тучных клеток тимуса на разных стадиях онтогенеза и в условиях развития патологии является актуальной задачей.
Степень разработанности темы. В литературе имеются данные, свидетельствующие о присутствии ТК в тимусе амфибий, птиц и млекопитающих (Bodey et al. 1987; Bigaj et al. 1991; Xu et al. 1993; Goldstein, 1966; Wight, 1970; Frazier, 1973; Kendall, Warley, 1986). При этом сведения о локализации данных клеток в пределах тимической дольки противоречивы (Barbini et al., 1981; Kendall, Blackett, 1984; Abou-Rabia, Kendall, 1994; Crivellato et al., 2005) и часто приводятся как вторичные, без обсуждения возможного функционального значения обнаруженной локализации ТК. Данные об особенностях эмбриональных тучных клеток тимуса единичны (Crivellato et al., 2005; Федорова, 2009), а комплексного исследования, посвященного изучению генеза тимических тучных клеток до настоящего времени выполнено не было. Открытым остается вопрос о функциях ТК тимуса (Ribatti, Crivellato, 2016). Ряд исследователей отмечает четкую тенденцию локализации тимических ТК вокруг кровеносных сосудов, а также вблизи нервных волокон тимуса, что, по мнению авторов, свидетельствует о функциональной взаимосвязи этих элементов (Lorton et al., 1990, Muller,
1991, Weihe et al., 1989, Bulloch et al., 1991; Williams, Felten, 1981). В то же время, при проведении исследований, направленных на изучение со-локализации ТК с элементами нервной системы, не было использовано специальных методов идентификации нервных терминалей. В связи с этим результаты данных исследований нельзя с полной уверенностью трактовать как доказательства функционального взаимодействия тимических ТК и нервных волокон.
В последнее время возрос интерес исследователей к роли тучных клеток в развитии патологии тимуса. В исследованиях, посвященных изучению данной клеточной популяции при развитии тимомы (Raica et al., 2010), миастении гравис (myasthenia gravis) (Raica et al., 2007), возрастной и индуцированной инволюции (Goldstein, Mackay, 1969; Kiseleva et al., 1998; Marinova et al., 2007), было показано существенное увеличение количества тимических ТК, что закономерно ставит остающийся на сегодняшний день открытым вопрос об источнике новых тучных клеток в тимусе. Отмеченное увеличение дегрануляционной активности ТК при индуцированной инволюции тимуса (Арташян и соавт., 2006) указывает на возможный вклад тучных клеток в развитие данной патологии, ставя вопрос о функциях тимических ТК, на который в настоящее время также нет однозначного ответа.
Целью работы стало изучение структурных и функциональных особенностей тучных клеток тимуса мыши в ходе онтогенеза и при акцидентальной трансформации.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
описать морфологию и локализацию тучных клеток тимуса мыши на разных стадиях онтогенеза;
-
изучить взаимное расположение тучных клеток и терминалей нервных волокон в тимусе мыши в ходе онтогенеза;
-
изучить изменения численности, локализации и дегрануляционной активности тучных клеток в тимусе мыши в ходе акцидентальной трансформации;
-
определить степень зрелости тучных клеток тимуса на разных стадиях онтогенеза и в ходе акцидентальной трансформации.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование популяции тучных клеток тимуса мыши в ходе онтогенеза и при акцидентальной трансформации. Определены сроки появления ТК в тимусе мыши в ходе эмбрионального развития. Показано, что в ходе онтогенеза тучные клетки созревают непосредственно в тимусе: они выявляются в органе на поздних стадиях эмбриогенеза в виде незрелых клеток и клеток промежуточной степени зрелости и завершают свое созревание у половозрелых животных. В тимусе старых мышей обнаружена реактивация процесса созревания ТК. Благодаря применению оригинальной методики одновременного выявления тучных клеток и нервных терминалей показана пространственная взаимосвязь тимических ТК с терминалями нервных волокон, которая устанавливается в тимусе половозрелых животных и сохраняется при старении. Установлено, что часть нервных волокон, со-локализованных в тимусе с ТК, являются катехоламинергическими. Впервые проведено количественное и качественное исследование популяции тучных клеток тимуса в ходе индуцированной введением гидрокортизона атрофии тимуса. Показано, что на этапах восстановления органа после инволюции (48-96 ч после введения гидрокортизона) имеет место достоверное увеличение количества ТК в тимусе, а также изменение распределения данных клеток по компартментам органа по сравнению с контролем. Доказано, что как и в ходе онтогенеза, после индуцированной
введением гидрокортизона акцидентальной трансформации ТК проходят ряд этапов созревания непосредственно в тимусе, перемещаясь по мере созревания из внутридольковых компартментов органа к капсуле и септам. Выявлено возрастание дегрануляционной активности тимических тучных клеток в ходе акцидентальной трансформации, что может быть свидетельством их функциональной вовлеченности в развитие данного процесса. Показано наличие в гранулах ТК тимуса мышиной тучноклеточной протеазы-4 (mMCP-4) и отмечена корреляция между количеством и распределением mMCP-4-позитивных ТК и плотностью соединительной ткани в корковом веществе тимуса в ходе его восстановления после акцидентальной трансформации.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы состоит в получении приоритетных данных о структурно-функциональных особенностях популяции тучных клеток тимуса мыши на разных стадиях онтогенеза и при акцидентальной трансформации. Полученные сведения об особенностях морфологии, цитохимии и локализации ТК вносят существенное дополнение в имеющиеся представления о данной клеточной популяции тимуса, которая до настоящего времени оставалась слабо охарактеризованной. Получение морфологических свидетельств наличия в тимусе мыши контактов между тучными клетками и нервными терминалями является существенным уточнением имеющихся данных о пространственной взаимосвязи ТК и нервных волокон. Подробное описание процесса созревания тучных клеток в тимусе в ходе онтогенеза расширяет существующие представления о закономерностях генеза ТК, а обнаружение реактивации данного процесса в ходе индуцированной инволюции может быть рассмотрено как аргумент в пользу гипотезы тимического происхождения ТК. Практическую значимость имеют результаты работы, связанные с разработкой нового метода одновременного выявления ТК и терминалей нервных волокон. Разработанный протокол позволяет с высокой избирательностью и хорошей воспроизводимостью выявлять ТК и терминали нервных волокон любой медиаторной принадлежности на парафиновых срезах тимуса млекопитающих. Практическую значимость могут иметь также результаты, касающиеся реактивации процесса созревания тучных клеток в тимусе в ходе акцидентальной трансформации. Полученные в рамках представленной работы данные свидетельствуют о том, что введение мышам гидрокортизона способствует инициации процесса созревания тучных клеток в тимусе мыши. Это обстоятельство может послужить основой для использования инъекции животным гидрокортизона в качестве удобной модели для исследования процесса генеза тучных клеток в целом.
Методология и методы исследования. При проведении научно-исследовательской работы в рамках представленного диссертационного исследования в методологическом плане применялась совокупность различных методов. С целью изучения популяции тучных клеток тимуса на разных стадиях онтогенеза образцы тимуса были взяты у белых нелинейных мышей 4-х возрастных групп: I – эмбрионы 15-21 дн. (n=35), II – новорожденные животные (n=9), III – половозрелые животные (3-4 мес., n=5), IV – старые животные (1-1,5 года, n=5). Для индукции акцидентальной трансформации тимуса (с целью исследования динамики популяции ТК тимуса при развитии данной патологии) использовали известную модель однократного введения животным в брюшную полость гидрокортизона. Эксперимент выполнен на половозрелых самцах белых нелинейных мышей возрастом 3-4 мес. (n=30). Образцы тимуса получали через 12, 24, 48, 72, 96 и 192 ч после
инъекции. Для проведения общего морфологического исследования тимуса использовали классическую гистохимическую окраску гематоксилином и эозином. Для характеристики соединительной ткани тимуса применяли окраску анилиновым синим (для идентификации коллагена), а также проводили иммуногистохимическую реакцию на фибронектин с последующей визуализацией продукта реакции с помощью метода флуоресцентной микроскопии. Для характеристики популяции ТК использовали гистохимические и иммуноцитохимические методы: метод окраски толуидиновым синим, альциановым синим и сафранином, метод иммуноцитохимической идентификации ТК с применением антител против мышиной тучноклеточной протеазы-4. Для одновременного выявления ТК и нервных терминалей использовали оригинальную методику, основанную на гистохимической идентификации ТК альциановым синим и иммуногистохимической идентификации синаптофизина. Полученные количественные данные обрабатывали с помощью программы Statistica (Stat Soft Inc., США).
Положения, выносимые на защиту:
1. В ходе онтогенеза тучные клетки созревают непосредственно в тимусе,
перемещаясь по мере созревания из внутридольковых компартментов органа в сторону
капсулы и септ.
-
В постнатальном онтогенезе в тимусе мыши формируется пространственная взаимосвязь тучных клеток с терминалями нервных волокон. По меньшей мере часть нервных волокон, со-локализованных в тимусе с ТК, являются катехоламинергическими.
-
При развитии акцидентальной трансформации тимуса увеличение количества тучных клеток, наблюдаемое на стадиях восстановления органа после инволюции (48-96 ч после введения гидрокортизона), является следствием реактивации процесса созревания тучных клеток непосредственно в тимусе.
4. Тучные клетки функционально вовлечены в процесс восстановления тимуса после
инволюции, вызванной введением гидрокортизона, о чем свидетельствует усиление их
дегрануляционной активности в ходе акцидентальной трансформации. Одной из вероятных
функций ТК в данном процессе является участие в деградации соединительной ткани за счет
активности специфической химазы – мышиной тучноклеточной протеазы-4 (mMCP-4),
содержащейся в гранулах тимических ТК.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности полученных результатов обусловлена большим объемом экспериментального материала (n=84), использованием адекватных морфологических методов исследования, среди которых как классические гистохимические методы, так и современные методы иммуногистохимии и флуоресцентной микроскопии, а также корректными методами статистического анализа данных.
Результаты работы были представлены в качестве устных и стендовых докладов на XXI научном совещании "Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии", посвященном 80-летию со дня рождения профессора А.А.Клишова (Санкт-Петербург, 2010), Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Вченi майбутнього» (Одесса, Украина, 2012), ХII Конгрессе Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2013), 17-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2013), XX
Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013»
(Москва, 2013), XIX Всероссийской научно-практической конференции
«Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург, 2013), IV Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2013), XIX Санкт-Петербургской ассамблеи молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2014), V Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2015), 4th European Congress of Immunology (ECI 2015) (Vienna, Austria, 2015), XXI Всероссийской научно-практической конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург, 2016), 20th CIMO Winter School «Brains, genes, drugs and languages: crossroads in science» (Tvrminne zoological station of the University of Helsinki, Finland, 2016), 19th Symposium of biology students in Europe «SimBioSE 2016» (Lisboa, Portugal, 2016), 8th EFIS-EJI South Eastern European Immunology School (SEEIS2016) (Durres, Albania, 2016).
По материалам диссертации опубликовано 25 работ, из которых 9 являются статьями, опубликованными в журналах, рекомендованных ВАК.
Личное участие автора в получении результатов. Планирование, подготовка и проведение эксперимента, получение материала для гистологического исследования, изготовление гистологических срезов, проведение гистохимических окрасок препаратов и постановка иммуноцитохимических реакций, получение микрофотографий, проведение статистической обработки полученных данных и их анализ, интерпретация результатов, их трактовка и обобщение выполнены автором лично.
Структура и объём диссертации. Работа построена по традиционному плану и включает введение, обзор литературных данных, описание материалов и методов исследования, изложение экспериментальных результатов, их обсуждение и выводы. Работа изложена на 127 страницах, содержит 4 таблицы и 47 иллюстраций, в том числе 6 рисунков, 13 графиков и диаграмм, 28 микрофотографий. Библиографический указатель содержит 237 источников, в том числе 44 – на русском языке и 193 – на иностранных языках.
Локализация клеток-предшественников ТК
Гипотеза о том, что тучные клетки составляют самостоятельную категорию клеток соединительной ткани и формируются из других ее клеток была сформулирована ещё П. Эрлихом в его докторской диссертации (1877) и впоследствии поддержана Rosenheim (1886), Cajal (1890), Unna (1891), Pappenheim (1904), Carlier (1893), Kanthack and Hardy, Marschalkо (1895), Calleja (1896), Harris (1900), Meirowsky (1908) и др. (по Michels, 1938).
Audry (1896) впервые предположил, что ТК могут формироваться из всех типов клеточных элементов соединительной ткани. Эту гипотезу поддержали Pappenheim, Sabrazbs, Downey (1913). К.М. Данилова высказала аналогичное предположение, согласно которому ТК формируются в зависимости от условий и функционального состояния соединительной ткани в целом, т.е. тучные клетки как клетки sui generis в соединительной ткани не существуют, а возникают из других ее клеточных элементов. При этом происхождение тканевых ТК автор связывала с гистиоцитами, а сосудистых ТК – с адвентициальными клетками (Данилова, 1958). Данная гипотеза отчасти подтверждается данными С. Velican и D. Velican, которые вводили морским свинкам меченый гепарин через дыхательные пути и наблюдали его накопление в виде гранул в ретикулярных клетках, моноцитах, фибробластах с их последующим преобразованием в ТК (Velican, Velican, 1958).
Гипотеза нервного происхождения тучных клеток была предложена M. Okun на основании способности тучных клеток в определенных условиях синтезировать меланин (Okun, 1965). Позднее эта точка зрения была опровергнута A. Andrew и B.B. Rawaon. Они продемонстрировали возможность развития тучных клеток в трансплантате энтодермы и мезодермы цыпленка в отсутствие производных нервного гребня и таким образом показали, что потенциальная возможность различных типов клеток синтезировать один и тот же продукт не всегда связана с общностью их эмбрионального происхождения (Andrew, Rawaon, 1987). Среди гипотез, представленных ниже – рассматривающие в качестве возможных предшественников тучных клеток базофилы, фибробласты, гистиоциты, ретикулярные клетки, моноциты-макрофаги, лимфоциты.
Гипотеза происхождения тучных клеток из базофилов крови возникла одной из первых. Однако дальнейшее изучение ТК соединительной ткани с помощью электронного микроскопа не подтвердило большого морфологического сходства этих клеток. Обнаруженные существенные структурные различия гранул тучных клеток и базофилов, а также отсутствие переходных форм между ними и тот факт, что развитие ТК требует в культуре условий, отличных от условий дифференцировки базофилов, даже на фоне цитохимического сходства, свидетельствуют о принадлежности этих клеток к разным линиям дифференцировки (Ishizaka et al., 1989). Тем не менее, в настоящее время рядом авторов высказывается идея онтогенетического родства между тучными клетками и базофилами, основанная на идентификации т.н. бипотентного прародителя, который, дифференцируясь, формирует как базофилы, так и ТК. В экспериментах на мышах установлено, что бипотентные клетки-предшественники тучных клеток/базофилов определяются в большом количестве в селезенке и кишечнике (Arinobu et al., 2005). В сущности, данная гипотеза постулирует костномозговое происхождение ТК, детали которого рассмотрены ниже.
S. Bensley (1952), G. West (1959), В.А. Юсин и Ф.Ф. Султанов (1969) отстаивали гипотезу фибробластического происхождения тучных клеток, однако экспериментально возможность трансформации ТК из фибробластов не была подтверждена (Чертков, Фриденштейн, 1977). Такого же мнения о природе ТК изначально придерживался В.В. Виноградов, но позже он отказался от гипотезы фибробластического происхождения тучных клеток, считая их, на основании данных электронной микроскопии, специализированной разновидностью клеток моноцитарно-макрофагального ряда (Виноградов, Воробьева, 1973).
Переходя к рассмотрению моноцитарной гипотезы происхождения тучных клеток, важно отметить опыты A. Thiede и соавт. (Thiede et al., 1971). В ходе своих исследований авторы описали деструкцию макрофагов и предшествующее ей разрушение тканевых ТК подколенного лимфатического узла крыс под действием антимакрофагальной сыворотки (АМС). На основании полученных результатов авторы предполагают возможность существования общих антигенов для ТК и макрофагов, что в свою очередь, по их мнению, указывает на цитогенетическое родство двух клеточных элементов. Обращаясь к вопросу происхождения ТК, A. Thiede и соавт. указывают на то, что циркулирующий моноцит крови – единственный клеточный тип, отвечающий всем признакам, характеризующим предшественников ТК. К таким признакам авторы относят способность к миграции и проявление NASDCE-эстеразной активности. Наряду с ТК, хлорацетатная эстеразная активность присутствует только в нейтрофилах, начиная со стадии промиелоцита – объяснение этого факта авторы находят в том, что, в соответствии с моноцитарной гипотезой, ТК являются потомками миелоидной клетки (Thiede et al., 1971).
Несмотря на кажущуюся стройность данной гипотезы, анализируя результаты описанных выше экспериментов с точки зрения современной методологии, приходится признать, что данные, полученные авторами, некорректно использовать как доказательство гистогенетического родства макрофагов и ТК. Это связано с тем, что разрушение макрофагов АМС предполагает активацию белков каскада комплемента, в ходе которой формируются факторы С3а, С3b и С5а, вызывающие мощную дегрануляцию ТК. Принимая во внимание способность тучных клеток к восстановлению гранул после дегрануляции, нельзя полностью исключить возможность того, что исчезновение ТК под действием АМС и последующее их восстановление отражают лишь процесс восстановления гранул ТК (это косвенно подтверждается сроками появления NASDCE-позитивных гранул у экспериментальных животных).
В качестве исходных клеточных элементов для тучноклеточной дифференцировки были рассмотрены и гистиоциты. К.К. Рудзит описал развитие ТК из гистиоцитов в молочных пятнах сальника крыс (Рудзит, 1953). Тесную связь между тучными клетками и гистиоцитами отмечал Н.Г. Хрущов (Хрущов, 1967). З.С. Володина наблюдала образование тучных клеток из гистиоцитов на препаратах подкожной рыхлой соединительной ткани человека: постепенно утрачивался ячеистый характер цитоплазмы гистиоцита, ядро принимало шаровидную форму, уменьшалось в размерах и по мере накопления гранул оттеснялось ими на периферию. Такая клетка морфологически была сходна с типичной тучной клеткой. Между ТК и гистиоцитами микроскопически наблюдались все переходные формы (Володина, 1968).
J.P. Guimaraes и D.M. Taylor описали образование тучных клеток из ретикулярных клеток (Guimaraes, Taylor, 1957). Эту гипотезу поддерживал V. Viklicky (1969). В своей работе по пересадке селезенки между двумя линиями аллогенных мышиных радиохимер, резко отличающихся по количеству тучных клеток в органе, автор показал соответствие числа ТК радиохимер количеству ТК линии реципиента, на основании чего и сделал вывод, что предшественниками тучных клеток селезенки являются стромальные ретикулярные клетки (другие возможные пути восстановления популяции при этом рассмотрены не были). Возникновение лимфоидной гипотезы происхождения ТК связано прежде всего с результатами многочисленных работ по культивированию лимфоидных тканей. Так, в работе H. Ginsburg по культивированию клеток тимуса и селезенки на монослое эмбриональных фибробластов было показано, что предшественниками тучных клеток в данной системе культивированных тканей являются мононуклеарные лимфоидные клетки – т.н. большие лимфоциты (в терминологии автора), морфологически идентичные примитивным клеткам лимфоидных тканей. H. Ginsburg подчеркивает такие свойства культур клеток тимуса, как почти полное отсутствие ТК вплоть до 12 дня развития in vitro и синхронизация процессов дифференцировки (Ginsburg, 1963). H. Ginsburg и D. Lagunoff описали условия дифференцировки тучных клеток из клеток лимфатического узла и грудного лимфатического протока мышей, иммунизированных лошадиной сывороткой. Полученные результаты также показали, что незрелые ТК могут появляться в суспензионных культурах лимфоидных клеток (Ginsburg, Lagunoff, 1967). J.W. Combs и соавт., на основании результатов, полученных в рамках исследований по изучению последовательности дифференцировки ТК в эмбрионе крыс, выделили четыре стадии развития тучных клеток. Первую стадию авторы охарактеризовали как группу лимфоцитоподобных клеток, неизменно окрашивающихся в ходе реакции альциановый синий – сафранин. Показано также, что восстановление популяции ТК после разрушения клеток или удаления их из тканей начинается с появления мелких лимфоидных клеток, содержащих в цитоплазме гранулы в начальной стадии созревания (Combs, 1965). D.M. Czarnetzki и соавт. (1979) в опытах по культивированию мононуклеарных клеток, выделенных из брюшной полости крыс, к концу второй недели в 90% случаев получали их дифференцировку в зрелые ТК.
Гистохимическое исследование тучных клеток тимуса
Важно отметить, что на сегодняшний день вопрос о функциях тучных клеток в тимусе продолжает оставаться открытым (Ribatti, Crivellato, 2016). Согласно Crivellato и соавт., факт формирования контактов ТК с дендритными клетками и внеклеточным матриксом в эмбриональном тимусе свидетельствует об участии ТК в процессах обновления внеклеточного матрикса тимуса в течение раннего органогенеза, что, в свою очередь, может влиять на миграцию тимоцитов и их дифференцировку. Накопление ТК в мозговом веществе тимуса и их тесные контакты с дендритными клетками, а также обнаруживаемая при этом частичная дегрануляция ТК, по мнению авторов, предполагают участие тучных клеток в процессах селекции Т-лимфоцитов (Crivellato et al., 2005). Сообщается, что ТК тимуса, за счет синтеза и высвобождения разнообразных факторов роста и цитокинов, таких как интерлейкин IL-1, -2, -3, -4, -6, TNF, GM-CSF, NGF и др., способны принимать активное участие в процессах тимопоэза, влияя на межклеточные взаимодействия, проницаемость гемато-тимического барьера и миграцию лимфоцитов (Кветной и соавт., 2005; Ribatti, Crivellato, 2016). Косвенным свидетельством в пользу данной гипотезы является отмеченный факт наличия четкой тенденции локализации ТК вокруг кровеносных сосудов тимуса (Кветной и соавт., 2005; Raica, Cimpean, 2009). Ряд исследователей также отмечает присутствие в тимусе млекопитающих пространственной взаимосвязи ТК с пептидергическими, норадренергическими и катехоламинергическими нервными волокнами (Lorton et al., 1990; Muller, 1991; Weihe et al., 1989; Bulloch et al., 1991; Williams, Felten, 1981). Здесь, однако, важно отметить, что при проведении исследований, направленных на изучение данной со-локализации, не было использовано специальных методов идентификации нервных терминалей. В связи с этим результаты данных исследований нельзя с полной уверенностью трактовать как доказательства функционального взаимодействия тимических ТК и нервных волокон, так как в данном случае со-локализация ТК с элементами нервной системы может быть следствием их сходной локализации (в пределах узких прослоек соединительной ткани). Тем не менее, некоторые авторы отмечают изменение количества ТК в тимусе в ответ на различные манипуляции с вовлечением нейроэндокринной оси (Barbini et al., 1981; Abou-Rabia, Kendall, 1994; Artico, 2002), что, несомненно, указывает на регуляторную роль нервной системы в отношении тимических ТК. Например, было показано, что электростимуляция верхнего шейного ганглия вызывает в тимусе усиление интенсивности флуоресценции катехоламинергических нервных волокон и ассоциированных с ними ТК (при использовании гистофлуоресцентного метода выявления катехоламинов), в то время как хирургическая симпактэктомия приводит к исчезновению флуоресценции нервных волокон, уменьшению количества гранул в тучных клетках тимуса и снижению интенсивности их флуоресценции (Artico, 2002).
За последние 10 лет сильно возрос интерес исследователей к роли тучных клеток в развитии патологии тимуса. Так, при исследовании образов тимуса, полученных от людей с диагностированной тимомой, было показано присутствие ТК исключительно в мозговом веществе тимуса (что в норме не характерно для тимических ТК), а также значительное увеличение их количества по сравнению с тимусом здоровых людей того же возраста и тимусом эмбрионов. Кроме того, в случае развития тимомы было отмечено наличие строгой пространственной ассоциации ТК с кровеносными сосудами, что, по мнению авторов, имеет функциональное значение и может способствовать созданию условий для активной пролиферации клеток опухоли (Raica et al., 2010). Аналогичные результаты были получены при исследовании образцов тимуса людей с миастенией gravis (гравис). В данном случае, как и при тимоме, наблюдалось значительное увеличение количества ТК, а также возрастание плотности кровеносных сосудов и строгая корреляция между ней и количеством ТК. Учитывая данные, свидетельствующие о наличии в гранулах ТК эндотелиального фактора роста сосудов (Grutzkau et al., 1998), логично предположить, что ТК могут вносить существенный вклад в процесс ангиогенеза в тимусе при развитии миастении. Кроме того, авторы обращают внимание на тот факт, что в условиях данной патологии увеличение количества ТК в тимусе происходит за счет появления новых тучных клеток в составе мозгового вещества тимуса, а не увеличения числа ТК в пределах капсулы и септ, где они в норме локализуются. Авторы подчеркивают, что данный феномен может быть объяснен активацией предшественника ТК, локализованного в мозговом веществе тимуса, и началом дифференцировки тучных клеток непосредственно в тимусе при развитии миастении gravis (Raica et al., 2007).
Данные об особенностях тучноклеточной популяции тимуса при развитии возрастной или индуцированной инволюции органа единичны и часто приводятся как вторичные, без объяснения возможного функционального значения тимических ТК. Так, было показано увеличение количества тучных клеток в тимусе в ходе возрастной инволюции. Причем в данном случае отмечается появление ТК в пределах мозгового вещества, что не характерно для тучных клеток функционально активного тимуса (Goldstein, Mackay, 1969). Увеличение количества тучных клеток в тимусе мышей происходит также в ходе инволюции, развивающейся на фоне роста клеток привитой опухоли (Kiseleva et al., 1998). Интересные данные были предоставлены О.С. Арташян и соавт., которые провели комплексное исследование популяции тучных клеток в условиях развития стресс-реакции. В частности, было показано, что при развитии стресс индуцированной инволюции тимуса имеет место снижение количества тимических ТК. По мнению авторов, это может быть следствием миграции тучных клеток из тимуса, который является местом формирования и депонирования ТК, в периферические органы и ткани (Арташян и соавт., 2006). Такое перераспределение ТК при стрессе может быть рассмотрено в качестве важного компонента общего адаптационного синдрома, который развивается в организме в ответ на воздействие экстремального фактора. При этом, наряду с изменением количества тимических ТК, после иммобилизационного стресса было показано существенное возрастание их дегрануляционной активности и направленное выведение биологически активных веществ, содержащихся в их гранулах, в сторону клеток-мишеней (Арташян и соавт., 2006), что указывает на вовлеченность ТК в процессы, происходящие при развитии инволюции тимуса. На участие ТК в процессах реорганизации тимуса в ходе инволюции указывают также результаты, полученные T. Marinova и соавт. (Marinova et al., 2007), которые обнаружили, что ТК тимуса человека, в норме локализованные в пределах капсулы, септ и субкапсулярных пространств и экспрессирующие фактор роста нервов (NGF), в ходе атрофии, вызванной различными инфекциями, значительно увеличиваются количественно, распределяются по всей строме тимуса и характеризуются увеличением секреции NGF. При этом более широкое распределение NGF-иммунопозитивных ТК во всех областях тимуса и увеличенная экспрессия NGF положительно коррелируют со степенью инволюционных изменений.
Результаты окраски препаратов альциановым синим и сафранином
Переходя к обсуждению результатов и их сопоставлению с данными литературы можно отметить, что в целом имеющиеся на сегодняшний день сведения о тучноклеточной популяции тимуса фрагментарны. Так, до настоящего времени не было выполнено комплексного исследования, посвященного изучению популяции тимических ТК в ходе онтогенеза. Проведение такого исследования в рамках представленной работы позволило идентифицировать ТК разной степени зрелости в тимусе мыши в ходе онтогенеза с помощью методики окраски альциановым синим-сафранином. S. Spicer в 1960 году постулировал, что альциановый синий/сафранин–окрашивание выявляет степень сульфатированности гепарина – обязательного компонента гранул ТК. Главным фактором, определяющим гистохимические свойства гепарина, является полианионный характер его молекулы, формирующийся за счет наличия большого количества кислых групп сульфата, расположенных вдоль полимерной цепи. Согласно литературным данным запасание гепарина в гранулах ТК включает в себя несколько этапов: синтез несульфатированного предшественника полисахарида, его накопление и параллельное присоединение сульфата к его аминогруппам, приводящее к формированию химически зрелого высокосульфатированного гепарина (Spicer, 1960). При использованном окрашивании альциановый синий обнаруживает определенную степень сродства к несульфатированному либо слабо сульфатированному предшественнику (чем меньше сульфата, тем больше сродство), который не связывается с сафранином, в то время как сафранин, наоборот, связывается исключительно с высокосульфатированным гепарином. Исходя из этого можно предположить, что те ТК, которые характеризуются наличием Alc+ гранул (ТК стадии I, II, III), содержат предшественник гепарина, обедненный N-сульфатом или с полным его отсутствием. В свою очередь, те клетки, которые имеют Saf+ гранулы (ТК стадии II,III,IV), содержат высокосульфатированный зрелый гепарин. Наличие гранул с промежуточным фиолетовым окрашиванием является тогда свидетельством присутствия в гранулах как несульфатированного предшественника полисахарида, так и зрелого гепарина, а относительное количество этих гранул может отражать этапность процесса созревания ТК.
Основываясь на этих данных, можно отметить, что полученные в рамках представленной работы данные об изменении степени зрелости тимических тучных клеток на разных стадиях развития свидетельствуют о том, что ТК созревают непосредственно в тимусе в ходе онтогенеза. Данный процесс у мышей начинается на поздних сроках эмбрионального развития с появления незрелых тучных клеток (ТК I) во внутридольковых компартментах тимуса и продолжается, приводя к формированию (в той же локализации) ТК промежуточной степени зрелости (ТК II/III). Доля ТК II/III увеличивается у новорожденных животных на фоне изменения их локализации и перемещения в капсулу и септы тимуса. Процесс созревания ТК завершается к моменту половой зрелости, о чем свидетельствует присутствие в тимусе половозрелых животных исключительно зрелых тучных клеток (ТК IV). Появление ТК разной степени зрелости в тимусе старых животных, где выявляются не только зрелые ТК (ТК IV), характерные для половозрелых мышей, но также ТК I и ТК II/III, характерные для тимуса эмбрионального и раннего постнатального периодов развития, указывает на (ре)активацию процесса мастоцитопоэза в тимусе мышей при старении. Последнее интересно с нескольких точек зрения. Во-первых, увеличение количества ТК в тимусе старых животных по сравнению со всеми остальными стадиями онтогенеза, особенно на фоне отмеченного увеличения дегрануляционной активности ТК на данной стадии, закономерно ставит вопрос о функциях ТК в тимусе при старении. Здесь важно отметить, что на всех исследованных стадиях онтогенеза для тучных клеток тимуса было показано наличие в гранулах mMCP-4 – специфической тучноклеточной химазы, главной функцией которой, согласно литературным данным, является участие в ремоделировании соединительной ткани (Tchougounova et al., 2005). В свою очередь, одним из главных признаков инволюции тимуса, развивающейся при старении, является существенное увеличение количества соединительной ткани (Gui et al., 2012). В данном контексте увеличение количества ТК, содержащих mMCP-4, при старении может быть тем механизмом, который сдерживает скорость процесса инволюции. Тем не менее, нельзя исключать и противоположную направленность активности ТК при развитии возрастной инволюции тимуса, так как для тучных клеток хорошо известна роль в регуляции физиологической активности фибробластов и развитии фиброза (Кутукова, Назаров, 2014). Во-вторых, (ре)активация процесса мастоцитопоэза в тимусе старых животных ставит вопрос о природе и локализации предшественников ТК. В частности, не ясно, присутствуют ли клетки-предшественники ТК в тимусе постоянно и активируются в ходе старения или же данные предшественники направленно мигрируют в тимус животных при старении.
Изменение характера распределения тучных клеток разной степени зрелости по компартментам тимуса в ходе онтогенеза создает впечатление пространственной направленности процесса созревания ТК: их появления и начала созревания в мозговом и глубоком корковом веществе тимуса с последующим перемещением (по мере созревания в ходе онтогенеза) в сторону капсулы и септ органа. Полученные данные о смене локализации ТК в ходе онтогенеза частично согласуются с имеющимися в литературе сведениями. Так, было показано, что ТК присутствуют в медуллярной и кортикальной зонах эмбрионального тимуса человека, при этом часто обнаруживаясь в непосредственной близости от телец Гассаля и стенок сосудов (Федорова, 2009). Интересные данные об эмбриональных ТК тимуса предоставлены E. Crivellato и соавт. (Crivellato et al., 2005). Изучая развитие куриного эмбриона, они показали, что тучные клетки появляются в тимусе на поздних стадиях эмбриогенеза. При этом около 80% ТК локализуются в мозговом веществе тимуса, в корковом веществе они менее многочисленны, а в пределах капсулы и септ идентифицируются крайне редко. Эти данные согласуются с полученными в рамках представленной диссертации сведениями о тучноклеточной популяции тимуса мышиного эмбриона. Тучные клетки в эмбриональном тимусе мыши идентифицируются начиная с 19 дня эмбриогенеза. Как и в случае куриного эмбриона, ТК в тимусе мыши на протяжении всего эмбриогенеза локализуются преимущественно в составе мозгового и глубокого коркового вещества в виде единичных вкраплений среди тимоцитов и эпителиальных клеток и лишь единичные ТК обнаруживаются в составе капсулы и септ эмбрионального тимуса. Ранее было высказано несколько гипотез относительно функционального значения внутридольковой локализации эмбриональных ТК тимуса. Данные электронно-микроскопических исследований тучных клеток тимуса цыплят на разных стадиях эмбриогенеза свидетельствуют о формировании контактов тучных клеток с дендритными клетками и внеклеточным матриксом (Crivellato et al., 2005). Последнее, по мнению авторов, может указывать на вовлеченность ТК в процессы обновления внеклеточного матрикса в течение раннего органогенеза, что в свою очередь должно иметь важное значение для осуществления процессов миграции тимоцитов в ходе их дифференцировки (Crivellato, 2005). Этой гипотезе не противоречат полученные данные о накоплении в эмбриональных тучных клетках мышиной тучноклеточной протеазы-4 (mMCP-4). Идентификация mMCP 4-позитивных ТК в эмбриональном тимусе, для которого характерно присутствие незрелых в отношении сульфатированности гепарина тучных клеток (что было показано нами при окраске альциановым синим-сафранином), свидетельствует о том, что ТК начинают синтезировать и накапливать данную протеазу уже на самых ранних этапах своего созревания, сохраняя данную способность на протяжении всего онтогенеза. Последнее обстоятельство также может быть косвенным свидетельством в пользу важной функциональной роли mMCP-4, секретируемой ТК в тимусе. Crivellato и соавт. отметили также формирование тесных контактов ТК с дендритными клетками в мозговом веществе тимуса куриного эмбриона, что, по мнению авторов, может указывать на участие тучных клеток в процессах селекции Т-лимфоцитов. Косвенным подтверждением функциональной вовлеченности тимических тучных клеток в такие процессы, как миграция, дифференцировка и селекция Т-клеток авторы считают показанную частичную дегрануляцию внутридольковых ТК в тимусе куриного эмбриона (Crivellato, 2005). В свою очередь, в эмбриональном тимусе мыши было отмечено присутствие тучноклеточных гранул, лежащих вне цитоплазмы ТК, но в непосредственной близости от плазматической мембраны, что, очевидно, также является признаком дегрануляционной активности эмбриональных тучных клеток тимуса мыши и служит косвенным подтверждением вовлеченности данных клеток в процессы раннего органогенеза.
Результаты выявления фибронектина в тимусе мыши методом флуоресцентной микроскопии
Интересно отметить, что гистологическая картина созревания ТК в тимусе в ходе акцидентальной трансформации оказывается практически идентичной тому, что было показано для ТК в ходе онтогенеза: локализация наиболее незрелых тучных клеток (ТК I) в тимусе в ходе восстановления после акцидентальной трансформации совпадает с расположением незрелых ТК в эмбриональном органе, а локализация максимально зрелых ТК (ТК IV) – с расположением зрелых тучных клеток в тимусе половозрелых животных, а также с локализацией в тимусе нервных окончаний. Вновь обращаясь к обсуждению феномена взаимодействия ТК и нервных терминалей в тимусе, но уже в контексте развития индуцированной инволюции, следует упомянуть работу T. Marinova и соавт. (Marinova et al, 2007), которые обнаружили, что ТК тимуса человека, в норме экспрессирующие фактор роста нервов (NGF), в ходе атрофии, вызванной различными инфекциями, значительно увеличиваются количественно, распределяются по всей строме тимуса и характеризуются повышенной секрецией NGF. Более широкое распределение NGF-иммунопозитивных ТК во всех областях тимуса и увеличенная экспрессия NGF положительно коррелируют со степенью инволюционных изменений, что, по мнению авторов, является свидетельством важной роли NGF/ТК-взаимодействий в процессах инволюции тимуса. Действительно, in vitro показано, что NGF проявляет себя как фактор, способствующий выживанию и дифференцировке тучных клеток (Aloe, 1988; Aloe, DeSimone, 1989). Однако здесь существенным может быть и другой аспект - именно NGF считается одним из ключевых участников взаимодействий между ТК и нервными волокнами (Forsythe, Bienenstock, 2012). В связи с этим кажется вполне вероятным, что взаимодействие ТК – нерв также может вносить определенный вклад в процессы, происходящие при индуцированной инволюции тимуса. В данной системе взаимодействий ТК, кажется, выступают в роли посредников, которые переводят сигналы нервной системы с языка нейропептидов на язык цитокинов, «понятный» клеткам висцеральных органов. В таком контексте тучные клетки могут быть рассмотрены как эффекторы и, возможно, амплификаторы сигналов, поступающих в тимус из нервной системы в норме и при развитии патологии.
Обнаруженное значительное увеличение количества и дегрануляционной активности ТК в ходе акцидентальной инволюции, несомненно, указывает на функциональную вовлеченность ТК в процессы, происходящие в тимусе при развитии данной патологии. При этом, учитывая описанную динамику тимических ТК в ходе акцидентальной трансформации, логично предположить, что наиболее значимый вклад тучных клеток связан со стадиями восстановления тимуса после инволюции (48-96 ч после введения ГК). Одним из возможных аспектов участия ТК в данных процессах является продукция ими целого ряда факторов роста и цитокинов. Так, сообщается, что ТК тимуса способны синтезирвовать и накапливать интерлейкин IL-1, -2, -3, -4, -6, TNF, GM-CSF, NGF и др., за счет чего способны принимать активное участие в процессах тимопоэза, влияя на межклеточные взаимодействия, проницаемость гемато-тимического барьера и миграцию лимфоцитов (Кветной и соавт., 2005; Ribatti, Crivellato, 2016).
Другая важная функция ТК при акцидентальной инволюции тимуса может быть связана с накоплением тимическими тучными клетками тучноклеточной протеазы- 4 (mMCP-4), что было продемонстрировано при постановке соответствующей иммуноцитохимической реакции. При этом было выявлено значительное увеличение количества ТК, содержащих mMCP-4, и их появление во внутридольковых компартментах тимуса на этапе восстановления органа после акцидентальной трансформации (точки 48-96 ч). Из литературы известно, что mMCP-4 является одной из специфических тучноклеточных химаз, субстратами для действия которой служит большое количество различных белков и коротких пептидов, среди которых главными являются компоненты внеклеточного матрикса (Pejler et al., 2010). Относительно недавно было показано, что mMCP-4 играет ключевую роль в процессах ремоделировая соединительной ткани. Так, E. Tchougounova и соавт. обнаружили, что нокаутные по mMCP-4 мыши характеризуются аномальными разрастаниями соединительной ткани, что, по мнению авторов, указывает на роль данной протеазы в поддержании баланса между продукцией и разрушением внеклеточного матрикса (Tchougounova et al., 2005). При этом тучноклеточные химазы (в том числе mMCP-4) обладают способностью разрушать компоненты внеклеточного матрикса, реализуя данный процесс как через прямое разрезание фибронектина, так и опосредовано, через активацию предшественников матриксных металлопротеиназ (Caughey et al., 2007). На фоне этих данных важными являются полученные сведения о значительном увеличении плотности соединительной ткани в корковом веществе тимуса в ходе акцидентальной трансформации. Причем максимальная плотность соединительной ткани была отмечена для коркового вещества тимуса через 48 ч после введения ГК, и именно в этой точке было выявлено наибольшее увеличение количества mMCP-4-позитивных тучных клеток (в т.ч. в капсуле и корковом веществе тимуса) и их максимальная дегрануляционная активность. На всех последующих стадиях (точки 72-96 ч) наблюдалось уменьшение плотности соединительной ткани в корковом веществе тимуса, что четко соотносится со снижением количества mMCP-4-позитивных ТК. Основываясь на этих данных, можно предположить следующий возможный механизм участия ТК в репарационных процессах, происходящих в тимусе после индуцированной инволюции: после полного очищения коркового вещества тимуса от апоптотических телец, т.е. на стадии инверсии слоев (48 ч после введения ГК), многочисленные тучные клетки активно дегранулируют и секретируют mMCP-4 во внеклеточное пространство, где данная химаза вызывает разрушение компонентов соединительной ткани (фибронектина, коллагена). Физиологический смысл данного процесса очевиден и состоит в расчищении коркового вещества тимуса от соединительной ткани для его последующего заселения предшественниками лимфоцитов и их дальнейшей активной пролиферации, миграции и дифференцировки. С этой точки зрения тучные клетки могут выступать в качестве одних из ключевых клеток, обеспечивающих восстановление тимуса после индуцированной введением гидрокортизона акцидентальной трансформации.