Введение к работе
Актуальность проблемы. Временное повышение концентрации кальция в цитоплазме (кальциевый сигнал) играет значительную роль в таких важных клеточных процессах, как деление, дифференцировка и синтез нуклеиновых кислот В электроневозбудимых клетках кальциевый сигнал, активируемый при стимуляции рецепторов, сопряженных с фосфолипазой С (PLC), опосредуется выбросом кальция из внутриклеточных депо и его входом через рецептор-управляемые каналы [1] Механизм выброса кальция из депо достаточно хорошо изучен. Основной вклад в этот выброс вносится рецептором инозитол-1,4,5-трисфосфата (IP3R), активируемым при взаимодействии с инозитол-1,4,5-трисфосфатом (ІРз). В то же время рецептор-управляемый вход кальция остается менее исследованным Существует достаточно большое количество рецептор-управляемых каналов в электроневозбудимых и нейрональных клетках. Большинство из них активируется при увеличении концентрации ІРз в цитоплазме [1]. Как правило, эти каналы также активируются при пассивном опустошении кальциевых депо [2]. В этом случае принято говорить о депо-управляемом входе кальция в клетки через депо-управляемые каналы (SOC).
Механизм активации рецептор-управляемых каналов остается не выясненным Доступные данные обсуждаются в рамках двух основных гипотез Гипотеза водорастворимого посредника предполагает существование особого посредника - фактора входа кальция, высвобождающегося при опустошении кальциевых депо, диффундирующего к плазматической мембране и активирующего кальциевые каналы [3,4]. Гипотеза конформационного взаимодействия предполагает, что каналы активируются при их взаимодействии с рецептором ІРз [5] В последнее время накапливаются данные о существовании обоих механизмов и об их синергичном действии в невозбудимых клетках [6].
Фармакологические характеристики многих рецептор-управляемых каналов не отличаются друг от друга. В связи с этим разделять различные рецептор-управляемые каналы можно только по их электрофизиологическим свойствам. Поэтому для изучения механизмов регуляции рецептор-управляемых кальциевых каналов требуется их регистрация на одиночном уровне. Ранее было показано, что в клетках А431 стимуляция рецепторов, сопряженных с фосфолипазой С, или приложение ІРз к внутренней стороне плазматической мембраны активирует низкопроводящие кальциевые каналы в плазматической мембране Данные каналы были названы Imin каналами и охарактеризованы в нескольких типах электроневозбудимых клеток [7] Данные каналы также активировались при пассивном опустошении кальциевых депо. Мы показали, что в их активационном механизме важную роль играет рецептор IP3 эндоплазматического ретикулума (Zubov, Kaznacheyeva, Nikolaev et al., 1999). Кроме того, мы также показали, что мембранный липид фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (РІРг) ингибирует активность Imin каналов (Kaznacheyeva, Zubov, Nikolaev et al., 2000).
Эти данные ставят вопрос о механизмах локализации элементов системы рецептор-управляемого входа кальция в злЬ(пдо|вд$фдодонДОгках. Логично
I СМелИОТЕКА |
предположить, что должны существовать белки, связывающие в единый молекулярный комплекс фосфолипазу С, рецептор 1Рз и Imin канал в плазматической мембране. В постсинаптической плотности нейрональных клеток существует целый ряд скэффолд белков, сязывающих в единый макромолекулярный комплекс рецепторы, сопряженные с фосфолипазой С на постсинаптической мембране, рецептор ІРз в мембране эндоплазматического ретикулума и другие функционально-значимые белки постсинапса [8]. Среди этих белков важную роль играют белки семейства Homer. Данные белки связывают рецептор 1Р3 и глутаматный рецептор (mGluR) друг с другом и с другими белками [9] Как правило, мишени Homer белков имеют последовательность PPXXF или PPXF Белки семейства Homer экспрессируются и в электроневозбудимых клетках, в частности в клетках НЕК293. Однако их функция в этих клетках неясна Можно предположить, что эти белки могут связываться с рецептором ІРз в мембране эндоплазматического ретикулума и кальциевым каналом в плазматической мембране и собирать их в единый макромолекулярный комплекс.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование роли белков семейства Homer в регуляции активности каналов Imin. Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:
-
Охарактеризовать каналы рецептор-управляемого входа кальция в клетках нек?93 на одиночном уровне.
-
Выяснить как меняется активность каналов Imin в клетках НЕК293 при нарушении связи белков семейства Homer с белками мишенями.
-
Выяснить как меняется активность каналов Imin при нарушении олигомерной структуры белков семейства Homer.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Рецептор-управляемый вход кальция в клетках НЕК293 опосредован как минимум тремя типами кальциевых каналов, одним из которых является Imln канал.
-
Белки семейства Homer блокируют спонтанную активацию Imin каналов.
-
Для блокирования спонтанной активации Imin каналов требуются олигомерные комплексы белков семейства Homer.
Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые показано, что UTP-индуцированный вход кальция в клетках НЕК293 опосредуется тремя типами кальциевых каналов. Один из них - это ранее изученный в клетках А431 миниатюрный кальциевый канал Imin. Он имеет проводимость 1.2 пСм и потенциал реверсии +50 мВ. Данный канал активируется в клетках НЕК293 приложением IP3 к внутренней стороне плазматической мембраны, но, в отличие от Imin каналов в клетках А431, не чувствителен к состоянию кальциевых депо Два других рецептор-управляемых канала активируются пассивным опустошением кальциевых депо и имеют проводимости 5 и 17 пСм. Кроме того, с помощью молекулярно-биологических и электрофизиологических методик было показано, что адаптерные белки семейства Homer блокируют спонтанную активацию каналов Imin. В работе также было показано, что для такого действия Homer белков требуется их олигомерная организация,^ s ."" -
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты важны для понимания механизмов регуляции рецептор-управляемого входа кальция в электроневозбудимых и нейрональных клетках Результаты, свидетельствующие о роли белков семейства Homer в регуляции Imin каналов, безусловно расширяют представления о механизмах активации ионных каналов. Полученные данные о рецептор-управляемом входе Са2+ в невозбудимые клетки создают основу для структурно-функционального анализа рецептор-управляемых кальциевых каналов и могут быть использованы при разработке и тестировании фармакологических препаратов.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на симпозиуме «Кальциевая сигнализация» (Италия, 2000), Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2001), IV конференции Чешского общества нейробиологов (Прага, 2001), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004) и семинарах лаборатории ионных каналов клеточных мембран Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, содержащего 157 публикаций. Работа изложена на 98 страницах текста и иллюстрирована 19 рисунками.
Похожие диссертации на Роль адаптерных белков семейства Homer в регуляции рецептор-управляемых кальциевых каналов в клетках НЕК293
