Введение к работе
Актуальность те№>'. Развитие тканей» органов и их систем, а такхе собственно многоклеточных организмов зависит от координации процессов -пролиферации и дифференциации клеток. Поэтому исследования молекулярных механизмов дифференциации являются одной из центральных, задач клеточной биологии и индивидуального развития. Эта проолемма в сущности является теоретической предпосылкой разработки методов борьбы с такими нарушениями дифференциации» как злокачественное перерождение клеток,
Механизмы дифференциации любой клетки строго генетически детерминированы. В реализации программы дифференциации участвуют молекулы, обеспечивающие межклеточную сигнализацию, а такзй гены, ответственные за кодирование балков-рецепторов, принимающих эти сигналы* белков, активирующих и подавляющих репликацию ДИК. и белков, определяющих фенотип клетки 'Mas-sen. 1987: Dexter & spooncer, 1987). значительная часть регуляторних белков кодируются протоонкогенами. поэтому выяснение функционирования этих геков во время дифференциации яізляєтся задачей первостепенной важности. С другой огороиы потенциальная активность генов или, другими ащййш, возможность индуцирования генов белками-регуляторами зависит от структуры хроматина, которая, в свою очередь, определяется белками* постоянно связанными с ДНК - гистоками.
Накапливающиеся за последнее время экспериментальные сведения позволяют предположить. что белки-регуляторы, образующие транскрипционный комплекс (Alaouzni, 1990; wolffe, 1991 J. и гистоны, в частности пістон НІ. конкурируя за место на ДНК во время репликации, определяют расположение нуклеосом на промоторных (регуляторных) последовательностях генов. В этой связи чрезвычайно важным становится понятие регуляторных гханизмо'в, влияющих на экспрессию ядерных протоонкогенов и семейства глстона КГ. известно, что разные субтипы этого гистона неодинаково действуют на структуру ДНК, связываясь о . нею как во время репликации хроматина, так и после завершения транскрипции генов в течение всего клеточного цикла (Garrard, 1951J .
При Изучении ВЗаИМОДеЙСТВИЯ реГуЛЯТОрНЫХ 5ЕЛХ0В И ГИСІ0НС2
удобной биологической моделью является дифференциация клеток эритрошшого ряда - эритролейкемические клетки мыши (МЕЬ). трансформированные комплексом Frlena на стадии проэритробластов (Friena. 1957). меб клетки под воздействием разных химических веществ. таких как гексаметвденбисацетамид ТМБА). диметилсульфоксид (ДМСО) и бутират натрия, дифференцируются. в эритроците-подобные клетки. Эти клетки при проявлении фенотипа эритроцитов (синтез гемоглобина» белков цктоскелета) сохраняют ядро. Последнее предоставляет возможность исследовать изменения структуры хроматина и Функциональную активность генома во время терминальных стадий дифференциации.
Цель работы: _ исследование роли ядерного протоонкогена о-туе и гистоноз семейства НІ в процессе индуиируемог. дифференциации эритролейкемических клеток мыши.
Задачи работы: при индукции дифференциации KEL клеток разными индукторами:
-
изучить динамику экспрессии мРНК с чаус;
-
исследовать экспрессию мРНК гистона HI0:
-
определить динамику количественных изменений субтипоБ гистонов ні и Ш0:
-
путем введения е MEL клетки вектора, содержащего ген гистона Hi0 под индуцибелъным промотором» изучить эффект постоянной экспрессии трансфицированного гена гистона НІ0 на процессы пролиферации-дифференциации в этих клетках.
Научная новизна. Исследована кинетика экспрессии протоонкогена с-туе ъ проходящих дифференциацию эритролэйкемических клетках мышей при использовании ДМСО. ГМБА и бутирата натрия в качестве индукторов дифференциации. Установлено* что в течение двух часов после добавления в - среду указаниях индукторов транскрипция протоонкогена с-myo полностью блокируется, однако реэкспрессия этого гена при индукции бутиратом натрия начинается раньше (18 ч). чем при индукции дмзо или ГМБА (24 ч). Показано, что гиперацезилирование гистонов НЗ и Н4 не препятствует нормальным процессам транскр:тции при дифференциации MEL клеток, индуцированных бутиратом натрия.
Впервые исследована кинетика экспрессии мРНК гистона Ч1»
_ 3 -
увеличения, количества этого оелка, а. также изменения количества некоторых молекулярных вариантов гксгока НІ з їроматинє. ігроходясих дифференциацию эритродеякемическнх клетках мыэей. Установлено, что' во время первого клеточного цикла после начала индукции і.G-12 ч), когда эритролейкемичеокие клетки становятся ко^-дотироззнными к эритроилной дифференциации, колігчеотво пістона ні0 увеличивается в 5 раз- в то время как количество некоторых вариантов пістона НІ уменьшается. Ка последки:', этапах дифференциации 4EL клеток (72-120 ч) количество пистона ні0 в хроматине составляло около 25-30% от пистона НІ.
впервые осуществлена трансфекния MEL клеток рзкбмсинантной плазшдой рюс~5 содержащей экзогенный ген гистона Ш под икдуиибелънкм промотором MMTY ьтйл Исследована кинетика экспрессии мРКК. экзогенного гена гистона НІ0 и протоонкогена с-яус 55 трансфіщировашшх MEL клетках. Установлено, что. во время индукции ЖГУ ЪТЯ промотора дексаметазонсм, мРНК экзогенного ЕЕ0, после изменений экспрессии в первом клеточном цикле и начиная со второго клеточного цикла (24 ч). постоянно увеличивается. Установлено, что при экспрессии экзогенного гена НТ до 20% клеток проходят дифференциацию. Показане. что экспрессия экзогенного Ш вызывает изменения экспрессии протоонкогена с-аус. сходные с изменениями при хшическае индукции дифференциации.
Практическая ценность работы. Разработан метод транзакции
клеток млекопитающих в'суспензии экзогенным геном я отбора
трзнсфектангоз на основе селективного уаркера.
Транофицкрованные МШ, клетки могут быть использованы з дальнейших исследованиям механизмов дифференциации клеток. Результаты работы используются в лекциях по клеточной биологии на Естественном факультете Вильнюсского Университета..
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на X Всесоюзном симпозиуме по структуре л функциям клеточного ядра (Гродно- 1330) и на I международной конференции молодых ученых "Проблемы и методы з молекулярной биологии клетки v в биотехнологии" (Кзварна, Булгирия. 1990).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи и тезисы 2-х докладов. ' статья в печати.
Объем работы, диссертация соутоит из введения, обзора
литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, обобщения, выводов л списка актируемой литературы (180 источника). Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунками и I таблицей,
Объектом исследования являются эритролеякемичеокие клетки мыши, линии F4N, а такте экзогенным геном гистона НТ нами трансфшшрованные эти не клетки.
Для культивирования МЕЪ клеток использованы среды
RPMI-I640 (SIGMA) ' И DMEM (Flow)-. ПЛОТНОСТЬ MEL КЛЄТ0К 3
культуре поддерживалась в интервале 1-5 х Ю5 хлеток/мл при температуре культивирования 37 с. для индукщш дифференциации использованы 2.5 мм бутирата натрия, 2% ДМСО и 5 мм ГМБА, а как индуктор экзогенного гена гистона Ш - I мкМ 'дексаметазон» Количество дифференцированных клеток в культуре определялось при помощи бензидиновой реакции ' (Orkin, 1975). Общее число клеток в культуре определяли подсчитыванием жизнеспособных клеток, применяя в качестве красителя 0*4% трйпановый синий.
Для трансфекции использована векторная ялазмида pbBG (Pharmacia), содержащая индуцибельный промотор MMTV UTE, под которым была вставлена КДНК гистона НТ (Dr. R.N.Elseranan. США). Последовательность кЯНК гистона НТ такае содержит 5' нетраяслируемую последовательность и кодируемую область примерно из 15 нп. находящуюся за терминальным TGA кодоном» Транофекция суспензных MSL клеток проведена кальций-фосфатным методом (Gorman. 19823. Совместно с рекомбинантной плазмидой рше трансфиийрована и плазмида pESVneo. содержащая селективный маркер пео, который был использован для селекции грэнсф-диированных клеток.
Осшую РНК после разного, времени индукции выделяли с пглменекием гуанидинизотиоциаката (Chomczynski '-< Sacclu, 1987). ВП0СЛ5ДСТВШ1 эта РНК была фракционирована при . помоши плектроїореза в денатурирующих условиях ь агарозном геле, переплела на мембраны нуЬолй-к и далее проведена ее г-,Л')Т-п.;гридизация с соответствующими мечеными пробами ДНК іМ--:і: іПі: и др., іі84). Радиоактивность фракций нуклеиновых
кислот на иэкеранах после блот-гибридизации была определена методом раяиоазтографии.
Ядра MEL кісток выделяли по методу Hall et al. (1Э85) с некоторыми модификациями. Общий гистон из клеточных ядер экстрагировали 0.4 н H7S04, осаждали на холоду 96% этанолом. Выделенный общий гистон фракционировали при помоши электрофореза в полиакриламидком геле в анионной эдектреФоретической_системе. содержащей додецилсульфат натрия (Laemmll. 1970). и в катиснной электрофоретической системе. содержащей е М мочевину (Panylm « chaiJcley. 1969).