Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Роль эндотелия в развитии сосудистых патологий 13
1.1. Роль эндотелия в развитии сердечно-сосудистых заболеваний 13
1.1.1. Роль воспаления в развитии атеросклероза и атеротромбоза 13
1.2. Возрастные факторы, вызывающие активацию эндотелия 17
1.3. Адгезия лейкоцитов – важный эффект активации эндотелия 20
ГЛАВА 2. Сигнальные каскады фактора некроза опухолей
2.1. Комплекс рецептора ФНО 22
2.2. Сигнальный путь NFB 24
2.3. Сигнальные пути митоген-активируемых протеинкиназ 31
2.4. Регуляция клеточной смерти фактором некроза опухоли 32
ГЛАВА 3. Митохондрии как сигнальные органеллы в клетках эндотелия 36
3.1. Продукция активных форм кислорода в митохондриях 36
3.2. Антиоксидантные механизмы митохондрий 38
3.3. Разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования 40
ГЛАВА 4. Митохондриальные антиоксиданты 43
4.1. Митохондриально направленные антиоксиданты и липофильные
катионы могут выступать в роли разобщителей 45
ГЛАВА 5. Материалы, методы и объекты исследований 47
5.1. Материалы и реагенты 47
5.2. Животные
5.2.1. Выделение РНК из аорт мышей 49
5.2.2. Определение концентрации мРНК ICAM1 в аортах мышей методом микрочипа 49
5.2.3. Анализ транскрипционных путей с помощью базы данных KEGG 50
5.2.4. Обратная транскрипция 50
5.2.5. Определение концентрации мРНК ICAM1 методом ПЦР в реальном времени 51
5.2.6. Определение концентрации ФНО и IL-6 в сыворотке крови мышей методом ELISA 53
5.3. Клетки 53
5.3.1. Цитотоксический тест 54
5.3.2. Оценка количества клеток со сниженным содержанием ДНК 54
5.3.3. Анализ адгезии лимфоцитов к монослою эндотелиальных клеток. 55
5.3.4. Определение концентрации мРНК ICAM1 в клетках линии EA.hy926 55
5.3.5. Оценка экспрессии ICAM1 на поверхности клеток (In-cell Western Blot) 55
5.3.6. Определение концентрации IL-6 и IL-8 в культуральной среде 56
5.3.7. Определение относительной разности потенциалов мембран митохондрий
5.3.7. Вестерн блот 57
5.3.8. Выделение ядерной фракции для определения содержания p65 в ядре 57
5.3.9. Выделение цитоплазматической фракции для определения содержания уровня цитохрома с 5.3.10. Иммунофлуоресценция 59
5.3.11. Оценка морфологии ядер клеток 59
5.3.12. Статистическая обработка результатов 59
Результаты и обсуждение 60
Глава 6. Митохондриально-направленный антиоксидант SKQ1 подавляет активацию сосудистого эндотелия in vivo 60
6.1. Действие длительного приема SkQ1 на профиль экспрессии генов в аортах и сердцах 14-месячных мышей линии BALB/c 60
6.2. SkQ1 снижает уровень экспрессии мРНК ICAM1 у старых мышей линии C57Black/CBA. 63 6.3. SkQ1 не влияет на уровень ФНО и IL-6 в крови старых мышей
F1(CBAxC57Bl/6) и мышей линии C57BLKS-Leprdb/J с
наследственным ожирением и диабетом II типа 66
ГЛАВА 7. Характеристика клеточных линий ea.hy926 и ECV304 69
7.1. Определение фактора Виллебранда 69
7.2. Определение VE-кадгерина 71
7.8. Оценка реакции клеток линий ECV304 и EA.hy926 на фактор некроза
опухоли 74
ГЛАВА 8. Митохондриально-направленные антиоксиданты предотвращают апоптоз клеток эндотелия in vitro 77
8.1. ФНО инициирует апоптоз клеток линии EA.hy926. SkQR1 предотвращает развитие ФНО-зависимого апоптоза 77
8.2. SkQR1 подавляет митохондриальный путь индукции апоптоза 80
ГЛАВА 9. Митохондриально-направленные соединения подавляют активацию клеток эндотелия in vitro 82
9.1. Митохондриально-направленные антиоксиданты подавляют активацию эндотелия, вызванную ФНО 82
9.2. Разобщители дыхания и окислительного фосфорилирования подавляют активацию эндотелия 91
ГЛАВА 10. Механизмы защитного действия митохондриально-направленных антиоксидантов при активации эндотелия ФНО 102
10.1 В клетках линии EA.hy926 активация эндотелия регулируется преимущественно NFB- зависимым сигнальным путём 102
10.2. SkQ1 не влияет на активность MAP-киназ 102
10.3. SkQ1 снижает уровень фосфорилирования IBa 105
10.4. SkQ1 подавляет перемещение p65 в ядро 106
Заключение 113
Выводы 114
Благодарности 115
Список литературы 115
- Роль воспаления в развитии атеросклероза и атеротромбоза
- Регуляция клеточной смерти фактором некроза опухоли
- Разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования
- Анализ транскрипционных путей с помощью базы данных KEGG
Роль воспаления в развитии атеросклероза и атеротромбоза
Помимо окисления и повреждения макромолекул, АФК регулирует провоспалительные сигнальные пути и синтез провоспалительных цитокинов и других медиаторов.
Активация при старении сигнальных путей, участвующих в регуляции воспаления NFB – важнейший сигнальный путь, регулирующий экспрессию медиаторов воспаления: молекул адгезии, цитокинов, факторов роста [Makarov, 2000]. Этот путь является редокс-чувствительным [Gloire, 2006; Morgan, 2011], а уровень окислительного стресса, как упоминалось выше, увеличивается при старении. Активность NFB также растёт при старении [Chung, 2006; Sung, 2006; Donato, 2007; Ungvari, 2007]. Кроме того, она регулируется MAP-киназами p38 [Craig, 2000; Baeza-Raja, 2004] и JNK [Papa, 2006]. Сами MAP-киназные сигнальные пути тоже регулируются NFB. MAP-киназные сигнальные пути также принимают участие в регуляции воспаления: сигнальный каскад p38 регулирует синтез цитокинов и развитие воспалительного ответа в различных тканях [Kang, 2008; Kim, 2008], а сигнальный каскад JNK играет важную роль в регуляции апоптоза [Chen, 2012]. Активность всех MAP-киназ, включая ERK, увеличивается с возрастом, и стимулируется АФК, аналогично NFB [Kim, 2002; Son, 2011]. Таким образом, АФК, генерация которых растёт с возрастом, стимулируют сигнальные пути, ответственные за регуляцию различных медиаторов воспаления: цитокинов, молекул адгезии и так далее. 1.2.3. Повышение содержания медиаторов воспаления при старении
Как было сказано выше, NFB-зависимый и MAP-киназные сигнальные пути регулируют экспрессию провоспалительных макромолекул.
Концентрации медиаторов и ферментов, участвующих в развитии воспаления, в частности, ФНО, IL-1, IL-6, циклооксигеназы-2 и индуцибельной NO-синтазы [Kim, 2002; Krabbe, 2004; Chung, 2006] растут при старении. Также увеличивается содержание молекул адгезии (VCAM-1, ICAM-1), P-, E-селектинов [Zou, 2004], и продуктов активности циклооксигеназы – тромбоксанов и простагландинов [Gomez-Hernandez, 2006].
Повышение концентраций этих макромолекул приводит к развитию воспаления. ФНО, IL-1 и IL-6 обеспечивают дальнейшее распространение воспалительного сигнала, активируют и повреждают эндотелий [Polunovsky, 1994; Pober, 1998]. Хемоаттрактанты IL-8, RANTES и MCP-1 активируют макрофаги и привлекают их в очаг воспаления [Carr, 1994; Kohidai, 1998]. При воспалении часто наблюдается гиперэкспрессия индуцибельной синтазы оксида азота, что приводит к генерации активных форм азота и геморрагическому шоку [Szabo, 1999; Mungrue, 2002]. ФНО также принимает участие в развитии окислительного стресса [Khaper, 2010].
Активация провоспалительных сигнальных путей при старении, в том числе под действием окислительного стресса, приводит к повышению экспрессии медиаторов воспаления. Эти цитокины вызывают воспаление и повреждение сосудистого эндотелия, приводящие к развитию разнообразных старческих заболеваний и патологий. Кроме того, цитокины также стимулируют окислительный стресс, создавая положительную обратную связь. 1.3. Адгезия лейкоцитов – важный эффект активации эндотелия
Инфильтрация и накопление макрофагов в интиме сосудов – один из первых этапов развития атеросклероза. Продолжительное и избыточное накопление нейтрофилов и макрофагов в области раны становится причиной задержки заживления раны. В обоих случаях важную роль играет процесс адгезии лейкоцитов, регулируемый сосудистым эндотелием.
В кровотоке постоянно присутствуют лейкоциты. При отсутствии воспалительного сигнала они достаточно свободно перемещаются в кровяном русле. Они могут ненадолго прикрепляться к эндотелию за счёт низкоаффинных взаимодействий поверхностных белков нейтрофилов PSGL-1 и CD34 с E-, P- и V-селектинами эндотелия, расположенными на его поверхности, после чего продолжают свое движение. Данный феномен получил название «роллинг» («качение»). Роллинг обеспечивает постоянный контакт белых клеток крови с эндотелием. При активации эндотелия, вызванной воспалительными факторами, на поверхности эндотелия возрастает содержание селектинов, что замедляет движение лейкоцитов [Haraldsen, 1996]. Затем происходит экспрессия и экспозиция на поверхность молекул адгезии ICAM1 и VCAM. В небольшом количестве эти молекулы постоянно находятся на поверхности клеток эндотелия, но при активации их содержание многократно возрастает [Haraldsen, 1996]. В то же время, под действием ряда индукторов воспалительного сигнала (MCP-1, IL-8, RANTES и MIP-1) происходит активация поверхностных интегринов нейтрофилов [Springer, 1994]. В результате, за счёт взаимодействий интегринов с молекулами адгезии, (LFA-1 с ICAM-1, VLA-4 с VCAM-1,LPAM-1 с MAdCAM и другими), происходит остановка движения и плотная адгезия нейтрофилов к эндотелию. В дальнейшем, прикреплённые нейтрофилы мигрируют сквозь эндотелий в очаг воспаления [Springer, 1994]. Этот процесс регулируется уже другими молекулами (PECAM, CD99, VE-кадгерином и белками семейства JAM [Muller, 2003]).
Таким образом, сосудистый эндотелий регулирует процесс привлечения нейтрофилов и моноцитов к очагу воспаления, а также обеспечивает их прикрепление к поверхности и проникновение в этот очаг. Нарушение этого процесса, например, гиперактивация эндотелия под действием цитокинов, служит причиной развития ряда заболеваний и патологий, таких, как атеросклероз или хронических ран. В случае повышенного содержания воспалительных цитокинов в крови, при старости или диабете, организм становится особенно подвержен этим заболеваниям.
Регуляция клеточной смерти фактором некроза опухоли
Белки NFB могут быть подвергнуты большому числу модификаций, которые могут изменять их транскрипционную активность. Ковалентное фосфорилирование или ацетилирование влияет на связывание NFB с ДНК и ассоциацию с коактиваторами или ингибиторами транскрипции, изменяя силу и продолжительность NFB-зависимого транскрипционного ответа. IKK, помимо фосфорилирования IB, может фосфорилировать RelA по положению Ser 536. Предполагается, что эта модификация приводит к стимуляции транскрипционной активности NFB [Campbell, 2004; Viatour, 2005], снижает аффинность RelA к IB [Bohuslav, 2004] и стимулирует транслокацию RelA в ядро [Mattioli, 2004; Sasaki, 2005]. В то же время, аналогичная модификация RelA в макрофагах, где ее осуществляет IKK, приводит к деградации RelA и прерыванию сигнала [Lawrence, 2005]. Киназа IKK также может фосфорилировать гистон H3 [Anest, 2003; Yamamoto, 2003]. Таким образом, роль киназ IKK не ограничивается фосфорилированием IB. То же можно сказать и про CK2 (казеинкиназу II), которая помимо IB фосфорилирует RelA по Ser 529 и стимулирует, таким образом, транскрипционную активность NFB [Bird, 1997; Wang, 1998].
ФНО через киназу MSK-1 вызывает фосфорилирование RelA по Ser 276, что стимулирует его транскрипционную активность [Vermeulen, 2003]. Кроме этого, киназа PKC осуществляет ФНО-зависимое фосфорилирование RelA по Ser 311, которое важно для взаимодействия фактора с коактиватором CBP, а также усиливает транскрипцию [Leitges, 2001; Duran, 2003].
Кроме этого, RelA фосфорилируется киназами RSK-1, GSK-3b, AKT/фосфатидил-инозитол-3 киназой (PI-3-K) и NIK [Sizemore, 1999; Schwabe, 2002; Vermeulen, 2003].
Другой тип модификаций NFB – ацетилирование лизинов, которому могут подвергаться и RelA, и p50. Ацетилирование регулирует различные функции NFB, включая транскрипционную активность, связывание с ДНК и с IB [Chen, 2001].
RelA под действием ФНО или форболового эфира ацетилируется по положениям Lys218, Lys221 и Lys310; а p50 – по положениям Lys 431, 440 и 441. Так же, как и фосфорилирование, ацетилирование RelA и p50 снижает их аффинность к IB и усиливает связывание с ДНК [Chen, 2003; Chen, 2004]. Деацетилирование белков NFB ведёт к снижению транскрипционной активности, усилению связывания с IB и стимулирует экспорт NFB из ядра [Chen, 2003].
В многочисленных исследованиях на протяжении последних десятилетий продемонстрировано, что сигнальный путь NFB зависит от АФК [Schreck, 1992; Meyer, 1994; Schulze-Osthoff, 1995; Flohe, 1997; Ginn-Pease, 1998; Kaltschmidt, 1999; Janssen-Heininger, 2000; Haddad, 2002]. Действительно, активация NFB цитокинами ФНО и IL-1 требует NADPH-зависимой генерации АФК [Sulciner, 1996; Bonizzi, 1999; Sanlioglu, 2001; Park, 2004; Ryan, 2004] и снижения уровня восстановленного глутатиона [Mihm, 1995; Rahman, 2000]. NFB активируется пероксидом водорода [Schreck, 1991]. Соответственно, активность NFB снижается под действием таких антиоксидантов, как пероксидаза глутатиона [Sappey, 1994] или NAC [Staal, 1990; Anderson, 1994].
Тем не менее, в ряде исследований продемонстрировано, что АФК могут ингибировать сигнальный путь NFB. Ингибирование может быть следствием повреждения белков, участвующих в передаче сигнала. Например, окисление p50 по положению Cys 62 предотвращает связывание транскрипционного фактора с ДНК [Toledano, 1991; Matthews, 1992; Mitomo, 1994], в то время как восстановление окисленного остатка возвращает возможность связывания [Matthews, 1992; Mitomo, 1994]. Антиоксидант глутатион подавлял стимулированную пероксидом водорода активность p50 [Pineda-Molina, 2001]. АФК могут инактивировать и предшествующие транскрипции стадии активации NFB. В частности, показано ингибирование комплекса IKK пероксидом [Korn, 2001; Pantano, 2003].Выяснение роли АФК в регуляции сигнального пути NFB осложняется некоторыми методическими трудностями; например, было показано, что классический антиоксидант NAC, использующийся для снижения уровня АФК, может снижать сродство ФНО к рецептору [Hayakawa, 2003]. Таким образом, в разных условиях АФК могут как стимулировать, так и подавлять сигнальный путь NFB.
Сигнальный путь NFB, и в первую очередь, его канонический вариант, является ключевым каскадом, регулирующим воспалительный ответ. Этот путь стимулирует экспрессию ФНО, IL-6, IL-8 [Monaco, 2004] и молекул адгезии ICAM1, VCAM и E-селектина [Collins, 1995].
Транскрипционный фактор NFB часто характеризуется как ключевой антиапоптозный фактор [Heckman, 2002; Karin, 2002]. Действительно, он активирует транскрипцию ряда антиапотозных генов, в частности генов семейства IAP - ингибиторов апоптоза, подавляющих активность каспазного каскада [You, 1997; Stehlik, 1998; Stehlik, 1998; Danial, 2004; Eissing, 2004]. Тем не менее, многочисленные данные указывают на то, что эффект NFB на регуляцию апоптоза не является однонаправленным. Например, разные димеры NFB по-разному влияют на экспрессию проапоптозного белка Bax: p65/p50 её подавляет, в то время как p50/p50 активирует [Grimm, 2005]. p65/p50 активирует экспрессию ключевого антиапоптозного белка Bcl-2 [Catz, 2001], но также и экспрессию проапоптозного белка FAS [Catz, 2001]. Направленность эффекта NFB зависит от природы его активатора [Kaltschmidt, 2000].
Разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования
Митохондрии выполняют различные функции в клетке. Если ранее считалось, что основная роль митохондрий – синтез АТФ, то в последнее время накопилось большое количество свидетельств участия митохондрий в регуляции различных сигнальных путей в клетке. Выше была описана важная роль митохондрий в регуляции апоптоза с помощью изменения содержания в цитоплазме проапоптотических белков. Кроме этого, митохондрии являются одним из основных источников внутриклеточных АФК. В митохондрии содержится большое количество ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Субстраты этих ферментов могут окисляться кислородом, превращая его в супероксидный радикал – предшественник прочих АФК. АФК участвуют в регуляции клеточных сигнальных путей как путём прямого окисления функциональных биомолекул, например, белков или кардиолипина, так и путём активации некоторых сигнальных каскадов, например, митоген-активируемых протеинкиназ или антиоксидантных систем клетки [Adler, 1999; Itoh, 1999].
Часть ферментов митохондрии объединяется в функционально сопряжённую систему – дыхательную цепь переноса электронов (электрон-транспортная цепь, ЭТЦ). ЭТЦ митохондрий – это система из мультиферментных комплексов, обеспечивающих поэтапный перенос электронов (окисление) от субстрата (NADH или FADH2) к кислороду и восстановление его до воды. Перенос электронов сопряжён с генерацией протонного потенциала, который используется АТФ-синтазой для синтеза АТФ.
Основные источники АФК в митохондрии – компоненты дыхательной цепи переноса электронов, а также некоторые ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции. Наиболее изученные из них – комплексы I [Hirst, 2008]и III [Chen, 2003] дыхательной цепи, цитохром b5 редуктаза [Whatley, 1998], моноаминоксидазы [Hauptmann, 1996], дигидрооротат дигидрогеназа [Loffler, 1996], глицерофосфатдегидрогеназа [Kwong, 1998], сукцинатдегидрогеназа (комплекс II) [Zhang, 1998], аконитаза [Vasquez-Vivar, 2000], -кетоглутаратдегидрогеназный комплекс [Starkov, 2004; Tretter, 2004].
Комплекс I (NADH – оксидаза) переносит два электрона от NADH на убихинон, параллельно с этим перекачивая два электрона и два протона из матрикса митохондрий в межмембранное пространство. Существует три основных возможности генерации АФК в комплексе I: обратный перенос электронов, генерация АФК при ингибировании ротеноном и генерация АФК при наличии высокой разницы трансмембранных потенциалов [Andreyev, 2005].При прямом переносе электронов центром генерации АФК в комплексе I является флавин, который, принимая один электрон от NADH, может передать его не на хинон, а на кислород, образуя супероксид радикал. В реакции обратного переноса электронов, при окислении сукцината, центром генерации АФК становится убисемихинон [Ohnishi, 2010; Treberg, 2011]. Добавление разобщителя ингибирует генерацию АФК в этой реакции, поэтому, очевидно, для её протекания важно наличие высокой разницы трансмембранных потенциалов [Hinkle, 1967; Turrens, 2003].
Комплекс III катализирует перенос электрона от убихинола на цитохром c, причём убихинол способен отдавать два электрона; первый электрон переносится через железосеросодержащий белок Риске на цитохром c1,затем на цитохром c. Второй электрон через цитохромы bx и bl возвращается на убихинон, восстанавливая его до убисемихинона (Q-цикл). Повторный оборот цикла приводит к восстановлению убисемихинона до убихинола. В результате комплекс III переносит 4 протона в межмембранное пространство. При этом в течение некоторого времени в сайте o комплекса III находится радикал убисемихинона, который является основным кандидатом на генерацию АФК этим комплексом [Drose, 2012; Bleier, 2013; Lanciano, 2013]. Высокая разница мембранных потенциалов может привести к ингибированию Q-цикла, что увеличивает время существования убисемихинона и повышает вероятность образования АФК [Skulachev, 1996].
Так как функционирование митохондрий приводит к генерации АФК, в митохондриях имеется собственная система подавления АФК. Одним из самых опасных АФК является супероксид радикал. Основным ферментом митохондрии, подавляющим супероксид, является марганцевая супероксиддисмутаза, (MnSOD, SOD2). Она располагается в матриксе митохондрий и катализирует восстановление супероксида до пероксида, и таким образом, предохраняет железосерные кластеры от повреждения [Gardner, 1995].
Кроме SOD2 супероксид может утилизироваться медно-цинковой супероксиддисмутазой (SOD1), которая также катализирует восстановление супероксида [Okado-Matsumoto, 2001; Inarrea, 2005; Hervias, 2006] и окисленным цитохромом с с образованием молекулярного кислорода; в этом случае цитохром с играет роль антиоксиданта [Korshunov, 1999]. В дальнейшем восстановленный цитохром с окисляется цитохром с оксидазой и, таким образом, дополнительным результатом утилизации супероксида является производство АТФ [Mailer, 1990; Pereverzev, 2003].
Анализ транскрипционных путей с помощью базы данных KEGG
В качестве моделей для исследования роли митохондриальных АФК в развитии воспалительных реакций в эндотелии планировалось использовать три клеточных линии: ECV304 [Takahashi, 1990; Suda, 2001], EA.hy926 [Edgell, 1983; Le Tonqueze, 1996], а также первичную культуру клеток эндотелия пуповинной вены человека (HUVEC). Линия ECV304 была выведена из эндотелиоцитов пуповинной вены человека. Линия EА.hy926 представляет собой гибридому, полученную путем соматического слияния карциномы коры надпочечников А549 и эндотелиоцитов пуповинной вены человека. Обе линии хорошо охарактеризованы, и для них показано, что, несмотря на приобретенные ими свойства опухолевых клеток, они сохраняют основные признаки эндотелиальных клеток и могут быть использованы для исследования реакций эндотелия на воспалительные стимулы. Тем не менее, в ходе культивирования свойства клеток могут существенно измениться за счет накопления спонтанно возникающих мутаций, поэтому необходимо было убедиться, что культуры не утратили свойства эндотелия. Для этого мы оценили два параметра: 1) экспрессию маркеров эндотелиальных клеток, VE-кадгерина и фактора Виллебранда; 2) ответ на воспалительный цитокин ФНО (разборка межклеточных контактов, апоптоз).
Фактор Виллебранда (vWF) – мультимерный гликопротеин крови. vWF связывает и стабилизирует фактор свертывания крови VIII , а также связывает отрицательно заряженные фосфолипиды плазматической мембраны эндотелиальных клеток с гликопротеином 1b (GPIb) плазматической мембраны тромбоцитов [Sadler, 2009]. Кроме этого, vWF способствует взаимодействию эндотелиальных клеток с базальной мембраной. vWF синтезируется и секретируется в основном эндотелиальными клетками. Еще один источник vWF – мегакариоциты (предшественники тромбоцитов). Синтезированный белок может конститутивно секретироваться клетками и встраиваться во внеклеточный матрикс или упаковываться в тельца Вейбеля-Паладе.
Фактор Виллебранда детектировался в обеих линиях методом непрямой иммунофлуоресценции. В клетках обеих линий большая часть белка была диффузно распределена по цитоплазме, лишь незначительная его часть была собрана в кластеры разной величины, которые, вероятно, представляют собой тельца Вейбеля-Паладе (Рис. 11). Полученные изображения отличаются от аналогичных изображений, представленных в работах, выполненных на клетках первичного эндотелия (HUVEC). В клетках первичного эндотелия в тельца Вейбеля-Паладе упаковано значительное количество vWF, и сами тельца значительно многочисленнее и крупнее, чем в клетках обеих эндотелиальных линий. Диффузное распределение может быть связано либо с нарушением экспрессии предшественника vWF, либо с нарушениями механизмов его синтеза и упаковки в тельца Вейбеля-Паладе. Для линии ECV304 ранее было показано, что в ней нарушена экспрессия предшественника vWF. Образование телец Вейбеля-Паладе восстанавливалось в клетках ECV304 при введении в них генетической конструкции с нормальным предшественником vWF. Рисунок 11. Распределение фактора Виллебранда в клетках линий EA.hy926 и ECV304. Маркер 10 мкм.
VE-кадгерин – основной маркер эндотелиальных клеток [Vestweber, 2008]. Как и другие кадгерины, VE-кадгерин обеспечивает Ca2+-зависимую гомофильную межклеточную адгезию. Помимо физического взаимодействия, кадгерины участвуют в передаче внутриклеточных сигналов, регулирующих процессы дифференцировки, пролиферации и миграции клеток.
В монослое клеток линии EA.hy962 VE-кадгерин детектировался в области межклеточных контактов (рис. 12). В области межклеточных контактов детектировался также -катенин – белок, связывающий кадгерины с актиновыми микрофиламентами (рис. 13). Форма клетки в монослое представляла собой многогранник, что типично для эндотелия. Актиновый цитоскелет был представлен периферическими кольцевыми пучками актина, стресс-фибриллы практически отсутствовали. Таким образом, структура актинового цитоскелета и межклеточных контактов в клетках EA.hy926 соответствовали описанным в литературе для первичного эндотелия. Рисунок 12. Выявление VE-кадгерина и актина в клетках линии EA.hy926. Маркер 10 мкм.
ФНО (10нг/мл, 24 часа) вызывал существенные перестройки актинового цитоскелета в этих клетках (рис. 13). Эти эффекты ФНО были ранее описаны для первичного эндотелия. Форма клеток становилась веретеновидной, появлялись актиновые стресс-фибриллы, VE-кадгерин (не показано) и -катенин (рис. 13) вымывались из области межклеточных контактов. катенин
С помощью антител против кадгеринов было показано, что в области межклеточных контактов клеток ECV304 присутствуют белки семейства кадгеринов (рис. 14). Периферические кольцевые пучки актина были менее выражены, чем в клетках EA.hy926 (рис. 15), а также присутствовали стресс-фибриллы. ФНО (10нг/мл, 24 часа) вызывал возрастание количества стресс-фибрилл в клетках, а также разборку межклеточных контактов (рис. 15). Однако в монослое клеток ECV304 не детектировался основной маркер эндотелия VE-кадгерин (рис. 15).
Оценка реакции клеток линий ECV304 и EA.hy926 на фактор некроза опухоли Гибель эндотелиальных клеток под действием высоких концентраций воспалительных цитокинов наблюдается при ряде сердечно-сосудистых заболеваний, ассоциированных с хроническим воспалением, таких как атеротромбоз и атеросклероз. Мы оценили способность клеток инициировать апоптоз под действием высоких концентраций ФНО. В синхронизированной культуре клеток EA.hy962, через 24 часа инкубации с ФНО (10 нг/мл и выше) наблюдалось существенное увеличение количества плавающих клеток с сильно конденсированными ядрами (рис. 16 В). В то же время клетки ECV304 оказались не чувствительны к токсическому действию ФНО (10 нг/мл и выше). Анализ морфологии ядер клеток ECV304 показал, что ФНО не вызывает никаких типичных для апоптоза изменений ядер (рис. 16 Г). ФНО также не вызывал открепления клеток ECV304 от подложки.
Обе клеточные линии демонстрировали отличное от первичного эндотелия распределение фактора Виллебранда. Однако в клетках линии EA.hy926, в отличие от ECV304, детектировался основной маркер эндотелия VE-кадгерин, структура их цитоскелета более схожа со структурой цитоскелета первичного эндотелия. Кроме того, EA.hy926 демонстрировали более заметный ответ на ФНО: цитокин вызывал диссоциацию межклеточных контактов, вымывание из области контактов VE-кадгерина и -катенина, а также апоптоз клеток эндотелия. Также в клетках EA.hy926 в ответ на ФНО значительно возрастала экспрессия белка межклеточной адгезии ICAM1 – до 10 раз при концентрации ФНО 50-100 пг/мл, и до 160 раз при концентрации ФНО 10 нг/мл и выше, в то время как в аналогичных условиях экспрессия ICAM1 в ECV304 возрастала лишь в 2-4 раза (рис. 16 Д).