Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 .Морфологические изменения нейронов гиппокампа в процессе старения 11
1.2.Окислительный стресс как механизм развития возрастных ней родегенеративных изменений мозга 16
1.3. Моделирование возрастных нейродегенеративных заболеваний на животных 20
1.4. Фармакологическая коррекция антиоксидантами и их влияние на возрастные нейродегенеративные процессы мозга 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
Глава 3. Результаты собственных исследований структурные изменения гиппокампа в процессе старения 43
3.1 .Светомикроскопическое исследование нейронов 43
3.1.1. Морфологические изменения нейронов гиппокампа крыс в возрасте 14 дней 43
3.1.2. Морфологические изменения нейронов гиппокампа крыс в возрасте 5 месяцев 44
3.1.3. Морфологические изменения нейронов гиппокампа крыс в возрасте 18 месяцев 45
3.2. Электронно-микроскопическое исследование нейронов
3.2.1. Ультраструктурная организация пирамидных нейронов СА1 региона гиппокампа крыс в возрасте 5 месяцев 50
3.2.2. Ультраструктурная организация пирамидных нейронов СА1 региона гиппокампа крыс в возрасте 18 месяцев 50
3.3.Межнейронные синапсы 55
3.3.1. Ультраструктурная организация синапсов СА1 региона гиппокампа крыс в возрасте 5 месяцев 55
3.3.2. Ультраструктурная организация синапсов СА1 региона гиппокампа крыс в возрасте 18 месяцев 56
3 АГлиальные реакции гиппокампа в процессе старения 62
3.5.Сосудистые реакции гиппокампа в процессе старения
3.6.Морфологические изменения нейронов гиппокампа крыс OXYS на фоне применения антиоксидантов 67
3.6.1.Морфологические изменения нейронов гиппокампа крыс OXYS в возрасте 5 месяцев 67
3.6.2.Морфологические изменения нейронов гиппокампа крыс OXYS в возрасте 18 месяцев 72
3.7.Ультраструктурные изменения пирамидных нейронов СА1 региона гиппокампа крыс OXYS в возрасте 18 месяцев на фоне применения антиоксидантов 75
3.8.Ультраструктурные изменения межнейрональных синапсов СА1 региона гиппокампа крыс OXYS в возрасте 18 месяцев на фоне применения антиоксидантов 76
3.9.Глиальные реакции гиппокампа крыс OXYS на фоне применения антиоксидантов 79
3.10. Сосудистые реакции гиппокампа крыс OXYS на фоне примене ния антиоксидантов 81
Влияние антиоксидантов на способность крыс OXYS к обучению и память 82
3.11 .«Восьмирукавный радиальный» лабиринт 82
3.11.1.Влияние приема SkQl и мелатонина с возраста 1,5 до 5
месяцев на способность к обучению и память крыс OXYS
в тесте «Восьмирукавный радиальный лабиринт» 82
3.11.2.Влияние приема SkQl и мелатонина с возраста от 12 до 18 месяцев на способность к обучению и память крыс OXYS
в тесте «Восьмирукавный радиальный лабиринт» 85
3.12.Водный тест Морриса 87
3.12.1.Влияние приема SkQl и мелатонина с возраста от 12 до 18
месяцев на способность к обучению и память крыс OXYS
в водном тесте Морриса 87
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 89
Выводы по
Библиографический список
- Моделирование возрастных нейродегенеративных заболеваний на животных
- Фармакологическая коррекция антиоксидантами и их влияние на возрастные нейродегенеративные процессы мозга
- Электронно-микроскопическое исследование нейронов
- Сосудистые реакции гиппокампа крыс OXYS на фоне примене ния антиоксидантов
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время поиск способов профилактики старения приобрел особую актуальность, как в развитых странах, в которых средняя продолжительность жизни перешагнула за 80 лет (Швеция, Япония), так и в тех государствах, где ее величина по экономическим, социальным или иным причинам не достигает 60 лет или лишь немного превышает эти значения [World health statistics, 2014].
Изучение механизмов, определяющих скорость старения и продолжительность жизни, является важным направлением биологических и медицинских исследований. С возрастом происходит постепенное снижение функциональных возможностей мозга, в том числе способности к обучению, нарушение процессов мышления, памяти, дезориентация во времени и пространстве [Ани-симовВ. Н.,2014].
Физиологическое старение является сложным процессом для исследования. В течение жизни на организм действует множество факторов: стрессы, неблагоприятные воздействия среды, неполноценное питание, заболевания, активирующие свободнорадикальные процессы, приводящие к смещению в клетке прооксидантно-антиоксидантного баланса в сторону прооксидантов и оксида-тивному стрессу, который в свою очередь может приводить к повреждению ли-пидов, белков и нуклеиновых кислот, нарушению мобилизации антиокислительной защиты, активации апоптоза и некроза [Владимиров Ю. А., 2012]. Возрастные изменения представляют собой комплекс процессов, определяемых множественными нарушениями в генетическом аппарате, приводящих к накоплению метаболических ошибок и вытекающих из них тканевых повреждений [Хавинсон В. X., Кузник Б. И., Тарновская С. И., 2014]. Кроме того, в процесс старения вовлекаются и адаптивные изменения, приспосабливающие организм к функционированию в условиях накопления метаболических дефектов [Хавинсон В. X., Соловьев А. Ю., Жилинский Д. В., 2012].
В настоящее время недостаточно изучены характер и динамика морфологических и ультраструктурных изменений гиппокампа в процессе старения. Данных о взаимоотношении морфологических изменений гиппокампа с нарушениями процесса памяти, обучения в доступной литературе не представлено.
Нарушение пространственной памяти является одним из наиболее ранних проявлений ускоренного старения [Wills Т. J., 2001]. Л. В. Крушинский (1967) провел этиологическое исследование на птицах и доказал, что гиппокамп ответствен за формирование пространственной памяти.
Позднее полученные данные были подтверждены другими исследователями на млекопитающих [Gutbrod К., 1987; Nunn J. А., 1999; Tucker D. М., 1999].
Биологические модели с ускоренным темпом старения помогают исследователям в разработке и тестировании лекарственных средств, приводящих к снижению и предупреждению возрастных морфологических и поведенческих изменений. В последние годы получены убедительные аргументы в пользу то-
го, что уникальной моделью для изучения механизмов старения может служить созданная в Институте цитологии и генетики СО РАН линия преждевременно стареющих крыс OXYS. Линия создана селекцией и инбридингом крыс Вистар, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы. В пяти первых поколениях развитие катаракты провоцировали нагрузкой галактозой, в дальнейшем отбор вели по ранней спонтанной катаракте, сцепленно с которой животные унаследовали комплекс признаков преждевременного старения, в том числе ускоренное старение мозга [Колосова Н. Г., Стефанова Н. А., Корболина Е. Е., 2014]. На фенотипическом уровне оно проявляется формированием уже к возрасту 3 месяца пассивного типа поведения, повышенной тревожностью, нарушением способности к обучению на фоне нейродегенеративных изменений, выявленных методами магниторезонансной томографии [Агафонова И. Г., Колосова Н. Г., Мищенко Н. П., 2010]. Крысы OXYS активно используются для оценки эффективности новых геропротекторов, однако структурно-функциональные основы ускоренного старения их мозга ранее не исследовались.
В настоящее время ведущей концепцией преждевременного старения является свободнорадикальная теория, высказанная Д. Харманом еще в 1954 году [Harman D., 1956, 2000]. Ввиду этого в качестве перспективных препаратов, защищающих клетки от повреждающего действия активных форм кислорода, используются препараты антиоксидантной группы [Бизунок Н. А., 2012].
В диссертационной работе проведена оценка возрастных изменений структуры гиппокампа и его функций. Кроме того, изучался нейропротектор-ный потенциал мелатонина и антиоксиданта нового поколения - пластохино-нил-децил-трифенилфосфония, способного проникать и накапливаться в митохондриях.
Цель исследования: изучить структурно-функциональные основы преждевременного старения гиппокампа крыс OXYS и оценить способность антиоксиданта SkQl и мелатонина влиять на развитие его возрастных изменений.
Задачи исследования:
-
Изучить характер и структурные изменения пирамидных нейронов и межнейрональных синапсов пирамидного слоя СА1, САЗ регионов и зубчатой извилины гиппокампа крыс OXYS и Вистар в процессе старения.
-
Оценить возрастные структурные изменения глиальных клеток, сосудов гиппокампа крыс OXYS и Вистар.
-
Сравнить динамику возрастных изменений гиппокампа крыс OXYS с признаками преждевременного старения и крыс Вистар с нормальным темпом старения.
-
Оценить влияние антиоксиданта SkQl и мелатонина на возрастные структурные изменения гиппокампа, а также на способность к обучению и память крыс OXYS в «восьмирукавном радиальном лабиринте» и водном тесте Морриса.
Научная новизна. Впервые детально описаны морфофункциональные особенности гиппокампа крыс OXYS. Показано, что у крыс OXYS и Вистар с возрастом увеличивается число измененных нейронов гиппокампа, особенно в СА1 регионе, но у крыс OXYS это происходит ускоренными темпами. У крыс OXYS в более ранние сроки наблюдалось усиление компенсаторной синапти-ческой активности в виде редукции численной плотности синапсов, реорганизации контактов в положительно искривленные. Большая степень глиоза, сосудистых изменений определялась у преждевременно стареющих крыс по сравнению с таковым у линии Вистар.
Впервые изучены морфология и ультраструктура клеточно-тканевых элементов гиппокампа крыс OXYS при введении мелатонина и антиоксиданта SkQl. Установлено, что препараты уменьшают возникающие в процессе старения изменения нейронов, глиальных элементов, сосудов микроциркуляторного русла, способствуют сохранению числа межнейрональных контактов. Введение антиоксидантов препятствует снижению способности к обучению и памяти крыс OXYS в «восьмирукавном радиальном лабиринте» и водном тесте Морриса. Определена неодинаковая протекторная эффективность препаратов. Впервые установлено, что эффекты антиоксидантов зависят от генотипа и возраста животных.
Практическая значимость. Полученные результаты расширяют существующие представления о влиянии мелатонина и SkQl на структурные компоненты гиппокампа крыс линий OXYS и Вистар в процессе старения. Выявленные в работе эффекты мелатонина и SkQl открывают новые перспективы для дальнейшего изучения роли антиоксидантов в лечении и профилактике возрастных нарушений структуры и функций мозга.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. На модели преждевременно стареющих крыс OXYS установлено ран
нее появление возрастных нейрональных, синаптических, глиальных и сосуди
стых изменений гиппокампа.
2. Введение мелатонина и SkQl преждевременно стареющим крысам
OXYS уменьшает выраженность морфологических изменений гиппокампа
и улучшает их способность к обучению и память в используемых поведенче
ских тестах.
Апробация диссертации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 51-й международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2013); 5-th International Young Scientists School «System Biology & Віоіпгогтагіс8»(Новосибирск, 2013); International Symposium «Human Genetics»(HoBOCH6HpcK, 2014); седьмой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 9 публикаций в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, 5 - в зарубежных рецензируемых журналах, цитируемых в Web of Science.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов) и выводов. Работа иллюстрирована 23 рисунками и содержит 21 таблицу. Библиографический список включает 243 источника, из них 56 на русском языке и 187 на иностранных языках.
Личный вклад. Автором проведена работа по анализу отечественной и зарубежной литературы, отражающей современное состояние данной научной проблемы. Самостоятельно выполнено физиологическое и гистологическое исследование, проведено ультрамикроскопическое изучение материала, морфомет-рическое исследование гистологических срезов, выполнена статистическая обработка полученных данных, их анализ и написание диссертации.
Моделирование возрастных нейродегенеративных заболеваний на животных
Биологическое старение - неизбежный процесс, сущность которого сводится к появлению признаков дегенерации как отдельных органов и тканей, так и организма в целом. Наиболее распространено мнение, что скорость биологического старения определяется накоплением в организме клеточных и органных повреждений, и эти процессы зависят как от генетических факторов, так и от факторов окружающей среды. Механизмы старения и патогенез нейродегенеративных заболеваний тесно связаны с окислительным стрессом - нарушением баланса в системах генерации и детоксикации АФК или сдвигом прооксидантно-антиоксидантного равновесия в направлении активации процессов перекис-ного окисления липидов в биологических мембранах и жидкостях [Барабой В. А., 2002; Ames В. N., 1992].
Известно, что АФК являются неотъемлемым компонентом мембран. Тем не менее АФК важны для нормального функционирования клетки, а при определенных обстоятельствах они играют основную роль в повреждении и гибели клетки [Di Carlo М., Giacomazza D., Picone P., 2012; Lizama-Manibusan В., McLaughlin В., 2013].
Нейроны содержат систему ферментов и антиоксидантов для детоксикации АФК. Во время стресса нейроны становятся крайне уязвимыми для пе-рекисного повреждения, они не способны адаптироваться к перепроизводству АФК [Lizama-Manibusan В., McLaughlin В., 2013].
Накопление в клетках мозга окислительных повреждений макромолекул способно приводить как к деполяризации мембран нейронов, так и к изменению порога их чувствительности к действию нейромедиаторов. Возникает нарушение оптимальных условий функционирования рецепторов, транспортных и сигнальных систем и, как следствие, это приводит к изменению структуры и функций мозга, в том числе способности к обучению и памяти [Navarro A. et al, 2009; Chakrabarti Т. et al, 2011; McManus A. M. et al, 2011]. Вероятность развития окислительных процессов с возрастом повышается вследствие усиления образования АФК и/или снижения способности клеток к их нейтрализации. В результате этого возникают деструкция мембран, инактивация активности ферментов и гормонов, повреждения ДНК, нарушение клеточного цикла и, в итоге, гибель клетки [Saada Н. N., 2008; SasazukiS.,2008].
Установлено, что снижение активности естественной антиоксидантной системы организма может быть обусловлено чрезмерными физическими и психическими нагрузками, воздействием радиации, курением, инфекционными заболеваниями и нарушением пищевого статуса [Mattson М. Р., 2001].
В 1956 г. Д. Харманом была выдвинута свободнорадикальная теория старения, которая утверждает, что старение и связанные с возрастом нарушения являются результатом кумулятивного повреждения, возникающего вследствие реакций с активными формами кислорода (АФК). Эта теория объясняет множество обусловленных возрастом феноменов, таких как взаимосвязь долгожительства и скорости основного метаболизма, появление дегенеративных заболеваний в конце жизни, благотворное воздействие теплового ограничения на продолжительность жизни и большую продолжительность жизни у женщин [Harman D., 1981].
Обнаружено ассоциированное с возрастом окислительное повреждение коллагена, эластина, мукополисахаридов, а также нуклеарной и митохондри-альной ДНК. Отмечено содействие липидной пероксидации липофусциноге-незу [Cortopassi G. A., Shibata D., Soong N. W., 1992]. Более того, существует возрастной подъем системной окислительной нагрузки, а связанная с возрастом заболеваемость ассоциирована с низким уровнем антиоксидантной защиты [Rozanowska М., Jarvis-Evans J., Korytowski W., 1995; Kritchevsky S. В., Muldoon M. F., 1996; Paolisso G., Tagliamonte M. R., Rizzo M. R., 1998].
Токсическое действие свободных радикалов реализуется через повреждение липидов мембраны, поверхностных протеинов и трансмембранных гликопротеидов. Увеличение энергии фотосенсибилизатора приводит к образованию синглетного кислорода, способного разрушать мембраны клетки и другие ее структуры [Зенков Н. К., Ланкин В. 3., Меньшикова Е. Б., 2011].
Известно, что окислительный стресс способствует или является причиной устойчиво растущего числа болезней, таких как нейродегенеративные, сердечно-сосудистые и некоторые виды онкологических заболеваний.
Частным случаем свободнорадикальной теории старения является ми-тохондриальная гипотеза. Из-за своего расположения в митохондриальном матриксе мт-ДНК подвержена сильному воздействию свободных радикалов. К тому же, в отличие от ядерной ДНК, мт-ДНК депротеинизирована, не покрыта защитными структурными белками, такими как гистоны. Митохондрии лишены способности восстанавливать вызванные окислением повреждения ДНК. Исходя из этих данных, постоянная базовая нагрузка окислительных повреждений на мт-ДНК значительно выше, чем на ядерную ДНК [Muller F. L., Lustgarten М. S., Jang Y., 2007].
Воздействие АФК на мт-ДНК способствует формированию продуктов окислительного повреждения оснований ДНК, таких как 8-гидрокси-2-диоксигуанозин (80HdG), а также разрыву цепочек ДНК [Klungland А., Rosewell I., Hollenbach S., 1999]. Некоторые из таких повреждений ДНК мутагены, например, 8-гидрокси-2-диоксигуанозин могут вступать в комплементарное взаимодействие с аденином вместо цитозина, которое часто приводит к появлению трансверсий (замен пуриновых оснований в ДНК на пи-римидиновые и наоборот), является наиболее часто встречающимися мутациями, вызываемыми окислительным стрессом [Wang D., Kreutzer D. А., 1998].
Доказано, что уровень 8-гидрокси-2-диоксигуанозина в мт-ДНК и максимальная продолжительность жизни млекопитающих обратно пропорциональны, что свидетельствует о возврастно-зависимом характере накопления повреждений ДНК. Мутации в мт-ДНК играют огромную роль в повреждении таких постмитотических клеток, как нейроны, и возникновении нейроде-генеративных заболеваний. Повреждение мт-ДНК в конечном итоге приводит к нарушению биоэнергетической составляющей нейрона. Нейродегене-ративные заболевания характеризуются прогрессирующей гибелью нейронов (апоптозом и/или некрозом).
Фармакологическая коррекция антиоксидантами и их влияние на возрастные нейродегенеративные процессы мозга
Для проведения ультраструктурного анализа головной мозг фиксировали путем транскардиальной перфузии раствором, содержащим смесь пара-формальдегида (4 %) и глютаральдегида (0,5 %), приготовленным на основе 0,2 М какодилатного буфера (рН 7,4). Материал постфиксировали в 2 % растворе четырехокиси осмия на холоде в течение 3 часов, затем дегидратировали в спиртах восходящей концентрации, ацетоне, пропиленоксиде и заливали в эпон-812. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультратоме «Leica ЕМ UC7» («Leicamicrosystems», Австрия). Полутонкие срезы окрашивали то-луидиновым синим. Ультратонкие серебристые и бледно-золотистые срезы наносили на сетки-подложки, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Е. Reynolds [1963], изучали и фотографировали в электронном микроскопе JEM-7A.
Морфометрию органелл пирамидных нейронов гиппокампа проводили с помощью сетки Автандилова при увеличении 10000, определяли удельную площадь органелл в пирамидных нейронах (в процентах от общей площади цитоплазмы). Для оценки изменений синаптоархитектоники фотографировали по 15 случайно выбранных полей зрения пирамидного слоя СА1 региона гиппо-кампа с 5 срезов при стандартном увеличении 10000.
Определяли количество межнейрональных контактов (площадь поля зрения - 50 мкм ) и высчитывали численную плотность синапсов на 100 мкм . Подсчитывали количество определенных контактов с асимметричной и симметричной организацией системы субсинаптических единиц (ССЕ). Подразделяли синапсы по протяженности активной зоны контакта (АЗК) на мелкие (100—200 нм), малые (200—300 нм), средние (300—500 нм), крупные (500—700 нм) и очень крупные ( 700 нм). Подсчитывали численную плотность плоских, положительно и отрицательно искривленных, гипертрофированных (длина АЗК больше 700 нм) и перфорированных синапсов.
Влияние SkQl и мелатонина на способность к обучению и память животных исследовали в возрасте 5 и 18 месяцев. Использовали тесты «Вось-мирукавный радиальный лабиринт» и водный тест Морриса. Все «поведенческие» тесты проводили в период времени с 12 до 19 часов.
Тест «Восьмирукаеный радиальный лабиринт» Для оценки пространственной рабочей и референтной памяти крыс использовали установку «Радиальный восьмирукавный лабиринт» (НІЖ Открытая Наука, Москва, Россия). В течение 10 последовательных дней обучали крыс поиску пищи в лабиринте (Manahan-Vaughan and Schwegler, 2011). В качестве пищевого подкрепления использовались сухие зерновые шарики массой 5 граммов (ОАО Любятово, Россия). За 3 дня до обучения снижали количество корма в домашних клетках на 15 % от суточной нормы потребности в корме крыс и давали по одному шарику каждой крысе. За день до обучения проводили габитуацию (привыкание) крыс к лабиринту дважды в течение 10 минут с интервалом между сессиями 2 часа, при этом корм был рас 40 сыпан во всех рукавах. Во время обучения пищевое подкрепление предъявляли в 4 из 8 рукавов лабиринта.
Для этого в конце каждого из 4 рукавов устанавливали кормушку с зерновым шариком. В каждой сессии крысу помещали в центр установки с закрытыми перегородками рукавами, давали ей освоиться в течение 20 секунд, затем перегородки убирали и наблюдали поведение животных в течение 10 минут или до тех пор, пока крыса не войдет во все подкрепляемые кормом рукава. В каждом сеансе обучения подсчитывали число ошибок референтной памяти (входы в неподкрепляемые рукава), число ошибок рабочей памяти (повторные входы в подкрепляемые рукава в течение одного сеанса), общее число входов в рукава (моторно-исследовательская активность).
За исключением первого дня обучения, показатели рабочей и референтной памяти были объединены по 3 сессии (дня) для каждой крысы (Manahan-Vaughan and Schwegler, 2011). Водный тест Морриса Водный тест Морриса (Morris R., 1984) использовали для исследования обучения, долговременной пространственной памяти. Лабиринт представлял собой круглый бассейн, изготовленный из нержавеющей стали (диаметром 2 м, с высотой стенок 0,6 м), расположенный на опорах на высоте 0,7 м над уровнем пола. Установка помещалась в комнате (размером 3x3 м), содержащей инвариантные пространственные стимулы, а именно: дверь, шкаф. Бассейн был условно поделен на 4 равных сектора при помощи 4 различных крупных меток, нанесенных на его стенки изнутри; сектора получили условную нумерацию (№ 1, 2, 3, 4 по часовой стрелке). В середине четвёртого сек 41 тора помещалась квадратная платформа из оргстекла с размером площадки 0,13x0,13 м и высотой 0,4 м.
Бассейн заполнялся водой с температурой 26±2С так, чтобы платформа была погружена на 3 см. В воде растворялась навеска сухого молока с тем, чтобы среда стала непрозрачной. Таким образом, платформа оставалась невидимой для животного. При постоянном положении платформы животные научались находить цель в пространстве, используя ориентиры внелабиринт-ного расположения и/или нанесенные на края бассейна-лабиринта. Запись и оцифровка видеоизображения проводились при помощи компьютера, снабженного внутренней платой видеозахвата.
Исследование проводилось в одно и то же время суток, с 11 до 14 часов. Каждая крыса выполняла ежедневно по 4 попытки в течение 5 последовательных дней. Животное помещали в лабиринт у его стенки в середине сектора, соответствующего номеру попытки. Далее животному давалось 70 секунд для того, чтобы отыскать погруженную платформу, потраченное на это время фиксировалось при помощи секундомера («латентный период нахождения платформы»). Отыскав платформу, крыса находилась на ней в течение 20 секунд, вынималась из установки и помещалась в сухую обогреваемую клетку до выполнения следующей попытки (на 12 минут). В случае если животное не отыскивало платформу самостоятельно, по истечении отведенного на попытку времени крысу помещали на платформу, где она находилась в течение 20 секунд, в протоколе фиксировался латентный период 70 секунд.
По истечении 4 попыток крысы помещались обратно в их «жилые» клетки до следующего дня. Показателем способности к обучению и пространственной памяти животных в водном тесте Морриса являлся латентный период нахождения невидимой платформы. На 6-й день эксперимента (оценка референтной памяти) платформа убиралась, животных сажали в бассейн в первом месте выпуска, давая им по одной попытке длительностью 70 секунд. При этом регистрировали время, проведённое в секторе, где ранее находилась платформа.
Электронно-микроскопическое исследование нейронов
Сравнительное изучение различных регионов гиппокампа крыс линий OXYS и Вистар позволило установить, что в регионе СА1 гиппокампа у крыс OXYS выявлена тенденция к увеличению числа пирамидных нейронов с признаками тотального хроматолиза (0,05 р 0,06). Тотальный хроматолиз в нейронах проявляется измельчением и растворением глыбок хроматофиль-ной субстанции равномерно по всему перикариону и в дендритах, резким уменьшением или исчезновением ядрышек.
Гиперхромия нейронов без признаков сморщивания морфологически характеризуется увеличением степени базофилии перикариона, укрупнением глыбок хроматофильного вещества с образованием конгломератов, что функционально интерпретируется как реактивное, заторможенное состояние нейрона. В САЗ регионе у крыс линии OXYS в 3 раза выше процент гипер-хромных нейронов без сморщивания по сравнению с таковым у крыс линии Вистар (р 0,05, табл. 1).
Морфометрический анализ средней площади тел и ядер между крысами обеих линий в возрасте 14 дней не выявил существенных различий (табл. 2).
Таким образом, результаты нейрогистологического исследования гиппокампа крыс линий OXYS и Вистар отражают отсутствие выраженных структурных изменений нейронов и межлинейных различий в возрасте 14 дней. 3.1.2. Морфологические изменения нейронов гиппокампа крыс в возрасте 5 месяцев
При исследовании гиппокампа 5-месячных крыс обеих линий обнаружены как обратимые, так и необратимые изменения пирамидных нейронов во всех изучаемых регионах. Однако у крыс линии OXYS процент измененных нейронов выше в регионах СА1, САЗ, зубчатой извилине по сравнению с таковым у крыс Вистар (р 0,05, табл. 2).
Так, в регионе СА1 у крыс линии OXYS процент нейронов с признаками тотального хроматолиза был увеличен в 10 раз, гиперхромных нейронов без сморщивания определялось больше в 3 раза в сравнении с группой Вистар (р 0,05). В САЗ регионе у крыс линии OXYS преобладали гиперхромные нейроны без сморщивания, а также нейроны с очаговым хроматолизом, процент которых у Вистар был ниже в 2 и 3 раза соответственно (р 0,05). Пери-карионы и отростки гиперхромных сморщенных нейронов были деформированы, имели неровные контуры и были резко уменьшены в объеме. Вследствие интенсивного и гомогенного окрашивания глыбки хроматофильного вещества в них различить не удавалось. В зубчатой извилине у крыс линии OXYS выявлено значительно большее число гиперхромных нейронов без сморщивания в сравнении с группой Вистар (р 0,05).
Морфометрический анализ средней площади тел и ядер в возрасте 5 месяцев в СА1 регионе гиппокампа крыс определил достоверно меньшую среднюю площадь тел и ядер пирамидных нейронов у крыс линии OXYS, чем у крыс линии Вистар (р 0,05, табл. 3). В САЗ регионе и зубчатой извилине значимых отличий не определялось.
У крыс обеих линий к возрасту 5 месяцев процент измененных нейронов был значительно выше во всех изучаемых регионах по сравнению с 14-дневными животными (р 0,05).
Исследование возрастной динамики средней площади тел и ядер нейронов различных регионов гиппокампа крыс линии Вистар показало, что к возрасту 5 месяцев показатели СА1, САЗ регионов были достоверно выше по сравнению с наблюдаемыми в предыдущий срок (р 0,05). У крыс линии OXYS только площадь тела нейронов во всех изучаемых регионах достоверно увеличивалась к возрасту 5 месяцев (р 0,05).
Сравнительный анализ различных регионов гиппокампа показал схожую динамику гибели нейронов. Так, к 5-месячному возрасту у крыс обеих линий численная плотность нейронов была в 1,5 раза меньше в сравнении с таковой у 14-дневных крыс (р 0,05, табл. 3).
Таким образом, изменения нейронов и редукция их численной плотности в СА1, САЗ регионвах, зубчатой извилине гиппокампа свидетельствуют о наличии возрастных морфологических изменений уже в возрасте 5 месяцев в период активной манифестации признаков ускоренного старения их мозга. Большая выраженность структурных изменений определяется у животных линии OXYS в сравнении с крысами линии Вистар.
К возрасту 18 месяцев у животных обеих линий изменения нарастают, но в большей степени у крыс линии OXYS. Так, в регионе СА1 был в 2 раза выше процент нейронов с признаками тотального (рис. 1), очагового хроматолиза (рис. 2) и гиперхромных нейронов без сморщивания, в САЗ регионе также определялось вдвое больше гиперхромных нейронов без сморщивания (рис. 3) и нейронов с признаками тотального хроматолиза, чем у крыс линии Вистар (р 0,05). Очаговый хроматолиз нейронов чаще проявляется периферическим растворением хроматофильной субстанции, что обычно трактуется как результат длительного раздражения и функционального напряжения нейронов. Анализ нейронов зубчатой извилины определил увеличение в 2 раза процента гиперхромных сморщенных и гиперхромных нейронов без сморщивания у крыс OXYS по сравнению с показателями крыс Вистар (р 0,05, табл. 1).
Сосудистые реакции гиппокампа крыс OXYS на фоне примене ния антиоксидантов
В митохондриях перицитов часто отмечалась деструкция крист, внутренней мембраны. Удельная площадь сечения сосудов во всех регионах гип-покампа крыс линии OXYS была достоверно меньше, чем у крыс линии Вис-тар (табл. 9).
Кроме того, сравнительный анализ показал, что к возрасту 18 месяцев численная плотность сосудов в СА1, САЗ регионах была достоверно снижена у крыс OXYS в 2,5 раза, в 2 раза у крыс Вистар, в зубчатой извилине отмечалось уменьшение численной плотности сосудов в 2 раза у крыс OXYS и в 1,5 раза у крыс Вистар по сравнению с 14-дневными животными (р 0,05).
Таким образом, полученные результаты указывают на начало сосудистых изменений уже в 5-месячном возрасте у крыс линии OXYS. К возрасту 18 месяцев изменения в большей степени нарастали у крыс линии OXYS, чем у животных линии Вистар. Сосудистые изменения носили однотипный характер, проявляющийся изменениями эндотелиоцитов, перицитов. Обнаружено, что с возрастом численная плотность сосудов снижается у животных обеих линий.
В регионе СА1 гиппокампа в группе крыс линии OXYS с применением препаратов процент нейронов с признаками тотального хроматолиза в группе животных с применением мелатонина составил 1,01 (0,93—0,19) %, в группе крыс, получавших SkQl, - 0,36 (0,33—0,39) %, что было ниже, чем в группе без использования препарата - 1,78 (0,41—1,91) %, (р 0,05, рис. 18А). Численная плотность нейронов с признаками очагового хроматолиза была достоверно ниже в группе животных, получавших мелатонин, - 3,25 (2,88—3,57) %, атакже в группе с применением SkQl - 1,84 (1,47—2,31) % в сравнении с интактными животными - 4,92 (4,52—6,61) (р 0,05). Процент гиперхромных нейронов без сморщивания был ниже у животных с применением мелатонина - 2,63 (2,51—2,68) % и 1,83 (1,56—2,31) % у животных с SkQl в сравнении с таковым показателем у интактных крыс - 5,39 (3,97—10,87) % (р 0,05).
Содержание измененных нейронов СА1 гиппокампа крыс OXYS при применении антиоксидантов Примечание к рис. 18: Группа 1 - крысы OXYS, группа 2 - крысы OXYS с применением мелатонина, группа 3 - крысы OXYS с введением SkQ 1.
Показано, что в САЗ регионе в группе крыс, получавших SkQl, процент нейронов с тотальным хроматолизом составил 0,21 (0,20—0,24) % (рис. 18Б), с признаками очагового хроматолиза - 1,63 (1,51—2,41) % по сравнению с таковым показателем в интактной группе - 0,98 (0,61—1,11) % и 6,02 (3,52—9,56) % соответственно (р 0,05). Процент гиперхромных нейронов без сморщивания у животных с применением мелатонина составил 3,83 (3,28— 4,69)%, у животных с введением SkQl - 1,36 (1,02—1,44) % в сравнении с интактной группой животных - 4,82 (3,61—6,51) % (р 0,05).
В зубчатой извилине процент гиперхромных нейронов без сморщивания оказался ниже у крыс с применением мелатонина - 1,31 (1,15—1,31) % у животных, получавших SkQl, и 0,66 (0,65—0,71) % - в сравнении с таковым показателем у интактных крыс - 1,52 (1,29—2,38) % (р 0,05, рис. 18 В). Показатель гиперхромных сморщенных нейронов у животных с применени 69 ем мелатонина составлял 0,34 (0,24—0,39) % и 0,13 (0,13—0,24) % у животных с применением SkQl в сравнении с таковым показателем у интактных крыс - 0,51 (0,11—0,65) % (р 0,05).
Содержание измененных нейронов САЗ гиппокампа крыс OXYS при применении антиоксидантов
Обнаружено, что в возрасте 5-месяцев во всех изучаемых регионах гиппокампа в группах крыс OXYS с приемом антиоксидантов численная плотность нейронов была выше по сравнению с таковым показателем у ин-тактных животных (табл. 11).
Проведенный морфометрический анализ средней площади тел и ядер нейронов в различных регионах гиппокампа крыс показал, что достоверно более высокие значения исследуемых показателей наблюдались в СА1 регионе у животных с применением SkQl в сравнении с интактными животными и группой крыс с применением мелатонина (р 0,05). В САЗ регионе, зубчатой извилине достоверных отличий между группами не определялось (табл. 10).
Таким образом, выявляемые изменения нейронов гиппокампа животных, получавших препараты, имели сходный характер с изменениями, наблюдаемыми у интактных крыс, различия выявлялись только на уровне количественного анализа. Введение препаратов оказывало положительный эффект на состояние пирамидных нейронов СА1, САЗ регионов и зубчатой из 71 вилины гиппокампа крыс линии OXYS, число измененных нейронов было значимо ниже в группах животных с применением препаратов.
В регионе СА1 в группе крыс линии OXYS с применением препаратов был достоверно ниже процент нейронов с признаками тотального хроматолиза (рис. 21А) как в группе крыс с применением мелатонина - 3,76 (3,62— 3,82) %, так и в группе крыс, получавших SkQl - 3,28 (2,71—3,47) %, чем в группе животных без использования препарата - 11,92 (11,39—12,55) % (р 0,05). Численная плотность нейронов с признаками очагового хроматолиза была достоверно ниже как в группе крыс, получавших мелатонин, - 4,03 (3,43—4,77) %, так и в группе крыс с применением SkQl - 3,43 (2,86—4,21) % в сравнении с животными интактной группы - 11,61 (10,38—12,35) % (р 0,05). Процент гиперхромных нейронов без сморщивания имел более низкие значения у животных с применением мелатонина - 4,61 (4,41—4,67) % и 4,82 (4,76—5,12) % у животных с приемом SkQl в сравнении с таковым показателем у интактных крыс - 7,55 (7,28—8,76) % (р 0,05).
В САЗ регионе в группе крыс OXYS с применением препаратов был достоверно ниже процент нейронов с признаками тотального хроматолиза (рис. 21Б) (р 0,05). Так, в группе крыс с применением мелатонина - 5,11 (5,09—5,31) % , в группе крыс, получавших SkQl, -4,18 (3,82—5,01) %, что было ниже, чем в группе животных без использования препарата - 10,08 (9,21—10,97) % (р 0,05). Процент гиперхромных нейронов без сморщивания был ниже у животных с мелатонином - 4,55 (4,53—6,19) % и у животных с приемом SkQl - 3,61 (3,48—3,84) % по сравнению с таковым показателем у животных интактной группы - 9,66 (9,24—11,42) % (р 0,05).