Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1. Видообразование посредством межвидовой гибридизации 14
1.1.2. Роль клональных и полуклональных форм в полиплоидном видообразовании животных 17
1.1.3. Механизмы преодоления постзиготических барьеров у межвидовых клональных и полуклональных гибридов
1.1.3.1. Механизмы, обеспечивающие формирование гамет с геномом, идентичным геному родительской формы 21
1.1.3.2. Элиминация генома необходима для воспроизводства некоторых межвидовых гибридов животных 22
1.1.4. Комплекс зеленых лягушек 24
1.2. Состав Pelophylax esculentus complex 26
1.2.1. Феномен гибридогенеза у представителей комплекса зеленых лягушек 29
1.2.2. Триплоидные и тетраплоидные гибриды в комплексе P. esculentus 35
1.2.3. Популяционные системы Pelophylax esculentus complex 1.2.3.1. Популяционные системы типa L-E 38
1.2.3.2. Популяционные системы типa R-E 39
1.2.3.3. Популяционные системы типa E-R-L 41
1.2.3.4 Популяционные системы типa E 41
1.3. Механизмы удаления генетического материала при клональном и полуклональном способах размножения у межвидовых гибридов 44
1.4. Разнообразие способов избирательного удаления генетического материала 47
1.4.1. Механизмы избирательного удаления генетического материала 50
2. Материалы и методы 65
2.1. Сбор материала з
2.2. Проточная ДНК цитометрия 65
2.3. Постановка лабораторных скрещиваний 68
2.4. Получение препаратов метафазных хромосом 68
2.5. Выделение хромосом типа ламповых щеток 69
2.6. Флуоресцентная in situ гибридизация 70
2.7. 3D флуоресцентная in situ гибридизация 71
2.8. Иммунофлуоресцентное окрашивание 72
2.9. 3D иммунофлуоресцентное окрашивание 72
2.10. Флуоресцентная и фазово-контрастная микроскопия 73
2.11. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия 73
3. Результаты 75
3.1. Характеристика генотипов родительских видов, а также гибридных представителей комплекса среднеевропейских зеленых лягушек различной плоидности 75
3.2. Хромосомы типа ламповых щеток родительских видов 79
3.3. Анализ хромосомных наборов ооцитов ди- и триплоидных гибридов из различных популяционных систем бассейна реки Северский Донец 83
3.3.1. Геномная композиция ооцитов триплоидных гибридных самок с генотипом RRL
3.3.2. Геномная композиция в ооцитах триплоидных гибридных самок с генотипом LLR 89
3.3.3. Геномная композиция в ооцитах диплоидных гибридных лягушек 92
3.4. Анализ вклада гибридных животных в поддержание популяционных систем с помощью лабораторных скрещиваний 97
3.4.1. Результаты скрещиваний триплоидных гибридных самок с диплоидными гибридными самцами 102
3.4.2. Результаты скрещиваний диплоидных гибридов друг с другом и особями родительского вида 105
3.5. Анализ гонад головастиков родительских видов и гибридных животных 108
4. Обсуждение 113
4.1. Особенности элиминации и эндорепликации геномов в гаметогенезе ди- и триплоидных
гибридных самок 113
4.2. Роль гибридных лягушек в возникновении гибридов различной плоидности и особей P. ridibundus 119
4.3. Универсальные механизмы поддержания популяционных систем зеленых лягушек 122
4.4. Механизмы элиминации генома во время оогенеза гибридов различной плоидности в комплексе среднеевропейских зеленых лягушек 123
4.5. Заключение 128
Выводы 129
Список литературы 130
- Роль клональных и полуклональных форм в полиплоидном видообразовании животных
- Механизмы удаления генетического материала при клональном и полуклональном способах размножения у межвидовых гибридов
- 3D иммунофлуоресцентное окрашивание
- Роль гибридных лягушек в возникновении гибридов различной плоидности и особей P. ridibundus
Роль клональных и полуклональных форм в полиплоидном видообразовании животных
Другим способом, обеспечивающим выход из этого эволюционного тупика, является формирование особей с родительским генотипом в результате скрещивания гибридов, передающих одинаковые клонильные геномы. Не смотря на то, что потомки, полученные в результате таких скрещиваний, обладают слабой жизнеспособностью, в случае их выживания, они могут обеспечить рекомбинацию между клональными геномами (Hotz et al., 1992; Alves et al., 1998; Vorburger, 2001).
Однако наиболее эффективным способом для выхода из этого эволюционного тупика является возникновение полиплоидных, в частности триплоидных, форм (Gnther, 1983; Alves et al., 1998; Crespo-Lopez et al., 2006; Stenberg, Saura, 2013). Триплоидные формы могут использовать те же механизмы гиногенеза или партеногенеза, что и их родительские диплоидные формы (Dawley, Bogart 1989; Bullini 1994; Schn et al., 2009; Stenberg, Saura, 2013). Однако, в большинстве случаев способ размножения триплоидных форм может отличаться от того, который присутствовал первоначально у диплоидов. В случае гибридогенеза, а также в некоторых случаях при гиногенезе возникновение триплоидных форм в популяции позволяет сформировать переход от полуклонального размножения (гибридогенез) к воспроизводству половым путем (триплоидный гибридогенез). Считается, что это возможно за счет изменения гаметогенеза и осуществления рекомбинации в геноме триплоидных гибридов между гомоспецифичными геномами (Vinogradov et al., 1991; Alves et al., 1998; Crespo-Lopez et al., 2006; Morishima et al., 2008 a, b; Christiansen, Reyer, 2009). Триплоидный гибридогенез обнаруживается практически у всех гибридных животных, размножающихся с помощью гибридогенеза, а также может возникать независимо даже у изначально гиногенетических животных. Такой тип размножения обнаружен у зеленых лягушек (Pelophylax esculentus complex), зеленых жаб (Bufo viridis complex) и рыб родов Squalius, Cobitis и Misgurnus (Gnther, 1983; Alves et al., 1998; Saitoh et al., 2004; Crespo-Lopez et al., 2006; Morishima et al., 2008; Christiansen, Reyer, 2009; Stck et al., 2012). Триплоидный гибридогенез, как следует из его названия, характеризуется наличием триплоидов и считается промежуточной ступенью на пути к формированию тетраплоидов (Mallet, 2007; Cunha et al., 2011; Mable et al., 2011). Лишь у двух групп животных, рыб рода Hypseleotris и палочников рода Bacillus, размножающихся с помощью диплоидного гибридогенеза, не обнаружено триплоидных форм (Mantovani et al., 1996; Schmidt et al., 2011). Также следует отметить, что триплоидный гибридогенез отсутствует и у рыб из рода Poeciliopsis, у которых триплоидные гибриды размножаются посредством гиногенеза (Schultz, 1967; Dawley, Bogart, 1989).
По мнению некоторых исследователей, наиболее важная роль триплоидных животных заключается в том, что они могут дать начало тетраплоидным животным (Mallet 2007; Cunha et al., 2011; Mable et al., 2011). Симметричные тетраплоиды обычно характеризуются более стабильным гаметогенезом, чем триплоидные гибриды и производят диплоидные гаметы (Mallet 2007; Mable et al., 2011; Neaves, Baumann 2011). Считается, что в случае достижения тетраплоидыми животными репродуктивной изоляции от родительских видов и других форм гибридов возможно формирование ими нового вида.
Считается, что изменения в ходе гаметогенеза, происходящие у межвидовых гибридов, способствуют формированию клонального и/или полуклонального способов размножения. Эти способы связаны, прежде всего, с изменением гаметогенеза, приводящими к формированию гамет с геномом, идентичным родительской форме (Dawley, Bogart, 1989; Stenberg, Saura, 2009; Neaves, Baumann, 2011; Stenberg, Saura, 2013). Кроме того, преодоление репродуктивных барьеров может достигаться с помощью избирательной элиминации генома (геномов), которая позволяет избежать нарушения сегрегации хромосом обоих родительских видов. У некоторых межвидовых гибридов происходит сочетание обоих процессов (Dawley, Bogart 1989; Tinti, Scali et al., 1992, 1993; Komaru et al., 1998, 2000; Bogart et al., 2007; Schn et al., 2009; Stenberg, Saura, 2013). Следует отметить, что не только межвидовые гибриды способны размножаться посредством клонального или полуклонального способов; некоторые организмы могут использовать сходные типы размножения, требующие изменений гаметогенеза (Schn et al., 2009).
Изменения гаметогенеза, приводящие к формированию гамет с геномом, идентичным геному соматических клеток, характерны для большинства клональных форм гибридов (партеногенез, гиногенез, андрогенез). Формирование таких гамет может происходить вследствие двух различных способов: апомиксии или автомиксии (Dawley, Bogart, 1989; Stenberg, Saura, 2009; Neaves, Baumann, 2011; Stenberg, Saura, 2013).
Одним из механизмов автомиксии является удвоение хросмосомного набора. Считается, что удвоение может происходить посредством эндорепликации генома или в результате слияния зародышевых клеток (Stenberg, Saura 2009; Neaves, Baumann, 2011; Stenberg, Saura, 2013). Однако, наиболее вероятной для большинства гибридных животных считается эндорепликация генома (Stenberg, Saura, 2009; Neaves, Baumann, 2011). Это удвоение генома у большинства клональных животных происходит премейотически, однако у гибридных палочников из рода Bacillus эндорепликация происходит в пахитене. При этом в результате эндорепликации генома кроссинговер происходит только между идентичными копиями хромосом (Macgregor, Uzzell, 1964; Tinti, Scali et al., 1992, 1993; Itono et al., 2006; Lutes et al., 2010). Эндорепликация в гаметогенезе межвидовых гибридов рассматривается как одна из важных предпосылок полиплоидного видообразования (Stenberg, Saura, 2009; Neaves, Baumann, 2011; Stenberg, Saura, 2013).
Кроме эндорепликации генома автомиксия может происходить в результате слияния продуктов мейоза на разных этапах (от слияния полярных телец друг с другом до слияния двух гамет). Такой тип размножения характерен в основном для клональных форм не гибридной природы, у которых возможно нормальное осуществление мейоза (Stenberg, Saura, 2009). Однако такой тип размножения также встречается у гибридных палочников рода Bacillus, размножающихся с помощью партеногенеза. У межвидовых гибридов палочников в редукционном делении мейоза все хромосомы одного из родительских видов выделяются в ооцит первого порядка, который потом сливается с яйцеклеткой, что позволяет восстановить диплоидность яйцеклетки (Marescalchi et al., 1991).
При апомиктическом способе воспроизводства существенные черты мейоза отсутствуют, так, например, отсутствует редукционное деление, в результате чего мейоз практически не отличим от митоза. Гомологичные хромосомы не формируют пары и происходит только одно деление ооцита (Cimino, 1972; Stenberg, Saura 2009). Для триплоидных гибридных карасей показано, что этому делению может предшествовать стадия, в которой формируется необычное триполярное веретено деления, к которому, однако, не прикрепляются кинетохоры хромосом. В результате клетка быстро переходит ко второму делению, в ходе которого происходит расхождение хроматид в две дочерние клетки (Yamashita et al., 1993). В результате апомиктического размножения геном матери передается без изменений. Апомиктический способ воспроизводства обнаружен у многих клональных и полуклональных форм животных, в том числе негибридной природы (Stenberg, Saura 2009; Stenberg, Saura, 2013).
Механизмы удаления генетического материала при клональном и полуклональном способах размножения у межвидовых гибридов
Другим примером является удаление отцовской половой хромосомы, а также добавочных хромосом (так называемые L хромосомы) у насекомого Sciaria coprophila. Эти хромосомы в клетках зародышевой линии характеризуются гипоацетилированным состоянием гистонов Н3 и Н4 в зародышевых клетках, которое также характерно для гетерохроматина (Таблица 1). Другие модификации хроматина не были проанализированы (Goday, Ruiz, 2002; Escriba, Goday, 2013). Интересно, что удаление добавочных хромосом у этого организма может происходить не только посредством отставания во время деления клетки, но и в результате почкования. Во время длинной интерфазы в зародышевых клетках одна из двух отцовских Х хромосом, а также некоторые L хромосомы морфологически детектируются и находятся в полуконденсированном состоянии, которое соответствует прометафазным хромосомам, в то время как остальные хромосомы находятся в интерфазе и полностью деконденсированы. Во время элиминации одна из таких конденсированных хромосом, присоединяется к ядерной мембране, включается в формирующуюся выпуклость и исключается в цитоплазму. Было выдвинуто предположение, что такие конденсированные хромосомы осуществляют взаимодействие с внутренней ядерной мембраной посредством якоря, которым, как предполагают, может быть рецептор ламина B (LBR), который представляет собой один из главных компонентов внутренней мембраны. Такие взаимодействия могут происходить при недоацетилированном состоянии хроматина этих элиминируемых хромосом (Perondini, Ribeiro, 1997; Goday, Ruiz, 2002).
Избирательная элиминация хромосом одного родительского вида присутствует у некоторых межвидовых гибридов растений пшеницы и проса (Gernard et al., 2005, 2006; Houben et al., 2014). Считается, что хромосомы проса могут элиминироваться посредством отставания в митозе, при этом могут отставать как целые хромосомы одного родительского вида, так и их фрагменты. Считается, что такое отставание связано с нарушением функционирования центромер, обусловленным неправильной загрузкой центромерного гистона CENH3 на хромосомы одного из родительских видов (Sanei et al., 2011). Кроме того, элиминация хроматина у этих гибридов также происходит во время интерфазы посредством почкования (Таблица 1). Интересно, что хроматин, предназначенный для элиминации, гетерохроматинизуется и локализуется на периферии ядра. В результате почкования, а также в результате отставания хромосом или их фрагментов формируются микроядра, в которых происходит постепенная деградация генетического материала (Gernard et al., 2005, 2006). Механизм элиминации половых хромосом, которая была обнаружена у некоторых сумчатых млекопитающих, не известен, однако показано, что элиминация половых хромосом также характеризуется эффектами, связанными с предварительной компактизацией элиминируемой хромосомы. Морфологический анализ показал, что Х или Y хромосомы отцовского происхождения формируют плотные тельца в ядрах соматических тканей у некоторых сумчатых млекопитающих, после чего происходит их элиминация (Таблица 1). При этом в клетках зародышевой линии хромосомы, предназначенные для элиминации, морфологически не отличаются от других и являются транскрипционно активными (Johnston et al., 2002; Deakin et al., 2009). В отличие от плацентарных млекопитающих, инактивация хромосомы Х у сумчатых не контролируется длинной некодирующей РНК (XIST), ген которой отсутствует на половых хромосомах сумчатых (Deakin et al., 2009). Кроме того, модификации гистонов, характерные для гетерохроматина, такие как H3K27me3 и Н3K9me2, также не были обнаружены у сумчатых млекопитающих на инактивированной хромосоме Х (Kohlmaier et al., 2004).
Удаление целого отцовского генома может происходить либо в клетках раннего эмбриона, либо в клетках зародышевой линии или даже во время мейоза (Brown, 1965; Herrick, Seger, 1999; Burt, Trivers, 2006). Однако во всех случаях предварительная компактизация элиминируемого генома детектируется морфологически. Для представителей надсемейства Coccoidea перед удалением отцовского хромосомного набора показано накопление эпигенетических маркеров гетерохроматинизации, таких как H3K9me3 и H4K20me3, а также HP1-подобных белков (Таблица 1) (Bongiorni et al., 2007). Следует отметить, что даже в тех случаях, когда элиминация происходит в клетках зародышевой линии или во время мейоза, отцовский геном обычно компактизируется на ранних стадиях развития и поддерживается инактивированным на протяжении жизни особи (Brown, 1965; Herrick, Seger, 1999). У Sciaria coprophila также было показано, что материнские и отцовские геномы обладают дифференциальным маркированием хроматина на протяжении всего развития зародышевых клеток. В мейозе самцов материнские хромосомы характеризуются высоким уровнем ацетилирования гистонов H4 и H3, в то время как отцовские хромосомы обладают гипоацителированным состоянием гистонов H3 и H4, характерными для гетерохроматина (Таблица 1) (Goday, Ruiz, 2002; Greciano, Goday, 2006). Удаление отцовского генома у разных видов может происходить в митозе или мейозе и зачастую включает события, связанные с формированием униполярного веретена деления. Кроме того удаление также может происходить в результате постепенного отставания отцовских хромосом в серии митотических делений зародышевых клеток (Herrick, Seger, 1999; Burt, Trivers, 2006). Для самцов Sciaria coprophila показано, что во время первого мейоза гетерохроматинизированные отцовские хромосомы характеризуются нарушением дефосфорилирования Н3S10-P в анафазе и телофазе, кроме того формируется униполярное веретено деления, к которому прикрепляются кинетохоры только материнских хромосом. Отцовские хромосомы лишены кинетохорной структуры и постепенно отходят в цитоплазматическую почку, что приводит к их удалению из клетки (Таблица 1) (Esteban et al., 1997; Goday, Esteban, 2001).
Комплексные эффекты, связанные с нарушением компактизации отцовского хроматина, могут также возникать при инфецировании особой В хромосомой, названной PSR, или бактерией Wolbachia (Reed, Werren, 1995; Herrick, Seger, 1999; Vugt et al., 2003; Werren et al., 2008). Морфологический анализ показал, что в первом делении зиготы отцовский геном, инфицированный PSR, становится гиперконденсированным (van Vugt et al., 2003). Кроме того, происходит нарушение конденсации отцовского генома, связанное с неспособностью конденсинов связаться с хроматином, а также с нарушением фосфорилирования гистона Н3. В результате отцовский геном не формирует метафазные хромосомы и остается в цитоплазме, в то время как все хромосомы материнского генома осуществляют митотическое деление. PSR избегает элиминации и сегрегирует вместе с материнскими хромосомами. Считается, что первичные модификации отцовского генома, вызывающие его аномальное поведение после оплодотворения, индуцируются PSR во время сперматогенеза (Werren, Stouthamer, 2003; Swim et al., 2012). Одной из таких возможных модификаций является метилирование цитозина, которое детектируется в отцовском геноме во время сперматогенеза только у самцов инфицированных видов (Таблица 1). Кроме того, во время сперматогенеза самцов были обнаружены транскрипты, формируемые из PSR, которые представлены длинными некодирующими РНК. Однако роль этих транскриптов не известна (Swim et al., 2012; Akbari et al., 2013). При инфицировании бактерией Wolbachia также происходит нарушение загрузки гистонов в отцовском геноме, связанное с нарушением работы шаперонов, и нарушение фосфорилирования гистона Н3. Это приводит к тому, что только материнский набор хромосом конденсируется и расходится в анафазе, в то время как отцовский остается диффузным и отстает в метафазной пластинке (Landmann et al., 2009). В присутствии Wolbachia, хромосома PSR элиминируется вместе с отцовским геномом (Reed and Werren, 1995; Werren, Stouthamer, 2003; Tram et al., 2007). Несмотря на то, что непосредственный механизм элиминации генома до конца не известен, показано, что Wolbachia участвует в регуляции профиля метилирования генов хозяина, а также регулирует работу генов хозяина с помощью miРНК (Hussain et al., 2011).
3D иммунофлуоресцентное окрашивание
Для изучения особенностей гаметогенеза и механизмов воспроизводства гибридных животных в популяционных системах необходим цитогенетический анализ геномов, передаваемых с гаметами ди- и триплоидных гибридных лягушек. Идентифицировать геном гамет самцов можно с помощью анализа метафазных хромосом и проточной ДНК цитометрии (Боркин и др., 2005; Borkin et al., 2004; Biriuk et al., 2016). Однако определение геномной композиции гамет гибридных самок представляет более сложную задачу. Методом, который позволяет идентифицировать хромосомный набор растущих ооцитов и определить видоспецифичные различия в морфологии хромосом, является анализ гигантских хромосом типа ламповых щеток, микрохирургически изолированных из ядер растущих ооцитов (Сallan, 1986; Macgregor et al., 1990; Vishnyakova et al., 2004). Ранее для хромосом типа ламповых щеток P. ridibundus и P. lessonae из Польши были обнаружены морфологические различия, которые позволили исследователям идентифицировать наборы хромосом, передаваемые в ооцитах гибридов (Bucci et al., 1990). Однако полученные исследователями данные не позволяют идентифицировать каждую хромосому в отдельности и сложны для последующего применения. Кроме того, морфология хромосом типа ламповых щеток может отличаться у особей родительских видов из разных популяций. Поэтому, для того чтобы обнаружить видоспецифические различия в морфологии хромосом типа ламповых щеток необходим детальный анализ кариотипов растущих ооцитов для обоих родительских видов из исследуемой популяционной системы.
После отлова представителей комплекса среднеевропейских зеленых лягушек была проведена их идентификация посредством измерения количества ДНК с помощью проточной ДНК-цитометрии. Благодаря различиям между количеством ДНК в геноме P. ridibundus и P. lessonae можно идентифицировать геномный состав гибридных лягушек (Vinogradov et al., 1990; Borkin et al., 2004). Особи с размером величины С в пределах 16.00±0.35 пг были идентифицированы как P. ridibundus, особи с размером величины C между 14.00±0.35 были обозначены как P. lessonae, особи с показателем величины C в пределах 14.90±0.35 были идентифицированы как диплоидные P. esculentus, триплоидные гибридные лягушки с генотипами LLR и RRL имели значение величины C в пределах 21.80±0.35 и 22.9±0.35, соответственно (Приложение 2; Таблица 1). Две лягушки обладали промежуточным значением количества ДНК между соответствующими значениями величины С для животных с генотипами LLR и RRL (обозначенные как RLX) (Приложение 2; Таблица 1). Тем не менее, дальнейший анализ хромосомных наборов ооцитов, производимых этими животными, позволил нам отнести их к гибридам с генотипом RRL.
В ранних работах показано, что хромосомы родительских видов различаются по интенсивности окрашивания перицентромерного гетерохроматина в результате С-бэндинга, а также флуоресцентного окрашивания (с использованием красителей Актиномицин D-33 258, Hoechst, DAPI) (Heppich et al., 1982; Bucci et al., 1990; Tunner 1994; Ogielska et al., 2001). Более интенсивный сигнал был обнаружен в перицентромерных районах всех хромосом P. ridibundus, в то время как в перицентромерных районах хромосом P. lessonae окрашивание практически полностью отсутствовало (Heppich et al., 1982; Bucci et al., 1990; Ogielska et al., 2001). Однако, в некоторых случаях достаточно сложно идентифицировать различие в интенсивности флуоресценции на хромосомах P. ridibundus и P. lessonae, в особенности у триплоидных животных. Кроме того, у особей родительских видов из популяционных систем восточной Украины отсутствуют видимые различия в интенсивности флуоресценции центромерных районов, что не позволяет идентифицировать митотические хромосомы (Dedukh et al., 2013, 2015).
Считается, что интенсивность флуоресценции перицентромерного гетерохроматина зависит от количества перицентромерного повтора, названного RrS1. С помощью FISH c зондом к последовательности центромерного повтора, амплифицированного с геномной ДНК, было показано его накопление в центромерных районах P. ridibundus и практически полное его отсутствие в центромерных районах P. lessonae из среднеевропейских популяционных систем (Ragghianti et al., 1995; Marracci, Ragghianti 2008; Marracci et al., 2011). Однако для родительских видов из популяционных систем Восточной Украины FISH с зондом к прицентромерному повтору, амплифицированному с геномной ДНК, не показал дифференциального накопления (Приложение 1. Рисунок 1.) (Dedukh et al., 2013). Тем не менее, нам удалось обнаружить различия в последовательности этого повтора между особями обоих родительских видов, основанные на результатах работы Мараччи и соавторов (Maracci et al., 2011). Это позволило подобрать олигонуклеотидный зонд, специфичный для центромерных районов P. ridibundus, но не P. lessonae. В результате FISH с олигонуклеотидным зондом мы обнаружили локализацию сигнала в центромерных (a-в) Картирование повтора (TTAGGG)n с помощью FISH на метафазных хромосомах P. lessonae (a, a`), P. ridibundus (б) и диплоидной P. esculentus (в). Один или два интерстициальных сайта повтора (TTAGGG)n различимы на ядрышкообразующей хромосоме H (отмечены стрелками). Звездочка обозначает увеличенный фрагмент с двумя ядрышкообразующими хромосомами P. lessonae. Стрелки указывают на интерстициальные сайты повтора (TTAGGG)n. (г1-е1`) Хромосомы типа ламповых щеток из ооцитов триплоидных гибридных самок с генотипом RRL (г1-г6`) и LLR (д1-е1`). FISH картирование сайтов повтора (TTAGGG)n позволяет идентифицировать хромосомы типа ламповых щеток H, соответствующие хромосомам типа ламповых щеток P. ridibundus (г6) или P. lessonae (д1). Интерстициальные сайты повтора (TTAGGG)n отмечены квадратными скобками. Примеры одних из наиболее хорошо различимых хромосом типа ламповых щеток, которые соответствуют хромосомам типа ламповых щеток F (г1, г1`), G (г2, г2`), D (г3, г3`), I (г4, г4`), B (г5, г5`) P. ridibundus, а также хромосомам типа ламповых щеток B (д2, д2`), F (д3, д3`), L (е1,е1`) P. lessonae. Хромосомы на микрофотографиях (г1–г6`) были взяты из полного набора хромосом типа ламповых щеток, представленном на рисунке 2a,a`. Хромосомы на микрофотографиях (д1-д3`) были взяты из полного набора хромосом типа ламповых щеток представленного на рисунке 2в, в`. Различные маркерные структуры обозначены стрелками. Хромосомы окрашены DAPI. Также показаны соответствующие фазово-контрастные изображения (г1`, г2`, г3`, г4`, г5`, г6`, д1`, д2`, д3`, е1`). Головки стрелок указывают на центромеры. Масштабный отрезок = 10 мкм для всех микрофотографий кроме a`, где масштабный отрезок = 2 мкм.
Роль гибридных лягушек в возникновении гибридов различной плоидности и особей P. ridibundus
Пять диплоидных самок P. esculentus производили ооциты с различной геномной композицией. У одной диплоидной гибридной самки, 20 из 23 проанализированных ооцитов содержали 26 бивалентов, из которых 13 хромосом соответствовали хромосомам типа ламповых щеток P. lessonae, а 13 бивалентов соответствовали хромосомам типа ламповых щеток P. ridibundus. Чтобы сформировать ооциты с 26 бивалентами во время гаметогенеза у исследуемой диплоидной лягушки произошел только этап эндорепликации обоих геномов родительских видов. Другие 3 ооцита у этой же лягушки содержали 26 унивалентов, из которых 13 унивалентов соответствовали хромосомам типа ламповыхщеток P. lessonae, а другие 13 унивалентов соответствовали хромосомам типа ламповых щеток P. ridibundus (Рисунок 9 в, в`). Для подтверждения того, что хромосомы представлены унивалентами, мы провели сканирование интактных ядер, выделенных из ооцитов некоторых диплоидных гибридных самок с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Чтобы сформировать ооциты с 26 унивлентами у проанализированной диплоидной гибридной лягушки в гаметогенезе не происходило ни этапа элиминации, ни этапа эндорепликации геномов. Ранее было показано, что анеуплоидные ооциты и ооциты с 26 унивалентами, соответствующие геномам обоих родительских видов, были обнаружены у единственной диплоидной самки P. esculentus (Bucci et al., 1990).
Для другой диплоидной гибридной лягушки мы получили 6 полных наборов хромосом типа ламповых щеток, представленных 13 бивалентами, соответствующими хромосомам P. ridibundus. Один ооцит у этой лягушки содержал 26 унивалентов, где 13 унивалентов соответствовали хромосомам типа ламповых щеток P. ridibundus, а другие 13 унивалентов соответствовали хромосомам типа ламповых щеток P. lessonae.
Мы также проанализировали 7 ооцитов с полными хромосомными наборами для одной диплоидной гибридной самки. 3 ооцита содержали 26 бивалентов, 2 ооцита содержали 26 унивалентов, где 13 би- или унивалентов представлены хромосомами типа ламповых щеток P. ridibundus, а другие 13 би- или унивалентов представлены хромосомами типа ламповых щеток P. lessonae. Кроме того, в двух ооцитах этой самки мы обнаружили 13 бивалентов, соответствующих хромосомам P. ridibundus.
Среди 40 ооцитов с полными хромосомными наборами, полученными от другой диплоидной гибридной самки, 28 ооцитов содержали 26 унивалентов, из которых 13 унивалентов соответствовали хромосомам P. lessonae, а 13 унивалентов соответствовали хромосомам P. ridibundus. Другие 9 ооцитов содержали различное количество унивалентов (от 15 до 20), которые соответствовали хромосомам типа ламповых щеток обоих родительских видов. Мы полагаем, что анеуплоидные ооциты могут возникать вследствие частичной потери хромосом в ходе гаметогенеза без этапа эндорепликации. Два других набора хромосом типа ламповых щеток содержали 26 бивалентов, из которых 13 соответствовали хромосомам типа ламповых щеток P. ridibundus, а 13 бивалентов – хромосомам типа ламповых щеток P. lessonae.
В результате анализа ооцитов одной необычной диплоидной P. esculentus мы обнаружили 8 ооцитов с 26 бивалентами, 6 ооцитов с 26 унивалентами и 16 ооцитов с различным количеством унивалентов (от 8 до 20) и бивалентов (от 3 до 10). Детальный анализ показал, что все исследованные ооциты содержат хромосомы типа ламповых щеток, соответствующие только хромосомам P. ridibundus (Рисунок 9 г, г`). Таким образом, мы полагаем, что геном P. lessonae премейотически элиминировался, в то время как геном P. ridibundus премейотичски эндореплицировался один раз, чтобы сформировать ооциты с 26 унивалентами и ооциты с уни- и бивалентами и даже два раза, чтобы сформировать ооциты с 26 бивалентами (Рисунок 10 в). Противоположный вариант развития событий, при котором произошла премейотическая эндорепликация обоих геномов P. ridibundus и P. lessonae, а затем произошла элиминация удвоенного генома P. lessonae, кажется маловероятным. Кроме того, мы не смогли обнаружить ооциты с хромосомами типа ламповых щеток, соответствующими хромосомам P. lessonae, или анеуплоидные ооциты, которые предположительно должны были возникнуть при столь усложненном пути гаметогенеза. Несмотря на то, что ооциты с геномами обоих родительских видов были обнаружены ранее у диплоидных P. esculentus, ооциты с 4 идентичными копиями одного родительского генома (26 бивалентов P. ridibundus) представляют собой уникальные данные не только для лягушек, но и других клональных животных. В ооцитах с 26 унивалентами идентичные хромосомы, которые образовались после этапа эндорепликации, не смогли сформировать биваленты. Ооциты с би- и унивалентами предположительно представляют собой неудачные попытки формирования бивалентов.
Таким образом, большинство диплоидных самок P. esculentus из популяционных систем типа R-E в Восточной Украине производят ооциты с 13 бивалентами, соответствующими хромосомам P. ridibundus. Мы также обнаружили диплоидных гибридных самок с отклонениями в процессах геномной элиминации и эндорепликации, которые приводят к формированию ооцитов с 26 би- или унивалентами, представленными геномами обоих родительских видов или только P. ridibundus. 3.4. Анализ вклада гибридных животных в поддержание популяционных систем с помощью лабораторных скрещиваний Для того чтобы оценить роль гибридных лягушек в возникновении гибридов различной плоидности, а также проверить возможность ооцитов с разными хромосомными наборами формировать фертильные гаметы, мы провели лабораторные скрещивания диплоидных и триплоидных гибридов друг с другом и особями родительского вида. Нам удалось получить головастиков от 13 скрещиваний: 8 скрещиваний включали триплоидных гибридных самок с генотипом RRL и диплоидных гибридных самцов, 1 скрещивание включало триплоидную гибридную самку с генотипом LLR и триплоидного гибридного самца с генотипом RRL, 3 скрещивания включали диплоидных гибридных самок и диплоидных гибридных самцов, и самца P. ridibundus, а также одно скрещивание включало двух особей P. ridibundus (Рисунок 11, 12; Приложение 3, Таблица 2). В качестве контроля мы использовали головастиков, полученных от скрещивания двух особей P. ridibundus. Кроме того, мы идентифицировали геномы, передаваемые в ооцитах диплоидных и триплоидных гибридных самок, участвовавших в скрещиваниях. Для идентификации кариотипов головастиков, а также подтверждения морфологического анализа хромосом типа ламповых щеток, мы провели FISH с зондом (TTAGGG)n. Всего мы идентифицировали кариотипы 394 головастиков (Рисунок 11, 12). Для каждого головастика мы проанализировали не менее трех полных метафазных пластинок с хорошо идентифицируемым сигналом после проведения FISH.
В результате анализа ранних стадий развития головастиков, полученных в результате лабораторных скрещиваний, мы смогли оценить выживаемость потомства, полученного от скрещивания гибридов по сравнению с родительским видом. Мы обнаружили, что кладки всех гибридных головастиков обладали сниженным уровнем выживаемости во время всего периода развития (выживаемость 60-70 % в большинстве кладок; и только 10 % в одной кладке) по сравнению с родительскими видами (выживаемость около 90 %). Спустя несколько дней после нереста часть икры не развивалась и погибла, вероятно, из-за отсутствия оплодотворения, вызванного низкой активностью сперматозоидов гибридных самцов (Uzzell et al., 1977; Reyer et al., 2003). Смертность головастиков мы также наблюдали во время ранних стадий развития вследствие ненормальных делений эмбриона, экзогаструляции, аномального распределения желтка и наполненного жидкостью тела зародыша. В ранних работах аномалии развития и смертность исследователи обычно связавали с мозаицизмом