Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Топографо-анатомическое и гистологическое строение переднебокового отдела брюшной стенки 11
1.2 Причины возникновения первичных и послеоперационных вентральных грыж 15
1.3 Виды современных эндопротезов с антибактериальными свойствами 17
1.4 Влияние эндопротеза на ткани брюшной стенки после имплантации 24
1.5 Тучные клетки и их участие в воспалительном процессе 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 33
2.1 Дизайн исследования 33
2.2 Материалы исследования
2.4 Морфологические и морфометрические методы исследования 38
2.5 Иммуногистохимическое исследование 41
2.6 Микробиологическое исследование 42
2.7 Ионометрический метод 43
ГЛАВА 3. Результаты собственного исследования 45
3.1 Результаты исследования реактивных изменений соединительной ткани передней брюшной стенки при имплантации образцов эндопротезов в стерильных условиях 45
3.2 Результаты исследования реактивных изменений соединительной ткани передней брюшной стенки при имплантации образцов эндопротезов в условиях микробной обсемененности 69
3.3. Результаты ионометрического исследования концентрации ионов серебра в тканях и морфометрического исследования гигантских многоядерных клеток и тучных клеток при имплантации образцов эндопротезов в стерильных условиях и условиях микробной обсемененности 103
Заключение .109
Выводы .124
Практические рекомендации 126
Список литературы
- Причины возникновения первичных и послеоперационных вентральных грыж
- Тучные клетки и их участие в воспалительном процессе
- Морфологические и морфометрические методы исследования
- Результаты ионометрического исследования концентрации ионов серебра в тканях и морфометрического исследования гигантских многоядерных клеток и тучных клеток при имплантации образцов эндопротезов в стерильных условиях и условиях микробной обсемененности
Причины возникновения первичных и послеоперационных вентральных грыж
Передняя и боковая брюшная стенка — наиболее частое место возникновения грыж. Для детального изучения вопроса о причинах данного осложнения необходимо рассмотреть ее нормальное строение и акцентировать внимание на «слабых местах». Кроме того, следует обратить внимание на микроскопическое строение тканей, образующих эти слои, т.е. их гистологию. Послойное строение передней брюшной стенки удобнее всего описывать в следующей последовательности: кожа, подкожная клетчатка, поверхностная фасция, мышечно-апоневротический слой, внутрибрюшная фасция, предбрюшинная клетчатка и париетальная брюшина. Кожа на животе тонкая, подвижная, легко собирается в складку, отличается растяжимостью. Она образована тонким эпидермисом со слабо развитым роговым слоем, сравнительно толстой дермой; имеются волосы и кожные железы. Эпидермис состоит из четырех слоев: базального, шиповатого, зернистого и рогового. Дерма — соединительнотканная часть кожи — располагается под эпидермисом, обеспечивает его питание, придает коже прочность и содержит ее производные. Включает два слоя: сосочковый (состоит из рыхлой волокнистой соединительной ткани с лимфатическими и кровеносными капиллярами, нервными волокнами и окончаниями) и сетчатый (образован плотной волокнистой неоформленной соединительной тканью и содержит сеть пучков коллагеновых и эластических волокон) [30, 121].
Подкожная клетчатка может содержать значительное количество жира, особенно в нижней половине живота, за исключением области пупка, где жира совсем нет, и белой линии, где жира обычно мало [116]. Подкожная клетчатка (гиподерма) играет роль теплоизолятора, депо питательных веществ, витаминов и гормонов, обеспечивает подвижность кожи. Поверхностная фасция является продолжением поверхностной фасции груди и состоит из двух листков: поверхностного и глубокого. Поверхностный листок тонкий и рыхлый, расположен под поверхностным слоем клетчатки и переходит на соседние области. Глубокий листок хорошо выражен в нижней половине живота и известен под названием фасции Томсона. Фасции и апоневрозы или фиброзные мембраны представлены плотной волокнистой оформленной соединительной тканью. Данная ткань характеризуется высоким содержанием волокон, малым количеством основного аморфного вещества, низким содержанием клеточных элементов и преобладанием фиброцитов над остальными клетками. Фиброзные мембраны трудно растяжимы вследствие того, что пучки коллагеновых волокон и лежащие между ними фибробласты и фиброциты располагаются в определенном порядке (обычно в направлении действия нагрузки) в несколько слоев. В каждом слое волнообразно изогнутые пучки коллагеновых волокон идут параллельно друг другу в одном направлении, не совпадающем с направлением в соседних слоях. Отдельные пучки волокон переходят из одного слоя в другой, связывая их между собой [32, 110, 118].
Собственная фасция живота образована тонкой фиброзной пластинкой, которая нередко рассматривается как perimysium externum наружной косой мышцы [113, 119]. Переднебоковая стенка живота состоит из 5 пар мышц. Спереди, по бокам от белой линии живота, расположены прямые мышцы, подкрепленные внизу двумя пирамидальными мышцами. Кнаружи от них, образуя боковые стенки, располагаются в три слоя наружная косая, внутренняя косая и поперечная мышцы живота [21].
Скелетная мышца как орган состоит из пучков мышечных волокон, соединенных воедино системой соединительнотканных компонентов. Последние представлены эпимизием, перимизием и эндомизием. Эпимизий — тонкий, прочный и гладкий снаружи чехол из плотной волокнистой соединительной ткани, окружающий всю мышцу. Перимизий — тонкие, разветвляющиеся и не всегда четко очерченные соединительнотканные перегородки, отходящие от внутренней поверхности эпимизия вглубь мышцы. Он образует оболочки отдельных пучков мышечных волокон, численностью 10-100 (наиболее часто — около 20) волокон. Эндомизий — тончайшие прослойки рыхлой волокнистой соединительной ткани, отходящие от перимизия внутрь пучков мышечных волокон и окружающие каждое мышечное волокно. Соединительнотканные волокна эндомизия вплетаются в базальную мембрану мышечных волокон [29]. Внутрибрюшная фасция, fascia endoabdominalis, выстилает брюшную стенку изнутри. Та часть внутрибрюшной фасции, которая прилежит к поперечной мышце живота, получила название поперечной фасции (fascia transversalis). В верхнем отделе живота она тонкая, книзу, особенно ближе к паховой связке, утолщается, превращаясь в фиброзную пластинку. При выхождении внутренностей из брюшной полости внутрибрюшная фасция входит в состав оболочек грыжевого мешка [24]. Предбрюшинная клетчатка (tela subserosa) отделяет поперечную фасцию от брюшины. Клетчатка неодинаково выражена в разных отделах: вверху, спереди она выражена слабо, в нижнем отделе, особенно ближе к лобковому симфизу, а также в задних отделах развита хорошо. Благодаря наличию этой клетчатки брюшинный мешок может быть легко отсепарован тупым путем от предлежащих слоев на значительном протяжении [27]. Париетальная брюшина (peritoneum parietale) вверху прилежит к диафрагме и ее фасции, впереди переходит на переднюю брюшную стенку. Внизу, по передней брюшной стенке, она не доходит до паховой связки примерно на 1 см. Париетальная брюшина покрыта мезотелием — однослойным плоским эпителием. Его клетки — мезотелиоциты – плоские, имеют полигональную форму и неровные края. На свободной поверхности клетки имеются микроворсинки. Через мезотелий происходят выделение и всасывание серозной жидкости. Благодаря его гладкой поверхности легко осуществляется скольжение внутренних органов.
Тучные клетки и их участие в воспалительном процессе
Во всех сериях экспериментальной части исследования с целью изучения реакции соединительной ткани на имплантацию сравниваемых эндопротезов, лабораторным животным проводили эндопротезирование передней брюшной стенки по методу onlay. После внутрибрюшинного введения крысам 20% раствора хлоралгидрата в дозе 200 мкл/100 граммов веса животного в условиях операционного блока кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии им. А.Д. Мясникова ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России. Операционное поле двукратно обрабатывали 1% раствором йодопирона, однократно – 95% раствором этилового спирта и укрывали стерильным операционным бельём. Далее, животным проводили рассечение кожи и подкожно - жировой клетчатки по средней линии живота в верхней трети длиной 4 см. В стороны отсепаровывали кожу и подкожно-жировую клетчатку от апоневроза прямых мышц. Тупо выделяли участок апоневроза прямых мышц живота размером 4х4 см (рисунок 2). Рисунок 2 - Фотография этапа эндопротезирования передней брюшной стенки - выделение участка апоневроза прямых мышц живота
К этому участку узловыми швами мононитью 2/0 фиксировали сетчатый эндопротез размером 22 см. Эндопротез подшивали со всех сторон отдельными узловыми швами (рисунок 3).
Из центральной части брюшной стенки иссекали фрагмент вместе с имплантированными в неё образцами эндопротезов с окружающими их тканями размером 2,0x2,0 см. Полученный биологический материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. После фиксации, иссекали меньшие кусочки тканей с фрагментами имплантированных эндопротезов и после промывки, обезвоживания и пропитывания парафином по стандартной методике, микротомировали. Срезы, толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, по методу Ван Гизон, по Маллори, Шик-реакция с докраской альциановый синий.
Микроскопирование и микрофотосъёмку проводили с помощью оптической системы, состоящей из микроскопа Leica CME и окуляр-камеры DCM - 510 на увеличениях х40, х100, х200 и х400 крат с документированием снимков в программе FUTURE WINJOE, входящей в комплект поставки окуляр-камеры.
На микрофотографиях оценивали площадь воспалительно-клеточного инфильтрата вокруг нитей эндопротезов, строение соединительнотканной капсулы, наличие и выраженность ее слоев, степень зрелости коллагеновых волокон и толщину (рисунок 6).
Так же исследовали состав клеточного слоя капсулы, непосредственно прилегающего к нитям эндопротеза. По кариологическим признакам дифференцировали клетки волокнистой соединительной ткани. Процентное соотношение указанных представителей клеточной популяции рассчитывали после подсчёта 100 клеток в нескольких непересекающихся полях зрения (не менее 10). [1].
С целью объективного сравнения реакции соединительной ткани на используемые материалы, исходя из роли отдельных клеточных элементов в раневом процессе по М.И. Кузину и В.В. Серову вычисляли клеточный индекс, представляющий собой отношение клеток гистиоцитарного ряда (клеток 40 резидентов) к клеткам воспалительного инфильтрата (клеткам-нерезидентам) по следующей формуле: где: К.И. – клеточный индекс, К.р. – клетки-резиденты: общее количество макрофагов, фибробластов и фиброцитов; К.р. – клетки-нерезиденты: общее количество гранулоцитов, агранулоцитов и тучных клеток в клеточном слое капсулы. При значении клеточного индекса 1 делали вывод о преобладании воспалительных изменений, характерных для I фазы течения раневого процесса, при значении 1 дели вывод о преобладании репаративных тенденций, характерных для II фазы по М.И. Кузину [7]. Для определения индекса дегрануляции тучных клеток на цифровых микрофотографиях в 10 стандартных полях зрения проводили подсчет тучных клеток в грануляционной ткани, формирующейся вокруг эндопротеза, определяли соотношение разных типов тучных клеток (Линдер, 1976) [58]. Определяли индекс дегрануляции условных единицах как отношение количества дегранулированных клеток к их общему числу тучных клеток: ИД = ((А0)+(Б1)+(В2)+(Г3))/n где: ИД – индекс дегрануляции;
А – число недегранулирующих клеток (Т0); Б – слабодегранулирующие тучные клетки, (Т1); В – клетки с умеренной степенью дегрануляции, (Т2); Г – клетки с сильной степенью дегрануляции, (Т3); n – общее число тучных клеток. Отдельно проводили подсчет количества гигантских многоядерых клеток в стандартном поле зрения. Учитывали размеры клеток, количество ядер и их расположение в цитоплазме. Для изучения функциональной активности
Морфологические и морфометрические методы исследования
Наблюдение за состоянием послеоперационных ран на 3 сутки показало, что при использовании эндопротезов «Унифлекс» и «Эсфил» воспалительные изменения были выражены в меньшей степени, чем при использовании импланта «Плазмофильтр». В последнем случае, при осмотре обращало на себя внимание отсутствие нескольких кожных швов и раневое отделяемое серозно-гнойного характера. При имплантации эндопротеза «Плазмофильтр», в 4 случаях из 10, отмечалась несостоятельность кожных швов, из раны гнойное отделяемое. У одного животного эндопротез мигрировал наружу. Полость раны была заполнена гноем. Подлежащая мышечная ткань некротизирована. При использовании эндопротезов «Унифлекс Ag» и «Эсфил Ag» отмечалась гиперемия краев раны, отек, серозно-гемморагическое отделяемое.
Наибольшая микробная обсемененность раны микроорганизмами E.coli наблюдалась после имплантации эндопротеза «Унифлекс» и составила 333,5±1,43х106 КОЕ, наименьшая при использовании «Унифлекс Ag» -20,1±1,44х106 КОЕ. После имплантации «Эсфил Ag» количество КОЕ было 26,3±1,59 х106, «Эсфил» 271,8±1,83х106, «Плазмофильтр» - 4,6±0,87 х106. Обсемененность раны золотистым стафилококком была значительно меньше, чем в группах с кишечной палочкой, но в сравнительном аспекте наибольшее количество КОЕ было у «Эсфил» 70,9±2,15х106. При использовании «Унифлекс» -33,5±1,43 х106 КОЕ. Наименьшее количество КОЕ было при использовании эндопротезов с антибактериальным покрытием: «Унифлекс Ag» - 9,4±1,6х106, «Эсфил Ag» - 15,2±1,43х106, «Плазмофильтр» - 2,6±0,97 х106.
При световой микроскопии гистологических препаратов на 3-е сутки эксперимента, при использовании стандартных эндопротезов «Унифлекс» и «Эсфил» реактивные изменения в окружающей соединительной ткани значительно выражены. Ткань отечна, наблюдается распространение инфильтрата в выше и нижележащие слои. Площадь инфильтрата достоверно больше (р0,05) в 1,7 и 1,8 раз по сравнению с одноименными протезами с нанесением ионов серебра (таблица 10).
Вокруг нитей эндопротеза «Эсфил» располагаются коллагеновые волокна, приобретающие упорядоченное направление, плотность клеток высокая. Индекс пролиферации составил 31,11%. Тучные клетки находятся в стадии накопления секрета (I тип) (рисунок 31 Б).
Рисунок 31 - Микрофотография ткани, окружающей эндопротез «Эсфил» на 3 сутки эксперимента в условиях микробной обсемененности. Окр. Г+Э. А – упорядоченные коллагеновые волокна вокруг нитей протеза. Ув.х400. Б – скопление тучных клеток вокруг нитей протеза. Ув.х 400 В поле зрения много макрофагов. В непосредственной близости к эндопротезу располагаются единичные гигантские многоядерные клетки, маленьких размеров, в оксифильной цитоплазме которых находятся 3-4 гипохромных ядра.
Наблюдаются участки некроза, нейтрофильная инфильтрация. Плотность клеток на единицу площади больше по сравнению со стерильными условиями (рисунок 34). Клеточный индекс достоверно (р0,05) меньше, чем при использовании других имплантов (таблица 11), что говорит о более сильном воспалении. При этом индекс пролиферации составил 36,57%. Рисунок 34 - Микрофотография ткани, окружающей эндопротез «Плазмофильтр» на 3 сутки эксперимента в условиях микробной обсемененности. Окр. Г+Э. А – нейтрофильная инфильтрация вокруг нитей протеза. Ув. х 400. Б – скопление нейтрофилов вокруг нитей протеза. Ув. х 400
Гигантские многоядерные клетки единичны в поле зрения, располагаются на некотором расстоянии от нитей эндопротезов, Состоят из 2-х ядер, небольших размеров. Ядра располагаются неупорядоченно. Наблюдается большое количество вертикально расположенных кровеносных сосудов. В поле зрения тучные клетки, лимфоциты, моноциты единичны, фибробласты гипертрофированы. Тучные клетки округлые, преимущественно II и III типов. При имплантации эндопротеза «Эсфил Ag» вокруг нитей наблюдался выраженный отек ткани, воспалительно-клеточных инфильтрат, состоящий из клеток-нерезидентов. Площадь инфильтрата составила - 0,9±0,04 мм2. Клеточный индекс меньше, чем при использовании «Унифлекс Ag» на 9% (таблица 2), что свидетельствует о меньшем количестве клеток-резидентов в окружающей ткани. В поле зрения преобладают лимфоциты и нейтрофилы. При этом в непосредственной близости к нитям эндопротеза встречалось большое количество макрофагов, находящихся в стадии фагоцитоза ионов серебра (рисунок 35). Рисунок 35 - Микрофотография ткани, окружающий эндопротез «Эсфил Ag» на 3 сутки эксперимента в условиях микробной обсемененности. - макрофаги фагоцитирующие частицы серебра. Окр. Г+Э. А - ув. х 200. Б - ув. х 400
На нитях эндопротеза единичные активные формы фибробластов. Митотическая активность составила 51,36%. Плотность клеток значительно больше по сравнению с тем же протезом в стерильных условиях. Встречаются тучные клетки на начальных стадиях дегрануляции и полностью дегранулированные (2 и 3 типа) с хорошо идентифицируемым ядром. Гигантских многоядерных клеток нет. Вокруг нитей эндопротеза «Унифлекс Ag» наблюдался интерстициальный отек (рис. 36), не выходящий за пределы зоны имплантации эндопротеза, отмечалась большая площадь инфильтрата (таблица 10). Плотность клеток на единицу площади возрастает по мере удаленности от нитей эндопротеза. Количество Ki-67 положительных клеток было более половины - 54,97% (рисунок 36). Клеточный состав преимущественно представлен нейтрофильными лейкоцитами, которые составили 36,7±3,56% от общего клеточного состава. Клеточный индекс равен 0,70±0,50. Отмечается большое количество тучных клеток на некотором расстоянии от нитей эндопротеза с начальной стадией дегрануляцией. Клетки светлые с ядрами, имеющими нечеткую границу, цитоплазма слабо оксифильная (2 тип) (рисунок 37).
Результаты ионометрического исследования концентрации ионов серебра в тканях и морфометрического исследования гигантских многоядерных клеток и тучных клеток при имплантации образцов эндопротезов в стерильных условиях и условиях микробной обсемененности
Изучение процессов имплантации различных синтетических материалов в разных условиях имеет большое значение для поиска и обоснования критериев выбора эндопротеза. При эндопротезировании основным критерием является пприживаемость импланта и минимальные реактивные изменения элементов соединительной ткани, окружающих эндопротез.
Одним из негативных факторов, влияющих на приживление импланта, является присоединение инфекции. Так, по данным литературы, при использовании протеза количество осложнений со стороны раны, таких как нагноение, серома, гематома, отторжение протеза, может достигать, по разным источникам, от 18,6 до 67%. Приведенные данные подтверждают теорию о необходимости нанесения на эндопротезы антибактериального покрытия. Учитывая то, что сравнительные морфологическое исследования синтетических эндопротезов, выполненных из различных материалов ранее проводились неоднократно [40,42,51,59], главным отличием нашей работы от ранее проведенных исследований стало то, что мы изучили динамику реакции тканей передней брюшной стенки, ее отличительные особенности при имплантации различных сетчатых эндопротезов с антибактериальными свойствами как в стерильных условиях, так и в условиях микробной обсемененности.
При имплантации различного вида эндопротезов возникает ответная реакция со стороны собственных тканей организма по типу реакции на инородное тело [14, 115, 29, 145, 132], которая является выражением защитной и репаративной функций соединительной ткани. Известно, что в процессе морфогенеза восстановления или регенерации тканей, ярко проявляется единство воспаления, регенерации и фиброза, которые являются неразрывными компонентами целостной тканевой реакции на повреждение и чем быстрее одна фаза сменяет другу, тем эффективнее идет процесс приживления. В раннем послеоперационном периоде важную роль играют тканевые базофилы и вещества, которые они производят (гистамин, серотонин, простагландины, цитокины и др.),
Под влиянием этих секреторных продуктов повышается проницаемость кровеносных сосудов в зоне хирургического вмешательства, в результате которой происходит миграция клеток системы крови с последующим формированием лейкоцитарного вала. Микроскопически, на препаратах это проявлялось обширной площадью инфильтрата вокруг нитей эндопротеза. В представленной работе, при изучении динамики изменения площади воспалительного инфильтрата на 30 день эксперимента минимальная площадь наблюдалась при использовании «Унифлекс Ag» и «Плазмофильтр», максимальная – при использовании «Эсфил» (рисунок 78). Изучая общую динамику изменений, можно сделать вывод площадь уменьшается прямо пропорционально сроку эксперимента.
Прямопропорциональной зависимости здесь не наблюдается. К окончанию эксперимента наименьшая площадь инфильтрата наблюдается при использовании эндопротезов с антибактериальными свойствами – «Плазмофильтр», «Эсфил Ag» «Унифлекс Ag» (рисунок 79).
В сравнении с материалами без напыления серебра, установлена диффузия ионов серебра, а так же его частиц с покрытия нити в ткани (рисунок 80, 81).
При использовании эндопротезов с серебром наблюдается достоверное снижение площади инфильтрата. При анализе значений коэффициента корреляции (КК) мы исходили из того, что при его значении выше 0,7 между исследуемой парой признаков имеется сильная связь, которая может быть как прямой (положительное значение) так и обратной (отрицательное значение КК). Из таблицы 24 следует, что на 14 сутки максимальный выход частиц серебра в окружающую ткань наблюдается при использовании эндопротеза «Плазмофильтр». Это доказано наличием корреляционной связи между площадью инфильтрата и количеством серебра на нитях протеза.