Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Соматическая полиплоидия 11
1.1.1. Феномен и распространение соматической полиплоидии 11
1.1.2. Соматическая полиплоидия в тканях янтарки 14
1.1.3. Свойства полиплоидных клеток и значение соматической полиплоидии 16
1.2. Ядрышко 19
1.2.1. Структурно-функциональная организация ядрышка 19
1.2.2. Специфичность окрашивания ядрышек азотнокислым серебром 25
1.2.3. Вариабельность ядрышковых параметров 27
1.2.4. Ядрышковый аппарат в полиплоидных клетках 33
2. Материал и методы 36
3. Результаты 41
3.1. Определение геномного числа ядрышковых организаторов и ядрышкообразующих хромосом янтарки 41
3.2. Питающие клетки гонады 41
3.2.1. Динамика полиплоидизации питающих клеток 41
3.2.2. Число ядрышек 45
3.2.3. Суммарная площадь ядрышек 47
3.2.4. Содержание ядрышковых Ag-белков 50
3.3. Секреторные клетки белковой железы 53
3.3.1. Динамика полиплоидизации секреторных клеток 53
3.3.2. Число ядрышек 55
3.3.3. Суммарная площадь ядрышек 60
3.3.4. Содержание ядрышковых Ag-белков 63
3.3.5. Морфология и ультраструктура ядрышек 67
3.4. Слизистые и белковые клетки елюнной железы 69
3.4.1. Строение слизистых и белковых клеток 70
3.4.2. Уровни плоидности ядер слизистых и белковых клеток 70
3.4.3. Морфология ядрышек слизистых и белковых клеток 74
3.4.4. Число ядрышек 76
3.4.5. Суммарная площадь ядрышек и содержание Ag-белков 78
3.5. Влияние голодания на ядрышки белковых клеток слюнной железы 81
3.5.1. Изменение ультраструктуры ядрышек 81
3.5.2. Суммарная площадь ядрышек 83
3.5.3. Содержание Ag-белков 85
3.5.4. Число ядрышек 86
4. Обсуждение 89
Выводы 104
- Ядрышко
- Питающие клетки гонады
- Секреторные клетки белковой железы
- Слизистые и белковые клетки елюнной железы
Введение к работе
Соматическая полиплоидия как особая стратегия тканевого роста закономерно встречается в некоторых органах как у животных, так и у растений (Nagl, 1978, 1990; Бродский, Урываева, 1981; D Amato, 1989; Anatskaya et al., 1994; Кудрявцев и др., 1997; Анисимов, 1998—1999; Joubes, Chevalier, 2000; Barow, Meister, 2003). Для понимания биологического смысла этого явления актуальной задачей остается изучение свойств полиплоидных клеток, среди которых наиболее важным является интенсификация функции. Последняя выражается в эквивалентном дозе генов увеличении клеточной продукции при снижении затрат на ее производство и упрощении регуляции (Анисимов, 1999в). Как одно из проявлений интенсификации функции в полиплоидных клетках выступает усиление транскрипции. Ряд исследований, выполненных на разных объектах, в целом показал соответствие уровня экспрессии генов их дозе: интенсивность синтеза и содержание РНК удваивались пропорционально числу геномов (Johnston, Mathias, 1972; Nagl, 1973; Morselt, Wijgerden, 1975; Roszell et al, 1978; Jehle, Kiefer, 1979; Ни и др., 1988; Бродский и др., 1991; Майтесян, 1992; Маршак и др., 1994). Однако в отдельных случаях с возрастанием размеров ядер и содержания в них ДНК показатели синтеза РНК в расчете на геном либо уменьшались, как в семеннике саранчи (Кикнадзе, Тутурова, 1970), печени крысы (Жинкин и др., 1973) и макронуклеусе инфузории (Berger, 1982), либо, наоборот, увеличивались - в полиплоидных и политенных ядрах некоторых растений (Clutter et al., 1974) и насекомых (Griffith, 1978).
Большинство случаев нарушения эффекта дозы генов так или иначе были связаны с определенными стадиями развития организмов. Таким образом, противоречивость данных может свидетельствовать о многосторонности механизмов регуляции транскрипции в онтогенезе. Анализ активности некоторых групп генов, в частности генов ядрышкового организатора, осложняется возможностью недоредупликации какой-то их части или, напротив, избыточной амплификации. Такие структурные изменения геномов хорошо известны при эндоредупликации (политенизации) хромосом, а также не исключаются и для случаев эндомитотической полиплоидии, например в тканях семенника водомерки (Becker, Nagl, 1994).
Удобным тестом для оценки транскрипционной активности клеток является состояние ядрышко во го аппарата. С этой целью широко используются такие морфо функциональные параметры, как число ядрышек, их суммарная площадь или объем, содержание регуляторных Ag-белков. В настоящее время показано, что связывание AgNC 3 с кислыми ядрышковыми белками служит специфическим маркером функционирующих (активированных) рибосомиых генов. Однако, не совсем понятно, насколько адекватно результаты серебрения отражают непосредственно сам процесс ядрышковой транскрипции. В литературе имеются очень ограниченные сведения о применении данного метода на моллюсках, которые в основном посвящены изучению локализации ядрышкообразующих районов и не касаются проблемы экспрессии рибосомных генов (Viturri et al„ 1991; Insua, Mendez, 1998).
Вопрос о соответствии плоидности ядра и перечисленных параметров ядрышкового аппарата исследовался во многих работах (Mortreuil-Langlois, 1960; Mironescu, Dragomir, 1967; Meinders-Groenveld, James, 1971; Зыбина, Зыбина, 1989; Бродский и др., 1991; Маршак и др., 1994; Zybina et aL, 1996; Штейн, Кудрявцев, 1997). Оказалось, что ожидаемая пропорциональность параметров также выдерживается не всегда, особенно при оценке числа ядрышек в полиплоидных ядрах. Вообще, число ядрышек - самый нестабильный из всех критериев функциональной активности. В настоящее время неясно, как число ядрышек связано с уровнем транскрипции генов рРНК, -данные по этому поводу очень противоречивы.
Подавляющее большинство исследований ядрышкового аппарата проведено на млекопитающих животных. Ядрышки полиплоидных клеток изучались, главным образом, на гепатоцитах. Работы на беспозвоночных немногочисленны и касаются в основном насекомых в связи с развитием у них политении. Состояние ядрышкового аппарата в полиплоидных клетках моллюсков, в том числе брюхоногих, вовсе не изучено. А между тем, эта филогенетическая группа могла бы представить известный интерес для исследователей: во многих тканях гастропод выявляются полиплоидные клетки, формирующиеся посредством эндомитоза (Лнисимов, 1998-1999). Практически не изучена и ультраструктура ядрышек гастропод, как, впрочем, и моллюсков вообще, хотя морфологическая организация ядрышкового аппарата у беспозвоночных животных может иметь свои особенности (Knibiehler et al., 1982; Thiry et al., 19916, 1993; Ченцов, 1995; Scheer et al., 1997). Кроме того, в условиях эндомитотической полиплоидии и повышенной гетерохроматизации интерфазного ядра также можно ожидать проявление нестандартных характеристик ядрышек. В качестве объекта исследования нами выбран легочный брюхоногий моллюск янтарка Succinea lauta - массовый наземный вид на территории южного Приморья. Янтарка является модельным объектом при изучении проблемы соматической полиплоидии и поэтому хорошо изучена в гистогенетическом отношении. Особым преимуществом является короткий (полуторагодичный) жизненный цикл этой улитки (Анисимов, 1986), что позволяет рассматривать динамику ядрышкового аппарата не только в стабильных, сформировавшихся клеточных популяциях, но и в онтогенетическом аспекте.
Цели и задачи работы
Основная цель работы состояла в том, чтобы выявить эффект дозы генов полиплоидных клеток в отношении ядрышек, а также иные возможные факторы, искажающие данный эффект и, наряду с ним, влияющие на развитие ядрышкового аппарата. Предполагалось также показать возможности метода серебрения и цитофотометрии ядрышковых организаторов для оценки функциональных состояний клеток у брюхоногих моллюсков.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1) Методом серебрения на сперматогенных клетках янтарки выявить ядрышковые организаторы и определить число ядрышкообразующих хромосом. 2) Изучить морфофункциональные параметры ядрышек (число ядрышек в ядре, их суммарную площадь и содержание Ag-белков) в ходе развития полиплоидных клеток гермафродитной и белковой желез при половом созревании янтарки.
3) Сравнить вышеуказанные параметры в полиплоидных клетках разных направлений дифференцировки - слизистых и белковых - в уже сформировавшейся клеточной системе слюнной железы на втором году жизни янтарки.
4) Изучить влияние десятисуточного голодания на состояние ядрышек в клетках слюнной железы янтарки.
5) Проанализировать ультраструктуру ядрышек в полиплоидных клетках янтарки.
6) Оценить пригодность метода серебрения и цитофотометрии ядрышковых организаторов для оценки функциональных состояний клеток брюхоногих моллюсков.
Научная новизна
Впервые на одном объекте показана множественная зависимость морфофункциональных параметров ядрышек полиплоидных клеток от различных факторов: уровня плоидности ядер, стадии эндомитотического цикла, стадии развития органа, скорости и направления клеточной дифференцировки, ритма функционирования клеток и их старения, а также от общего физиологического состояния организма. Установлено, что все сопутствующие полиплоидии факторы в той или иной степени искажают эффект дозы генов, изменяют пропорции плоидности ядер и параметров ядрышек.
Впервые в полиплоидных клетках брюхоногого моллюска изучена ультраструктура ядрышек. Показана их вариабельность в ряду: компактные, «кора - сердцевина», нуклеолонемные, ретикулярные - при отсутствии фибриллярных центров и кольцевидных скоплений плотного фибриллярного компонента, характерных для ядрышек млекопитающих.
Впервые показано, что в полиплоидных ядрах на стадии эндомитоза происходит частичная диссоциация ядрышек. Однако, в отличие от обычного митоза, не наблюдается полного исчезновения ядрышек и их раздробления на отдельные ядрышковые организаторы, что может свидетельствовать о сохранении функциональной активности ядрышкового аппарата во время эндомитоза.
Теоретическое и практическое значение работы
Материалы проведенного исследования показывают, что при оценке морфофункциональных параметров ядрышек (число ядрышек, их суммарная площадь и содержание Ag-бєлков) необходимо учитывать всю совокупность факторов, влияющих в данный момент на клетку. На параметры ядрышек полиплоидных клеток влияют: удвоение хромосом в эндомитотических циклах (эффект дозы генов), изменения транскрипции, связанные с дифференцировкой, ритмичностью функционирования и старением клеток, тип клеточной дифференцировки, стадия клеточного цикла и общее физиологическое состояние организма. Такое комплексное рассмотрение вопроса позволяет увидеть как общие закономерности, так и частные особенности функциональных проявлений полиплоидных клеток.
Электронномикроскопические исследования ядрышек янтарки, наряду с некоторыми литературными данными, показывают, что структура ядрышек, типичная для клеток млекопитающих, не может считаться универсальной. Сравнительные исследования на беспозвоночных животных подводят к более широкому взгляду на организацию ядрышкового аппарата у разных организмов.
Для брюхоногого моллюска янтарки показана адекватность использования метода серебрения и цитофотометрии регуляторных Ag-белков в качестве критерия ядрышковой активности. Данный метод может применяться для оценки функциональных состояний клеток и организмов, в том числе в целях экологического мониторинга.
Материалы диссертации могут быть использованы в лекционных курсах по цитологии, гистологии и биологии развития, а также в практикумах по цитохимии, морфометрии и цитофотометрии. Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на I и V Региональных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых по актуальным проблемам морской биологии и экологии (Владивосток, 1998, 2002 гг.); Всероссийском совещании по изучению моллюсков Дальнего Востока России (Владивосток, октябрь 1998); XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, октябрь 1999); Конференции научно-образовательного центра по изучению морской биоты (НОЦ) ДВГУ (Владивосток, сентябрь 2002); I съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, октябрь 2003).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 работ, в числе которых 2 статьи в центральном реферируемом издании и 6 тезисов докладов научных конференций.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 132 страницах и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы, который включает 297 наименований (из них 106 на русском языке и 191 на иностранных). Диссертация содержит 21 рисунок и 11 таблиц.
Благодарности
Выражаю глубокую признательность своему научному руководителю -заведующему кафедрой клеточной биологии ДВГУ, д.б.н., профессору А. П. Анисимову за неоценимую помощь в планировании, осуществлении и написании работы. Также приношу благодарности всем сотрудникам кафедры. Отдельно благодарю Н. Е. Зюмченко за постоянную помощь в освоении компьютерных технологий.
Считаю приятным долгом выразить благодарность коллективу лаборатории эмбриологии ИБМ ДВО РАН за предоставленную возможность работы на ультрамикротоме. Отдельную признательность выражаю Я. Александровой и О. Юрченко за активную помощь и неоценимое содействие, а также Д. В. Фомину и В. С. Машанову за помощь в работе на электронном микроскопе.
Особо благодарю Б. Н. Кудрявцева (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) за ценные замечания и полезную критику. Я также глубоко признательна Д. В. Дзидзигури (Тбилисский гос. университет), Е. В. Зыбиной, Т. Г. Зыбиной, В. Н. Парфенову (Институт цитологии РАН) и В. Ю. Полякову (МГУ) за ценные консультации и помощь в анализе данных по ультраструктуре ядрышек.
Работа выполнена при финансовой поддержке фонда US CRDF и Министерства образования РФ (грант № REC-003), а также с использованием приборного парка ЦКП ДВО РАН «Дальневосточный центр электронной микроскопии».
Ядрышко
Одной из особенностей генома эукариотических клеток является наличие в нём многократно повторенных рибосомных генов, локализованных в специализированных участках хромосом - ядрышкообразующих районах (ЯОР). В результате транскрипции рибосомных генов и последующего процессинга их продуктов формируются рибосомные РНК и затем сами рибосомы. Весь комплекс ЯОР, транскриптов, продуктов процессинга рРНК, созревающих рибосомных частиц и ассоциированных с ними белков, а также ферментов, необходимых для синтеза, превращения и сборки рибосом (РНК-полимераза-1, РНК-метилазы, РНК-процессирующие энзимы и т. д.), и формирует ядрышко (Busch, Smetana, 1970; Goessens, 1984; Hadjiolov, 1985; Челидзе, Зацепина, 1988; Scheer, Benavente, 1990; Fischer et al., 1991; Schwarzacher, Wachtler, 1993; Альберте и др., 1994; Schwarzacher, Mosgoeller, 2000; Leung, Lamond, 2003; Raska, 2003). Созревание рибосом - комплексный, многоступенчатый, векторный процесс; для его осуществления необходим строгий топологический порядок, обеспечивающий взаимодействие многих компонентов (Das et al., 1970; Fakan, Puvion, 1980; Puvion, Moyne, 1981; Goessens, 1984; Fischer et al., 1991; Schwarzacher, Mosgoeller, 2000; Leung, Lamond, 2003; Raska, 2003). Это в известной мере отражается на структурной организации ядрышка.
В составе ядрышка выделяют следующие основные структурные элементы: фибриллярные центры, фибриллярный компонент, гранулярный компонент, ядрышковые вакуоли, около- и внутриядрышковый гетерохроматин (Goessens, 1984; Jordan, 1984, 1991; Hadjiolov, 1985; Челидзе, Зацепина, 1988; Derenzini et al., 1990; Hernandez-Verdun, 1991; Schwarzacher, Wachtler, 1993; Raska, Dundr, 1993; Альберте и др., 1994; Strouboulis, WolfTe, 1996; Schwarzacher, Mosgoeller, 2000; Raska, 2003). Фибриллярные центры (ФЦ) - это структуры, соответствующие ядрышкообразующим районам хромосом. Они образованы рыхло лежащими фибриллами с низкой электронной плотностью, обедненными гистоном Н. Толщина основного класса фибрилл составляет 4—8 нм (Челидзе, Зацепина, 1988; Schwarzacher, Wachtler, 1993). Гетерогенные фибриллярные центры растительных клеток могут содержать участки конденсированного хроматина (Jordan, 1984). Для клеток животных описаны случаи, когда в ядрышках вообще не обнаруживаются ФЦ (Knibiehler et al., 1982; Ploton et al., 1983; Thiry et al., 1991, 1993). В фибриллярных центрах ядрышек с помощью различных методов выявлена ДНК рибосомных генов (рДНК). Совместное применение электронной микроскопии и гибридизации in situ показало, что рибосомные гены в фибриллярных центрах собраны в кластеры (Hadjiolov, 1985), ассоциированные с ядерным матриксом. Последний, видимо, играет определенную роль в процессе репликации рДНК (см. обзоры: Schwarzacher, Watchtler, 1993; Junera et al., 1995). Между прочим, отношения между ядрышками и ядерным матриксом весьма динамичны: последний может примыкать к ядрышку сбоку, может опоясывать его в виде светлого «дворика» или проникать внутрь и раздувать ядрышко «пузырем» (Эренпрейс, Эренпрейс, 1991). Помимо рДНК в составе ФЦ обнаружены также РНК-пол и мераза-1, ДНК-топоизомераза-1, нуклеолин, фибрилларин (белок С23) и транскрипционный фактор UBF - белки, связанные с транскрипцией рДНК и ранним процессингом транскриптов (обзоры: Jordan, 1984; Челидзе, Зацепина, 1988; Fischer et al., 1991; Thiry et at., 1991; Schwarzacher, Wachtler, 1993; Strouboulis, Wolffe, 1996; Schwarzacher, Mosgoeller, 2000; Raska, 2003). ДНК самих фибриллярных центров неактивна в отношении синтеза рРНК.
Однако считается, что транскрипция имеет место на их периферии — в областях, пограничных с плотным фибриллярным компонентом, хотя единого мнения о границах этой зоны не существует (Goessens, Lepoint, 1979; Fakan, Puvion, 1980; Goessens, 1984; Hernandez-Verdun, 1991; Jordan, 1991; Thiry et al., 1991, 1993; Schwarzacher, Wachtler, 1993; Dundr, Raska, 1993; Derenzini, 2000; Schwarzacher, Mosgoeller, 2000; Raska, 2003). Применение рибосомных зондов, комплементарных к спейсерным последовательностям 45S РНК, показало, что в зоне ФЦ совершаются и первые шаги ее процессинга (Fischer et al., 1991). В любом случае, на основании имеющихся данных, ФЦ можно рассматривать как своеобразное «депо» белков и молекулярную основу для синтеза рРНК и образования ядрышка (Knibiehler, Mirre, 1983; Schwarzacher, Wachtler, 1993; Hozak, 1995; Strouboulis, Wolffe, 1996; Schwarzacher, Mosgoeller, 2000; Raska, 2003). Хроматин фибриллярных центров имеет ненуклеосомную организацию. Вместо гистонов с хроматином ФЦ ассоциированы специфические кислые негистоновые белки, имеющие высокое сродство к серебру и названные поэтому Ag-белками (обзоры: Jordan, 1984; Сабанеева, 1989; Derenzini, 2000).
Наиболее вероятно, что именно эти белки поддерживают хроматин ядрышковых организаторов в характерном для него декомпактизованном состоянии, что позволяет рибосомным генам в любой момент вступить в транскрипцию (Dimova et al., 1982; Hernandez-Verdun et al., 1984; Matsui et al., 1986; Сабанеева, 1989). Фибриллярные центры окружены зоной фибрилл более высокой электронной плотности - плотным фибриллярным компонентом (ПФК), 22 содержащим цистроны рДНК и первичные продукты транскрипции в виде 45S пре-рРНК (см. обзоры: Goessens, 1984; Jordan, 1984, 1991; Hadjiolov, 1985; Челидзе, Зацепина, 1988; Fifher et al., 1991; Hernandez-Verdun, 1991; Schwarzacher, Wachtler, 1993; Schwarzacher, Mosgoeller, 2000; Leung, Lamond, 2003; Raska, 2003). Иногда плотный фибриллярный компонент, окружающий ФЦ в виде сплошного слоя, образует впячивания внутрь ФЦ, придавая им чашевидную или сегментированную форму, В зоне ПФК также обнаружены белки фибрилларин и нуклеолин, малые ядерные РНК, РНК-полимераза I и топоизомераза I (Schwarzacher, Wachtler, 1993; Schwarzacher, Mosgoeller, 2000). Многочисленные факты, полученные на основании авторадиографии и молекулярно-биологических методов, показывают, что транскрипция рРНК происходит именно в плотном фибриллярном компоненте или на границе ФЦ и ПФК (Fakan, Puvion, 1980; Mirre, Stahl, 1981; Thiry et al, 1985; Tesarik et al., 1987; Hartung et al., 1990; Stahl et al., 1991; Brechard, 1992: цит. no Schwarzacher, Watchtler, 1993; Dundr, Raska, 1993; Schoefer et al., 1993; Hozak, 1995; Schwarzacher, Mosgoeller, 2000; Raska, 2003). При инактивации ядрышек актиномицином D рДНК оказывается локализованной преимущественно в светлых «шапочках», соответствующих ФЦ (Зацепина, 1992). Впрочем, некоторые авторы утверждают, что ПФК вообще не содержит ДНК (Thiry et al., 1993). Таким образом, локализация внуїриядрьішковой ДНК, видимо, изменяется в зависимости от уровня синтеза рРНК, от физиологического состояния клетки и типа ядрышка (Jimenez-Garcia, 1993).
Питающие клетки гонады
Для изучения параметров ядрышек в ходе полиплоидизации питающих клеток гонады (клеток Сертоли) в работе использовали материал от 6 животных разного размера, собранных в конце июня. Их размерные характеристики и стадии развития гонады указаны в таблице 1. Динамика полишюидизации питающих клеток отражена на рис. 2. В созревающих гонадах (неполовозрелые животные № 1 - 3) сперматозоиды отсутствуют, преобладают сперматоциты I порядка, ядра которых при цитофотометрическом анализе, наряду с ядрами питающих клеток, попадают в класс 4с, Клетки питающего эпителия находятся в процессе полиплоидизации и дифференцировки. Кроме ди- и тетраплоидных ядер в них выявляются также ядра классов 8с и 16с, причем по мере созревания гонады доля октаплоидных ядер уменьшается, а доля ядер с плоидностью 16с увеличивается, и появляются ядра, содержащие 32с ДНК (рис. 2, № 1 - 3). Таким образом, данная выборка животных демонстрирует постепенное развитие половой железы. Три других животных (№ 4 — 6) находились на стадии полной половой зрелости; на препаратах выявлялись не только сперматоциты, но и зрелые сперматозоиды. На гистограммах (рис. 2, № 4 - 6) классы 2с и 4с сформированы исоючительно сперматогенными клетками, октаплоидный класс постепенно исчезает. В популяции питающих клеток отмечается абсолютное преобладание классов 16с и 32с; у одного животного найдены единичные ядра классов 64с и 128с. Таким образом, в зрелой гонаде процессы развития питающих клеток, их полиплоидизации и сопряженной дифференцировки уже завершены, конечные уровни плоидности клеток составляют 16с-32с-64с-(128с). Морфологическое состояние хроматина в полиплоидных ядрах питающих клеток (рис. \, е — л) свидетельствует об эндомитотическом механизме умножения геномов.
Наряду с рыхлыми (интерфазными) ядрами встречаются ядра с конденсированными хромосомами (рис. 1, и). В ходе эндомитотической полиплоидизации ядер питающих клеток гонады общее число ядрышек, их суммарная площадь и содержание ядрышковых Ag-белков закономерно возрастают в каждом эндоцикле (рис. 1, е -л). Далее подробно рассматриваются изменения каждого из названных параметров. Их абсолютные значения приведены на і рафиках (рис. 3 - 5), а динамика изменений выражена соответствующими коэффициентами приращения (табл. 2 — 4), которые показывают, во сколько раз увеличился параметр в ядрах последующего уровня плоидности относительно такого же параметра в ядрах предыдущего уровня плоидности. 3.2.2. Число ядрышек Поскольку размеры ядрышек сильно варьируют, учитывали вес их формы, включая отдельно лежащие аргентофильные гранулы, которые, вероятно, соответствуют так называемым микроядрышкам. В диплоидных ядрах незрелой гонады (№ 1 - 3) чаще всего бывает 2 ядрышка, редко встречаются ядра с 3, 4 или даже 5 ядрышками (рис. З, а). В дальнейшем, в циклах полиплоидизации от 2с до 16с число ядрышек увеличивается с коэффициентом приращения 2 или ниже, а в зрелых клетках при переходе от 16с к 32с и далее к 64с прирост сильно снижается: коэффициент составил 1,2 - 1,5 (табл. 2). В итоге ядра с массой ДНК 32с содержат у разных животных порядка 10-20 (средняя величина около 15,2) ядрышек (см. рис. 3, а, б), то есть в расчете на 2с ДНК примерно 1 ядрышко, вместо 2 ядрышек в исходных диплоидных ядрах. В эндомитотических ядрах происходит диссосиация крупных ядрышек, что обусловлено компактизацией хромосом. Крупные ядрышки приобретают неправильные контуры, появляется много мелких ядрышек, сопоставимых с ядрышками сперматогониев, а их общая численность возрастает (рис. 1, и). В Динамика приращения ядрышковых белков, как и динамика площади, у улиток первой группы имеет нелинейный характер (рис. 5, табл. 4). Так, у животных № 1 и 2 от уровня 2с к 4с и далее к 8с содержание Ag-белков ядрышка растет с коэффициентом больше 2 {от 2,1 до 2,6), т.е. с опережением увеличения массы ДНК. Затем, при полиплоидизации от 8с к 16с наблюдается точное удвоение Ag-белков, но при переходе к уровню 32с коэффициент прироста падает до 1,6. У животного № 3 отмечается еще более высокий прирост массы Ag-белков от 2с к 4с (коэффициент 3,2) и более резкий спад от 16с к 32с (коэффициент 1,4) при соблюдении линейности в диапазоне 4с - 16с. Таким образом, несмотря на сходство в характере кривых, динамики площади ядрышек и массы Ag-белков несколько различаются в пропорциях. Незначительные на первый взгляд различия коэффициентов приращения этих параметров в каждом отдельном эндоцикле, суммируясь, приводят к существенному опережению прироста Ag-белков над приростом площади. В усредненном выражении содержание Ag-белков увеличивается от 0,4 усл. ед. в диплоидных ядрах до 7,1 усл. ед. в 32с-ядрах, т.е. почти в 18 раз при 16-кратном увеличении плоидности, с коэффициентом приращения около 2,1 на один цикл.
Следовательно, суммарное содержание Ag-белков ядрышкового аппарата в клетках созревающей гонады (животные № 1 - 3) растет в целом пропорционально увеличению массы ДНК (рис.5, о; табл.4). Графически это выражается наклоном линий регрессии под углом, близким к 45 . У животных второй группы (№ 4-6) вполне зрелые и функционирующие клетки Сертоли представлены в основном двумя классами - 16с и 32с. Для животных № 4 и 5 абсолютные значения Ag-белков и коэффициенты их приращения близки значениям, полученным для тех же уровней плоидности в клетках незрелой гонады: 32с-ядра увеличивают содержание Ag-бслков всего лишь в 1,3 - 1,6 раза по сравнению с 16с-ядрами (рис. 5, 6; табл. 4). В то же время у животного № 6, где присутствуют клетки высших классов плоидности -32с, 64с и даже 128с, зарегистрированы четкие двукратные различия содержания Ag-белков в ядрах возрастающих классов плоидности (см. рис. 5, б; табл. 4), вероятно, связанные с функциональным состоянием гонады (см. Обсуждение). У животного № 2 количество тетраплоидных ядер в зачатке белковой железы заметно увеличено, появляются также ядра класса 8с; полиплоидные ядра составляют вместе около 30 %. Такое состояние железы соответствует II стадии -ранней полиплоидизации. В белковой железе животного № 3 полиплоидизация клеток приобретает массовый характер. При доминировании тетраплоидного класса отчетливо выделяется класс 8с, а также регистрируются ядра, содержащие 16с ДНК. В октаплоидных клетках появляются секреторные гранулы, а в ходе дальнейшей полиплоидизации число и размеры іранул быстро возрастают. Такое соотношение классов плоидности при наличии первых признаков секретообразования обозначает начало III стадии - интенсивной полиплоидизации и роста железы. У животных № 4 - 6 наблюдается типичная III стадия. Снижается доля тетраплоидных ядер, что объясняется переходом их в более высокие классы 8с и 16с, являющиеся модальными на этой стадии; появляются ядра класса 32с. Железа приобретает зрелые формы, ее высокоплоидные клетки (16с — 32с) заполнены секретом. Животные № 7 - 9 из второй выборки имели крупные зрелые железы на V стадии - стадии продолженного функционирования. Модальные классы плоидности ядер - 16с и 32с. Параметры ядрышкового аппарата закономерно изменяются в ходе полиплоидизации и дифференцировки клеток на разных стадиях развития белковой железы. Основная тенденция определяется уже визуально: при относительно постоянном числе ядрышек их размеры и содержание Ag-белков увеличиваются по мере полиплоидизации ядер (рис. 7). 3.3.2. Число ядрышек Число ядрышек мало изменяется в ядрах разных классов плоидности и на разных стадиях развития белковой железы (рис. 8). На I - II стадиях (животные № 1 и 2) диплоидные ядра содержат от 1 до 5, чаще 1-2 ядрышка. Полиплоидизация до 4с на II стадии (животное № 2) не дает прироста числа ядрышек - в среднем имеется по 2 ядрышка как в ди-, так и в тетраплоидных ядрах (рис. 7, а; 8, а). Это значит, что коэффициент приращения признака равен 1 (табл. 6), а число ядрышек в расчете на 2с ДНК снижается от 2 в диплоидных ядрах до 1 в тетраплоидных.
Секреторные клетки белковой железы
Динамика полиплоидизации секреторных клеток Для изучения ядрышковых параметров полиплоидизирующихся клеток в ходе созревания белковой железы использованы 9 животных разной степени половозрел ости. Их размеры и стадии развития белковой железы отражены в таблице 5. Животные № 1 - 6 взяты из первой (позднеиюньской) выборки, № 7 — 9 - из второй (конец июля - начало августа). Динамика полиплоидизации секреторных клеток на разных стадиях развития желез представлена на рис, 6 в виде частотных распределений ядер по содержанию ДНК. Животное № 1 имело зачаточную белковую железу на I стадии развития. По данным цитофотометрии ДНК почти все ядра здесь диплоидные. Редкие ядра с тетраплоидньгм содержанием ДИК, по всей вероятности, находятся в С2-периоде митотического цикла, так как на препарате регулярно встречаются митозы. У животного № 2 количество тетраплоидных ядер в зачатке белковой железы заметно увеличено, появляются также ядра класса 8с; полиплоидные ядра составляют вместе около 30 %. Такое состояние железы соответствует II стадии -ранней полиплоидизации. В белковой железе животного № 3 полиплоидизация клеток приобретает массовый характер. При доминировании тетраплоидного класса отчетливо выделяется класс 8с, а также регистрируются ядра, содержащие 16с ДНК. В октаплоидных клетках появляются секреторные гранулы, а в ходе дальнейшей полиплоидизации число и размеры іранул быстро возрастают. Такое соотношение классов плоидности при наличии первых признаков секретообразования обозначает начало III стадии - интенсивной полиплоидизации и роста железы. У животных № 4 - 6 наблюдается типичная III стадия.
Снижается доля тетраплоидных ядер, что объясняется переходом их в более высокие классы 8с и 16с, являющиеся модальными на этой стадии; появляются ядра класса 32с. Железа приобретает зрелые формы, ее высокоплоидные клетки (16с — 32с) заполнены секретом. Животные № 7 - 9 из второй выборки имели крупные зрелые железы на V стадии - стадии продолженного функционирования. Модальные классы плоидности ядер - 16с и 32с. Параметры ядрышкового аппарата закономерно изменяются в ходе полиплоидизации и дифференцировки клеток на разных стадиях развития белковой железы. Основная тенденция определяется уже визуально: при относительно постоянном числе ядрышек их размеры и содержание Ag-белков увеличиваются по мере полиплоидизации ядер (рис. 7). Число ядрышек Число ядрышек мало изменяется в ядрах разных классов плоидности и на разных стадиях развития белковой железы (рис. 8). На I - II стадиях (животные № 1 и 2) диплоидные ядра содержат от 1 до 5, чаще 1-2 ядрышка. Полиплоидизация до 4с на II стадии (животное № 2) не дает прироста числа ядрышек - в среднем имеется по 2 ядрышка как в ди-, так и в тетраплоидных ядрах (рис. 7, а; 8, а). Это значит, что коэффициент приращения признака равен 1 (табл. 6), а число ядрышек в расчете на 2с ДНК снижается от 2 в диплоидных ядрах до 1 в тетраплоидных. В начале III стадии число ядрышек в высокоплоидных ядрах (16с - 32с) увеличивается в среднем до 3 (рис. 7, б, в; 8. а, б — животные № 3 и 4), но с приближением терминальной диффереицировки оно становится минимальным -независимо от уровня плоидности в большинстве ядер выявляется одно, реже два ядрышка (рис. 8, 6 - животные № 5 и 6). Соответственно, удельное число ядрышек в ряду 2с — 4с - 8с - 16с - 32с уменьшается в последовательности 1 - 0,6 - 0,3 — 0,15 — 0,07, т. е. в 2 раза с каждым эндоциклом. Вместе с тем, на III стадии иногда встречаются ядра с множественными (более 10) ядрышками разного размера, и, кроме того, в ядрах часто присутствуют мелкие (порядка 0,5 - 1 мкм) аргентофильные гранулы (при расчете среднего числа ядрышек они не учитывались). Общая морфология хроматина в таких ядрах указывает на их эндомитотическое состояние (рис. 7, г - ё). С учетом эндомитозов, в целом число ядрышковых элементов колеблется для ядер класса 8с от 1 до 8— 10, для класса 16с - от 1 до 15—20, для класса 32с - от 1 до 30—40. Как видно, прохождение эндомитоза в клетках белковой железы сопровождается расщеплением комплексных ядрышек, но по сравнению с клетками Сертоли гонады степень диссоциации еще больше отстает от теоретически ожидаемой.
Таким образом, в отличие от митоза, в ходе эпдомитоза ядрышко не разрушается полностью, что может указывать на сохранение его функциональной активности. Доля эндомитотических ядер в III стадии белковой железы не превышает 3 - 5 %, так что в целом они не искажают общую тенденцию к минимизации числа ядрышек в полиплоидных ядрах. На V стадии развития белковой железы (животные № 7 - 9) в полиплоидных ядрах выявляется в среднем 1-2 ядрышка (рис. 8, в). В отдельных ядрах попрежнему встречается 3-4 и более ядрышек, размеры которых, как правило, не одинаковы (рис. 7, з, и). Самые мелкие элементы сопутствуют, как и в III стадии, эндомитозам - очень редким в зрелой железе (рис. 7, и). Различия средних чисел ядрышек между классами 8с и 32с составляют 1,60 - 1,93 крат, а коэффициент приращения признака на один эндоцикл - всего лишь 1,08 - 1,48, что далеко ие соответствует его удвоению (см. табл. 6). Отмеченные вариации среднего числа ядрышек в ходе полиплоидизации и дифференцировки клеток статистически достоверны - в соответствующих точках кривых, приведенных на рис. 8, доверительные интервалы не перекрываются (число ядрышек в 16с-ядрах против 2с- и 4с-ядер у животного № 3; число ядрышек в 16с- и 32с-ядрах животных № 5 и 6 против таких же ядер животного № 4; число ядрышек в 32с-ядрах против 8с-ядср у животных № 8 и 9). В целом, несмотря на тенденцию к умножению числа ядрышек при полиплоидизации ядер на ранней III и наV стадиях развития железы, ни на одной стадии не наблюдалось статистически достоверного удвоения данного признака: эмпирические коэффициенты в большинстве случаев были достоверно ниже ожидаемого коэффициента 2 (см. табл. 6). 3.3.3.
Суммарная площадь ядрышек Динамика суммарной площади ядрышек в ходе полиплоидизации секреторных клеток белковой железы показана па рис. 9 и в табл. 7. В диплоидных ядрах животного № 1 (I стадия) показатель площади составляет около 0,2 усл. ед. У животного № 2 (II стадия) он равен 0,19 в диплоидных и 0,44 усл. ед. в тетраплоидных ядрах, т. е. в первом эндоцикле площадь ядрышек увеличивается в 2,35 раза. На ранней III стадии (животное № 3) с появлением классов ядер 8с и 16с в целом выдерживается линейная зависимость размеров ядрышек от шюидности ядер, причем коэффициент приращения площади ядрышек в каждом эндоцикле сохраняется больше 2 (рис. 9. а: табл. 7). В целом за 3 эндоцикла площадь ядрышек увеличилась в 12,1 раза мри 8-кратном увеличении ДНК. Превышение темпа роста ядрышек над темпом полиплоидизации ядер статистически не достоверно, но тенденция обозначена: вероятность уклонения коэффициента 12,1 от коэффициента 8 (т. е. от геометрической прогрессии с коэффициентом 2) составляет 71 %, тогда как вероятность их сходства оценивается иссго в 29 %. В период интенсивной полиплоидизации секреторных клеток, с приближением их терминальной дифференцировки, (III стадия) зависимость площади ядрышек от шюидности ядер теряет линейный характер (рис. 9, б; табл. 7 - животные № 4 - 6). На отрезке от 2с до 8с наблюдается опережающий прирост площади ядрышек с коэффициентом больше 2 (2,96 - 3,90) на один цикл полиплоидизации. Вероятность превышения коэффициентов над величиной 2 в отдельных циклах колеблется от 72,5 % до 93,8 % (не достигает статистической достоверности в 95 %). но при сравнении крайних точек - от 2с к 8с - коэффициенты приращения площади ядрышек (К) отличаются от теоретически ожидаемого коэффициента 4 с высокой достоверностью. У животного № 4 К = 10.00 ± 2,49. Р = 98,4 %. а у животных № 5 и 6 К = 13,70 ± 1,66 и 14,12 ±2,25
Слизистые и белковые клетки елюнной железы
Сравнительная оценка параметров ядрышек в двух тинах клеток проведена на слюнных железах 6 улиток-годовиков с размером раковины около 10-12 мм, собранных в начале лета. Это были активно питающиеся неполовозрелые животные в состоянии продолжающегося соматического роста. Конечные результаты, отраженные на графиках и в таблицах, получены путем усреднения данных от 6 исследованных улиток. 3.4.1. Строение слизистых и белковых клеток Строение слизистых и белковых клеток яптарки существенно различается. В елизисшх клетках (рис. 12, а) основной объем цитоплазмы занят относительно мелкими (до 2 мкм) секреторными гранулами; шероховатый эндоплазматическии ретикулюм (ШЭР) развит слабо и представлен узкими полосками вокруг ядра, между гранулами и по периферии, В белковых клетках (рис. 12, б) ШЭР развит значительно сильнее и занимает обширные базальные (околоядерные) участки; крупные (5-7 мкм) секреторные вакуоли концентрируются в апикальной половине клетки. С учетом различий объемов ШЭР, а также по данным гистохимии (Beltz, Gelperin, 1979; Moreno et al., 1982; Повещен ко, Анис и мов, 1986), можно ожидать разную интенсивность производства рибосом и, соответственно, разную степень развития ядрышек в слизистых и белковых клетках. На давленых препаратах слизистые и белковые клетки также различаются (рис. 13), что принципиально важно для определения принадлежности ядер и ядрышек к тому или иному клеточному типу. Слизистые клетки при расплющивании, как правило, не разрушаются и распознаются по гомогенной цитоплазме. Они одноядерные, часто располагаются попарно или небольшими группами.
Хроматин преимущественно рыхло-сетчатый {рис. 13, а — в). Белковые клетки также одноядерные, но крупнее слизистых. Цитоплазма вакуолизирована и хорошо раздавливается. Хроматин конденсирован в форме крупных глыбок (рис. 13, б - и). 3.4.2. Уровни плоидности ядер слизистых и белковых клеток Уровни плоидности ядер, специфичные для клеток определенных типов, варьировали у исследованных яптарок примерно в одинаковой степени. На рис. 14 показаны результаты цитофотометрии ДНК в ядрах одного из исследованных животных. Ядра классов 2с и Ас принадлежат малодифферсицированным, вспомогательным (промежуточным) и соединительнотканным клеткам слюнной железы. Популяция слизистых клеток определяется с уровня 4с и выше. Уверенно выделяются классы плоидности ядер 8с - 16с — 32с (рис. 14, б). Белковые клетки идентифицируются при достижении плоидиости 8с, а зрелого состояния достигают, по-видимому, на модальных уровнях 16с - 32с - 64с (рис. 14, в). Имеется также немногочисленный, но достаточный для получения репрезентативной выборки класс 128с, Встречались ядра классов 8с - 16с, которые нельзя было отнести ни к слизистым, ни к белковым клеткам (см. рис. 13, г). Они принадлежали друїим типам клеток, которые многочисленны в слюнной железе брюхоногих моллюсков, но плохо идентифицируются на давленых препаратах. В нашей работе такие ядра не исследовались. При оценке ядрышковых параметров двух типов дифференцированных клеток выявились как общие, так и специфические черты, обусловленные, с одной стороны, полиплоидизацией клеток, а с другой - их функциональной специализацией. 3.4.3. Морфология ядрышек слизистых и белковых клеток Морфология ядрышек, если не считать их размерных вариаций, в слизистых и белковых клетках принципиально не различается. На светооптических давленых препаратах, обработанных AgNC 3, ядрышки имеют округлую или неїіранильную форму и гетерогенны по своей структуре: в них различаются отдельные аргентофильные гранулы и глыбки на фоне менее плотного аморфного материала (рис. 13}.
В высокоплоидных ядрах белковых клеток (64с — 128с) гигантские ядрышки представляют собой сложные конгломераты, чаще .неправильной формы, образованные слиянием многочисленных гранул, а самые мелкие ядрышки содержат единичные аргентофильные гранулы, погруженные в аморфный материал (рис. 13, ж — и). Встречаются также «голые» іранульї, которые как ядрышки нами не учитывались. %. В большинстве ядрышек основной объем занят более или менее однородным фибриллярно-гранулярным материалом, внутри которого выявляются гомогенные участки повышенной электронной плотности (рис. 15, а, 6). Последние, по-видимому, соответствуют аргентофильным глыбкам и гранулам, выявляемым на давленых препаратах. Ближе к периферии ядрышек, как правило, различимы скопления гранулярного материала - в виде локальных шапочек или неровного кольца (рис. 15, а, б). В целом структура ядрышек варьирует от компактной до структуры типа «кора-сердцевина». В редких случаях, в частности в гигантских ядрышках белковых клеток, гранулярный материал явно преобладает над фибриллярным, в нем появляются небольшие пустоты, так что ядрышки приобретают черты нуклеолонемной организации (рис. 15, в).
Размер гранул варьирует от 15 до 30 им, что может соответствовать как зрелым рибосомным субчастицам, так и незрелым РНП-структурам в состоянии транскрипции и/или проиессинга. И в слизистых, и в белковых клетках слюнной железы янтарки наблюдается связь ядрышка с несколькими хромосомами (см. рис. 12, а\ 15). Вблизи контактов ядрышко бывает пронизано гетерохроматиновыми (хромонемными) тяжами толщиной 0,1 - 0,2 мкм, простирающимися от хромосом (рис. 15. в, г). Множественные контакты с хромосомами, скорее всего, являются морфологическим выражением процесса агрегации ядрышкообразуюших районов, в результате которого формируется комплексное ядрышко. Напомним, что у Succinea lauta из 22 хромосом 8 имеют ядрышковые организаторы разной величины. При полиплоидизации ядер число организаторов соответственно увеличивается. 3.4.4. Число ядрышек Число ядрышек в ядрах слизистых и белковых клеток очень не постоянно. При этом размеры ядрышковых элементов в одном ядре также варьируют случайным образом и различаются на давленых препаратах в несколько раз - от 2-3 мкм до 14 мкм в слизистых клетках и до 50-80 мкм в белковых (см. рис. 13). Тем не менее, усредненные данные показывают определенную зависимость числа ядрышек от илоидности ядер. Так. в популяции слизистых клеток среднее число ядрышек в тетраплоидных ядрах равняется 1,7, в октаплоидных возрастает до 2,0, R ядрах класса 16с достигает 2,6 и в 32с-ядрах - 3,15 (рис. 16, а). В ядрах белковых клеток, образующих полиплоидный ряд &с - 16с - 32с -64с — 128с, соответствующие средние значения составили 1,9 - 2,2 - 2,6 3,7 -5,4 ядрышек (рис. 16, б). Таким образом, большая вариабельность числа ядрышек в индивидуальных ядрах не скрывает общую тенденцию к увеличению данного параметра по мере полиплоилизации ядер: от 1-2 в тетраплоидных ядрах до 2-3 в ядрах класса 32с и 5-7 в самых высокоплоидных ядрах класса 128с. Максимальное число ядрышек в отдельных ядрах может достигать 10-20 и более элементов. Причем на одинаковых уровнях илоидности между клетками двух типов не обнаруживается статистических различий по числу ядрышек (рис. 16).
