Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1 Функциональная характеристика митотического цикла 15
1.2 Структурные элементы митотического аппарата и их функциональная роль 19
1.2.1 Роль центросом в формировании веретена деления 19
1.2.2 Структура и функции кинетохора 20
1.2.3 Микротрубочки, их строение и динамика 22
1.2.4 Деполимеризация микротрубочек как инструмент для исследования механизмов формирования веретена деления 24
1.3 Белки, ассоциированные с микротрубочками 25
1.3.1 Стабилизирующие, линкерные и дестабилизирующие белки 26
1.3.2 Моторные белки 28
1.3.3 Белки контролирующей системы сборки веретена деления и исправление ошибок 30
1.4 Транскрипционные факторы в клеточном цикле 31
1.5 Комплекс KANSL/NSL 34
1.6 Заключение 39
Глава 2. Материалы и методы 40
2.1 Получение генно-инженерных конструкций для синтеза двуцепочечной РНК 40
2.1.1 Амплификация фрагментов исследуемых генов методом полимеразной цепной реакции 40
2.1.2 Очистка продуктов ПЦР 41
2.1.3 Лигирование ДНК (клонирование в вектор) 41
2.1.4 Приготовление электрокомпетентных клеток E. coli 42
2.1.5 Трансформация клеток E. coli 42
2.1.6 Проверка полученных колоний трансформированных клеток E. coli с помощью ПЦР 43
2.1.7 Амплификация и выделение плазмидной ДНК 43
2.1.8 Определение нуклеотидной последовательности полученных конструкций (по Сэнгеру) 43
2.1.9 Синтез двуцепочечной РНК 44
2.2 Проведение нокдауна целевых генов методом РНК-интерференции на клеточной линии S2 D. melanogaster 44
2.2.1 Культивирование клеточных линий S2 D. melanogaster 44
2.2.2 РНК-интерференция 45
2.2.3 Деполимеризация микротрубочек холодом и колцемидом 46
2.3 Определение уровня экспрессии исследуемых генов методом обратной транскрипции с последующей ПЦР в режиме реального времени 47
2.3.1 Выделение тотальной РНК 47
2.3.2 Обратная транскрипция 48
2.3.3 Количественная ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени 49
2.4 Оценка экспрессии целевых белков методом Вестерн-блот 50
2.4.1 Приготовление белковых лизатов из культивируемых клеток S2 после РНК-интерференции 50
2.4.2 Электрофорез белков и Вестерн-блот 50
2.5 Выделение и очистка рекомбинантных белков GST-Rcd1 для получения поликлональных антител к белку Rcd1 52
2.5.1 Наработка рекомбинантного белка GST-Rcd1 в клетках E. coli 53
2.5.2 Выделение и очистка рекомбинантных белков 54
2.6 Получение антител 55
2.7 Флуоресцентная микроскопия 55
2.8 Прижизненная конфокальная микроскопия 56
2.9 Просвечивающая электронная микроскопия 56
2.10 Статистическая обработка данных 57
Глава 3. Результаты исследований 58
3.1 Получение и характеристика поликлональных антител к белку Rcd1 58
3.2 Функционирование комплекса NSL в митозе 62
3.2.1 Оценка эффективности нокдауна генов Rcd1, Rcd5 и MBD-R2 в культуре клеток S2 дрозофилы 62
3.2.2 Влияние белков Rcd1, Rcd5 и MBD-R2 на структуру и формирование центросом 63
3.2.3 Влияние исследуемых компонентов комплекса NSL на ход митоза 66
3.2.4 Локализация исследуемых GFP-меченых белков в культуре клеток S2 D. melanogaster 69
3.2.5 Взаимосвязанное функционирование белков Rcd1 и Rcd5 74
3.2.6 Влияние белков комплекса NSL на центромерные и кинетохорные компоненты 75
3.2.7 Регуляция транскрипции центросомных, центромерных и кинетохорных белков компонентами комплекса NSL 77
3.3 Влияние исследуемых белков Rcd1, Rcd5 и MBD-R2 на кинетохор опосредованное формирование микротрубочек 79
Глава 4. Обсуждение результатов 83
Заключение 88
Выводы 90
Список литературы 91
- Функциональная характеристика митотического цикла
- Комплекс KANSL/NSL
- Получение и характеристика поликлональных антител к белку Rcd1
- Влияние исследуемых белков Rcd1, Rcd5 и MBD-R2 на кинетохор опосредованное формирование микротрубочек
Функциональная характеристика митотического цикла
Митоз – процесс деления соматических клеток эукариот, при котором материнская клетка делится на две дочерние. При этом обеспечивается точная передача генетической информации от материнской клетки к дочерним. Безошибочное протекание процесса клеточного деления крайне важно для нормального развития и поддержания гомеостаза многоклеточных организмов. У человека, например, нарушения митоза приводят к онкологическим заболеваниям и врожденным дефектам [Ganem et al., 2007]. Правильное прохождение и завершение митоза зависит от последовательных биохимически и морфологически определенных событий, которые точно скоординированы во времени и пространстве.
Традиционно выделяют пять стадий митоза: профазу, прометафазу, метафазу, анафазу и телофазу (Рисунок 1). Началом профазы, как правило, считают появление конденсированных хромосом внутри ядра, каждая из которых состоит из двух сестринских хроматид, которые удерживаются вместе посредством центромер. Во время поздней профазы на центромерах образуются специализированные белковые структуры, называемые кинетохорами. В большинстве центросом-содержащих клеток на этом этапе происходит созревание центросом и их расхождение к противоположным сторонам ядра. За пределами ядра каждая из образовавшихся центросом формирует ахроматиновое веретено деления (ВД), состоящее из астральных и межполюсных МТ.
Прометафаза начинается с разрушения ядерной мембраны, позволяя астральным МТ взаимодействовать с конденсированными хромосомами. МТ, исходящие из противоположных полюсов веретена, взаимодействуют с МТ, растущими от кинетохоров (Рисунок 1). Это взаимодействие приводит к образованию кинетохорных волокон (к-фибрилл), которые соединяют хромосомы с полюсами ВД. После того, как все хромосомы выстроились в экваториальной плоскости и сестринские хроматиды стали обособленными (за исключением области центромер), клетка вступает в стадию метафазы. Конгрессия хромосом и присоединение сестринских кинетохоров к астральным МТ является отличительной характеристикой метафазы. Помимо к-фибрилл, корректную биполярную структуру ВД обеспечивают и другие популяции МТ, такие как межполюсные МТ, которые перекрываются на экваторе ВД, а также способствуют формированию пучков кинетохорных МТ [Gadde and Heald, 2004] (Рисунок 1).
Кроме морфологических изменений, в клетках происходит каскад биохимических реакций, контролирующих прохождение митоза на каждом этапе. У всех эукариотических организмов существует система контрольных точек (Checkpoints), или «переключателей», которая позволяет клеткам как вступать в митотический цикл, так и выходить из него при соблюдении всех условий. Механизм «переключателей» сходный у разных организмов и в его основе лежит один и тот же процесс – активация комплекса Циклина А (CyсA) или Циклина Б (CyсB) с митотической протеинкиназой Cdk1 [Nurse, 1990]. Циклины типа Б необходимы для корректного прохождения митоза, тогда как Циклины типа А имеют важное значение для активации митотического цикла [Knoblich и Lehner 1993; Jacobs et al., 1998]. Объединив генетические, биохимические и цитологические методы, удалось идентифицировать данный комплекс как ключевой регулятор митоза, который, кроме этого, является консервативным у всех организмов от дрожжей до человека [Doree and Hunt, 2002]. Серин/треониновая протеинкиназа Cdk1/CyсB представляет собой гетеродимер, состоящий из каталитической Cdk-субъединицы и регуляторной циклиновой субъединицы обеспечивающей выбор специфического субстрата.
Пространственный контроль митотических процессов проявляется в регулировании активности Polo-подобных киназ (Plk) и киназ семейства Aurora. Белки семейства киназ Aurora и Polo были впервые обнаружены у дрозофилы. В клетках животных киназа Aurora особенно важна при формировании ВД [Reber and Hyman, 2015]. У позвоночных важную роль также играет белок TPX2, активирующий киназу Aurora А путем подавления ее дефосфорилирования фосфатазой PP1 [Bayliss et al., 2003] и привлекая киназу Aurora A к МТ [Wittmann et al., 2000; Kufer et al., 2002]. Киназы семейства Aurora имеют важное значение в исправлении дефектов присоединения МТ к кинетохорам, что зависит от пространственного градиента активности, установленного между киназой Aurora и антагонистической фосфатазой PP1 [Cheeseman, 2014]. Но как только клетки переходят в стадию анафазы, киназа Aurora В перемещается из центромерных районов хромосом к МТ для координации цитокинеза [D Avino et al., 2015]. Стадия анафазы начинается после завершения выравнивания хромосом в экваториальной плоскости клетки и разделения сестринских хроматид. В ходе анафазы хромосомы, разделившиеся на сестринские хроматиды, двигаются в направлении противоположных полюсов ВД (Рисунок 1).
Анафаза включает в себя 2 этапа – А и Б, которые отличаются механизмами, отвечающими за расхождение дочерних хромосом. В анафазе А хроматиды расходятся к полюсам за счёт укорочения к-фибрилл, а в анафазе Б происходит расхождение самих полюсов после разделения сестринских хроматид, которое обеспечивается взаимным отталкиванием полюсных волокон МТ.
Соответственно, в анафазе А участвуют моторные белки, связанные с кинетохорами, а в анафазе Б – моторные белки, располагающиеся как на полюсах веретена, так и в центре веретена. При успешном прохождении клеткой стадии анафазы сестринские хроматиды разделяются на две равные группы, расположенные в противоположных сторонах ВД (Рисунок 1). Метаболические процессы также координируют изменения морфологического строения клеток для перехода на стадию телофазы и возврата дочерних клеток в состояние интерфазы. Так, например, для деградации киназ Plk1 и Aurora определенную роль играет APC-зависимый протеолиз [Lindon and Pines, 2004; Floyd et al., 2008].
Визуально телофаза характеризуется формированием ядерной оболочки вокруг каждой группы хромосом, внутри которых начинается деконденсация хроматина (Рисунок 1). Телофаза завершается цитокинезом и последующим разделением клеток на две дочерние. В клетках животных цитокинез опосредуется сужением сократительного кольца – переходной структуры, которая формируется в анафазе и содержит F-актиновые нити и активный миозин II. Сократительное актомиозиновое кольцо образуется субкортикально на экваторе делящейся клетки, его активность приводит к образованию борозды деления, которая углубляется до тех пор, пока две дочерние клетки не окажутся полностью разделенными [Fededa and Gerlich, 2012].
Комплекс KANSL/NSL
Особый интерес вызывает белковый комплекс KANSL, который у млекопитающих является одним из важнейших модификаторов хроматина и включает в себя 6 белков – KANSL1, KANSL2, KANSL3, MCRS1-MCRS2, PHF20 и WDR5 [Lam et al., 2012], ассоциированных с гистон-ацетилтрансферазой MOF. Комплекс KANSL регулирует транскрипцию многих генов и способствует поддержанию плюрипотентности стволовых клеток за счет подавления экспрессии генов дифференцировки [Ravens et al., 2014; Chelmicki et al., 2014]. Предыдущие исследования указывают на то, что белки этого комплекса эффективно взаимодействуют друг с другом как in vitro, так и in vivo, и демонстрируют высокую эволюционную консервативность [Cai et al., 2010; Dias et al., 2014; Mendjan et al., 2006].
Кроме того, выявлена роль и локализация некоторых белков комплекса KANSL в клетках млекопитающих в ходе митоза. Показано, что в результате РНК-интерференции гена, кодирующего белок KANSL3, происходит задержка митоза на стадии прометафазы и нарушение выравнивания хромосом в экваториальной плоскости ВД. Интересно, что белок KANSL3 связывается с двумя важными факторами, регулирующими формирование ВД, – белками TPX2 и MCAK [Meunier et al., 2015].
В интерфазе белок KANSL3 расположен в ядре, что соотносится с его функцией регулятора транскрипции. Однако при переходе клетки в митотическую фазу, он связывается с минус-концами МТ ВД и стабилизирует их RanGTP-зависимым образом [Meunier et al., 2015]. Авторы предполагают, что белок KANSL3 направляет другие компоненты комплекса КАNSL к минус-концам к-фибрилл, регулируя их динамику и выполняя важную функцию во время сборки ВД [Meunier et al., 2015]. Похожим образом ведет себя и другой компонент комплекса – белок MCRS1. Эксперименты, выполненные на клетках человека и экстрактах яиц Xenopus, показали, что белок MCRS1 связывается с минус-концами МТ и взаимодействует с белком TPX2, также как и белок KANSL3.
Кроме того, установлено, что один из компонентов комплекса KANSL, белок WDR5, взаимодействует с кинезином Kif2A и комплексом MLL, который в свою очередь связывается с МТ и регулирует корректную сборку ВД и расхождение сестринских хроматид [Ali et al., 2017].
Комплекс KANSL является важным для функционирования организма человека, поскольку дефекты в структуре генов, кодирующих компоненты комплекса, связаны с различными заболеваниями. Так, например, гетерозиготной мутации локуса KANSL1 достаточно для развития синдрома Кулена-де-Вриза, характеризующегося задержкой развития и умеренной умственной отсталостью [Koolen and de Vries, 1993; Koolen et al., 2012; Zollino et al., 2012]. Более того, дупликации в 1-3 экзонах гена KANSL1 увеличивают риск возникновения врожденного порока сердца [Leon et al., 2017]. Мозаичные однонуклеотидные вариации в гене KANSL2 чаще всего ассоциированы с тяжелой умственной отсталостью у пациентов [Gilissen et al., 2014]. В одной из опубликованных работ авторы указывают на жизнеспособность пациентов с немелкоклеточным раком легких в зависимости от уровня экспрессии гена PHF20, кодирующего еще один компонент комплекса KANSL [Tang et al., 2015]. Другие работы показывают, что повышенная экспрессия гена MCRS1 коррелирует с агрессивным течением колоректального рака [Shi et al., 2009; Shi et al., 2012], глиомы [Lin et al., 2009; Lin et al., 2013], немелкоклеточного рака легких [Lin et al., 2013] и других онкопатологий [Sheikh et al., 2019].
Ортологом комплекса KANSL у дрозофилы является консервативный комплекс non-specific lethal (NSL), который включает в себя гистон-ацетилтрансферазу MOF и следующие 6 субъединиц: Nsl1/Wah (KANSL1), Dgt1/Nsl2 (KANSL2), Rcd1/Nsl3(KANSL3), Rcd5 (MCRS1), MBD-R2 (PHF20) и Wds (WDR5). Являясь компонентом хроматина, он играет ведущую роль в регуляции экспрессии генов домашнего хозяйства. Нарушение функционирования генов, кодирующих белки комплекса NSL, у дрозофилы приводит к смерти на ранней личиночной стадии, как у самок, так и у самцов [Raja et al., 2010; Lam et al., 2012].
На сегодняшний день функции комплекса NSL преимущественно описаны для интерфазных клеток [Lam et al., 2012; Chelmicki et al., 2014]. Однако во время митоза происходит глобальное изменение структуры хроматина, что приводит к его совершенно уникальному состоянию – высоко конденсированному «митотическому» хроматину. Несмотря на то, что часть модификаторов хроматина остаются связанными с ним и в митозе, часть из них высвобождается для выполнения других функций в различных клеточных компартментах [Gottesfeld and Forbes, 1997; Kruhlak et al., 2001].
Одним из функциональных компонентов комплекса NSL является белок MBD-R2 (ортолог белка человека PHF20), относящийся к семейству белков, содержащих мотив MBD (methyl-CpG-binding). Эти белки связываются с 5-метилцитозином и преобразуют паттерн метилирования генома в соответствии с функциональным клеточным состоянием. Правильное прочтение эпигенетических меток имеет особенное значение для нервной системы дрозофилы, где неправильная экспрессия или нарушение функционирования белков MBD может приводить к дефектам развития [Gupta et al., 2016]. Ген MBD-R2 локализуется на хромосоме 3R и кодирует 2 изоформы белка, включающих в себя домены MBD, ZnF и PHD. Одна из существующих изоформ сорержит также домен Tudor.
Белок MBD-R2 связывается с 5-концами генов, и в одном из исследований было обнаружено 5321 промоторов в геноме клеток S2 D. melanogaster, с которыми он связан [Lam et al., 2012]. Показано, что 66% активно транскрибируемых генов в клетках S2 связаны с белком MBD-R2.
Наряду с этим, белок MBD-R2 участвует в работе ядерного порового комплекса, взаимодействуя с нуклеопорином Nup98 [Pascual-Garcia et al., 2014]. Белки ядерного порового комплекса регулируют ядерный транспорт, но также вовлечены в регуляцию транскрипции и структуры хроматина. Было показано, что, по крайней мере, 44% сайтов связывания белка Nup98 с хроматином перекрываются с сайтами связывания белка MBD-R2. Методом ко-иммунопреципитации, используя белковые экстракты клеток S2, обогащенные ядерной растворимой фракцией, было обнаружено, что белок Nup98 взаимодействует с белком MBD-R2. Также было подтверждено частичное перекрывание сайтов связывания белков Nup98 и MBD-R2 на политенных хромосомах слюнных желез личинок Drosophila третьего возраста с помощью иммуноокрашивания. С другой стороны, снижение количества белка MBD-R2 в клетках слюнных желёз вызывает частичную потерю белка Nup98 на хромосомах, указывая, что белок MBD-R2 необходим для привлечения белка Nup98 к хроматину, по крайней мере, на некоторых сайтах связывания белка Nup98. Этот же эффект был подтвержден посредством РНК-интерференции гена MBD-R2 в клетках S2, после которой количество белка Nup98 снизилось на 40-50%. Однако, снижение количества белка Nup98 не оказывало влияния на привлечение белка MBD-R2, указывая на то, что белок Nup98 не участвует в связывании белка MBD-R2 с хроматином [Pascual-Garcia et al., 2014].
Другой компонент исследуемого комплекса NSL – белок Rcd1, также регулирует транскрипцию многих генов [Kondo and Perrimon, 2011; Dias et al., 2014]. Ген Rcd1 кодирует три варианта белка длиной 1001, 1066 и 934 а.о., каждый из которых содержит / гидролазный домен [Raja et al., 2010]. Дефицит этого белка нарушает стабильность всего комплекса NSL. Белок Rcd1 является важным регулятором экспрессии генов, поскольку его недостаточное количество сильно изменяет уровень мРНК генов, кодирующих компоненты комплекса NSL. Авторы предполагают, что уменьшение уровня транскрипции является результатом нарушения ее инициации, что согласуется со сниженным количеством РНК-полимеразы II на промоторах генов [Raja et al., 2010].
Белок Rcd1 был идентифицирован в in vivo скрининге, направленном на выявление генов, контролирующих развитие фолликулярного эпителия у дрозофилы. Нокдаун гена Rcd1 посредством РНК-интерференции приводил к многослойности в локально ограниченной области эпителия, который в норме должен быть однослойным. В данном скрининге похожие дефекты наблюдались, например, после нокдауна генов, кодирующих фосфоинозитол-модифицирующие ферменты [Berns et al., 2014].
В одной из работ, направленной на поиск коровых компонентов системы, контролирующей переход из стадии клеточного цикла G2 в митоз, ген Rcd1 был выявлен как необходимый для ее успешного прохождения. Показано, что снижение уровня белка Rcd1 путем РНК-интерференции приводит к накоплению клеток в фазе G1 [Kondo and Perrimon, 2011]. Также было проанализировано влияние уменьшения количества этого белка на митотический индекс в условиях активации «контрольной точки» G2/M путем обработки ингибиторами топоизомеразы II (доксорубицин, этопозид), рентгеновским излучением, а также цитостатическим антибиотиком блеомицином, который вызывает фрагментацию молекул ДНК. Во всех случаях митотический индекс был существенно увеличен при сниженном уровне белка Rcd1 [Kondo and Perrimon, 2011].
Получение и характеристика поликлональных антител к белку Rcd1
Для проведения исследования требовалось получить поликлональные антитела к белку Rcd1 D. melanogaster, которые не представлены на мировом рынке. Для этого необходимо было разработать плазмидную конструкцию, кодирующую антиген, для последующей иммунизации животных с целью получения антител.
Поскольку белок Rcd1 имеет несколько изоформ, была синтезирована генно-инженерная конструкция, кодирующая общий для всех изоформ белка фрагмент, состоящий из 488 а.о. (Rcd1-488а.о.) (Рисунки 4-6). В синтезируемую конструкцию была введена кодирующая часть гена белка GST, продукт которой необходим для последующей очистки полученных рекомбинантных белков (Рисунок 6). Продукт экспрессии такого вектора представляет собой функциональный белок GST (26 кДа) ковалентно связанный с N-концом целевого полипептида. Гибридные GST-белки могут быть очищены или обнаружены на основе способности GST связывать его субстрат, глутатион (GSH).
Для получения пептида в количестве, необходимом для иммунизации двух SPF-мышей и двух SPF-крыс (SPF – specific pathogen free, беспатогенных), фрагмент целевого белка нарабатывали в клетках бактерий E. сoli (Рисунок 7А), провели его очистку (Рисунок 7Б) и электрофоретический анализ полученных образцов.
На дорожке 2 рисунка 7А представлены белки лизатов исходных контрольных клеток E. сoli, характеризующиеся белковыми фракциями с различным молекулярным весом. Добавление индуктора IPTG индуцировало экспрессию конструкции и привело к наработке рекомбинантного белка GST-Rcd1-488а.о., имеющего молекулярный вес 82 кДа (Рисунок 7А, дорожки 3-5). Таким образом, с помощью данного подхода были получены лизаты бактериальных клеток, содержащие целевой белок. Методом аффинной хроматографии был очищен рекомбинантный белок GST-Rcd1-488 а.о. (Рисунок 7Б, дорожки 5-8) из исходных препаратов лизатов клеток (Рисунок 7Б, дорожка 2).
Полученный рекомбинантный белок GST-Rcd1-488а.о. был диализован против PBS перед последующей иммунизацией SPF-животных (Рисунок 8А). Иммунный ответ на инъекции антигена оценивали на разных этапах иммунизации крыс и мышей методом Вестерн-блот анализа, с использованием белковых экстрактов из взрослых мух линии Oregon D. melanogaster, в которых превалирует изоформа белка Rcd1 с молекулярной массой 100 кДа.
В контрольных сыворотках, полученных до иммунизации мышей и крыс, антитела к белку Rcd1 отсутствуют (Рисунок 8Б; дорожки 2, 4, 6, 8). Первичный иммунный ответ на GST-Rcd1-488а.о. был обнаружен через 35 дней после иммунизации у мышей (Рисунок 8Б; дорожки 3,5) и крысы №1 (Рисунок 8Б, дорожка 7), что подтверждается анализом полученных сывороток крови иммунизированных животных, которые содержат антитела к белку Rcd1 (ожидаемые продукты 100 кДа указаны стрелками). В связи с тем, что у крысы №2 иммунного ответа не обнаружено (Рисунок 8Б; дорожка 9), животное было исключено из исследования.
Полученные поликлональные антитела мыши №1 в разведении 1:500 были протестированы на антигенную специфичность антител к белку Rcd1 с использованием лизатов контрольных клеток S2 (Рисунок 9, дорожки 1, 7) и клеток после РНК-интерференции гена Rcd1 (Рисунок 9, дорожки 2, 8). Вестерн блот анализ показал взаимодействие антител с белком молекулярной массы 130 кДа (Рисунок 9, дорожка 1), который соответствует полноразмерному белку Rcdl, присутствующему в клетках S2 D. melanogaster. Кроме того, после РНК-интерференции этот же сигнал отсутствует (Рисунок 9, дорожка 2), что свидетельствует о специфичности полученного препарата поликлональных антител к белку Rcdl.
При этом нагрузка (количество белка на дорожку) экспериментальных образцов по общему белку превышала контрольную в связи с ожидаемой эффективностью снижения уровня целевого белка, и контролировалась по количеству ламина, -тубулина и актина (Рисунок 9, дорожки 7, 8). Растворимость белка оценивали, сравнивая дорожки, на которые были нанесены образцы лизата (Рисунок 9, дорожки 1, 2) и клеточного детрита (Рисунок 9, дорожки 4, 5).
Таким образом, в рамках исследования получены поликлональные мышиные антитела к белку Rcd1, которые были использованы в последующих экспериментах.
Влияние исследуемых белков Rcd1, Rcd5 и MBD-R2 на кинетохор опосредованное формирование микротрубочек
Исходя из данных, полученных в рамках настоящей работы, стало интересным исследовать влияние компонентов комплекса NSL на кинетохор-опосредованное формирование ВД после деполимеризации МТ. Несмотря на то, что обработка клеток холодом и использование митостатиков позволяют достигнуть максимальной деполимеризации МТ ВД и проанализировать повторный рост МТ, результаты, полученные при использовании этих методов, различаются.
Так, например, после инкубации клеток при 0С в течение 3 часов повторный рост МТ наблюдался как от кинетохоров, так и от центросом (60%) (Рисунок 22А). Обработка клеток митостатиком колцемидом, напротив, полностью блокирует способность центросом образовывать МТ, но не оказывает влияния на кинетохор-зависимый рост МТ. Через 45 мин после удаления колцемида повторно формирующиеся МТ были обнаружены в области кинетохоров, а через 60 мин наблюдались уже сформированые пучки МТ, которые еще через 15 мин образовывали полюса анастральных ВД (Рисунок 22Б).
Ультраструктурный анализ клеток после обработки холодом и колцемидом показал, что подобранные нами условия деполимеризации для последующего исследования повторного роста МТ от кинетохоров являются оптимальными. На рисунке 23 представлены мета/прометафазы, в которых полностью отсутствуют МТ или пучки МТ, образованных кинетохорами, которые формируются в необработанных митотических клетках.
Полное восстановление ВД после обработки холодом происходило в первые 3 мин после повышения температуры до 22С, тогда как тот же самый процесс занимал около 75 мин после обработки колцемидом. Замедленное формирование МТ после обработки колцемидом и отсутствие астральных МТ позволило детально исследовать паттерн и скорость повторного роста МТ от кинетохоров. Соответственно, для определения влияния белков Rcd1, Rcd5 и MBD-R2 на кинетохор-опосредованное формирование ВД наиболее подходящим методом явилась обработка клеток колцемидом с последующим анализом повторного роста МТ. Для более корректного анализа экспериментальные данные были нормированы на соответствующие контрольные значения в каждой временной точке, принятые за 100%. На рисунке 24 показано, что при РНК-интерференции каждого из исследуемых генов скорость повторного роста МТ снижена через 30 мин после удаления митостатика из среды, что демонстрируется меньшей долей клеток с выявленными кинетохорными МТ (60-70% относительно 100% в контроле).
Для определения влияния белков комплекса NSL на полимеризацию МТ, а именно на включение субъединиц тубулина, измеряли интенсивность флуоресценции растущих МТ в процессе повторного роста. Поскольку через 30 мин после удаления колцемида выявляются наибольшие различия между экспериментальными и контрольными данными, именно эта временная точка была выбрана для измерения флуоресценции растущих МТ. Дальнейший анализ показал, что во всех экспериментальных образцах интенсивность флуоресценции также снижена и составляет 0,64±0,24, 0,81±0,3 и 0,61±0,06 о.е. при нокдауне генов MBD-R2, Rcd1 и Rcd5, соответственно. Однако через 45 и 75 мин образование МТ происходит в более чем 90% клеток (Рисунок 24), что свидетельствует о частичной блокировке формирования кинетохорных МТ на ранних этапах. Таким образом, несмотря на описанные выше митотические нарушения, клетки с дефицитом компонентов комплекса NSL сохраняют способность полностью восстанавливать ВД посредством кинетохорных МТ.