Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Происхождение ВИЧ и штаммы возбудители 11
1.2 Роль дендритных клеток в иммунном ответе 17
1.3 Молекулярные механизмы развития ВИЧ инфекции
1.3.1 Апоптоз в патогенезе ВИЧ-инфекции 22
1.3.2 Генетические факторы в патогенезе ВИЧ-инфекции 24
1.3.3 Лимфоидные органы в патогенезе ВИЧ-инфекции 25
1.4 Участие желудочно-кишечного тракта развитии ВИЧ-инфекции 25
1.4.1 Поражение ЖКТ при ВИЧ-1 инфекции 26
1.5 Антиретровирусная терапия и желудочно-кишечный тракт 30
1.6 Патогенетические этапы развития ВИЧ-инфекции 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 38
2.1.Методы работы с клеточными культурами 38
2.2 Выделение ВИЧ-1 из периферической крови человека 39
2.3 Подтверждение наличия p24-антигена ВИЧ и определение титра вируса 40
2.4 Инфицирование мононуклеарных клеток периферической крови человека полученным вирусом ВИЧ-инфекции 41
2.5 Проточная цитофлуорометрия мононуклеарных клеток периферической крови человека для определения количества ПДК и ВИЧ-инфицированных клеток 42
2.6 Выделение плазмоцитоидных дендритных клеток методом отрицательной магнитной сепарации 42
2.7 Прижизненная биопсия двенадцатиперстной кишки с помощью фиброгастродуоденосокопии 43
2.8 Иммуногистохимические методы анализа 44
2.9 Подготовка образцов тканей для иммуногистохимического исследования 2.10 Флуоресцентная иммуногистохимия 45
2.11 Окраска гематоксилином-эозином з
2.12 Проточная цитофлуорометрия образцов крови больных ВИЧ-инфекцией
2.13 Исследование апоптоза методом окрашивания Annexin-V FITC и PI 48
2.14 Программное обеспечение и статистический анализ результатов 48
ГЛАВА 3. Результаты исследований 49
3.1. Получение и титрование ВИЧ «дикого типа» 49
3.2 Плазмоцитоидные дендритные клетки в периферической крови пациентов с ВИЧ-инфекцией 52
3.3 Плазмоцитоидные дендритные клетки в двенадцатиперстной кишке у ВИЧ-инфицированных пациентов 57
3.4 Оценка жизнеспособности культур клеток, инфицированных ВИЧ-1 68
3.5 Оценка уровня инфицирования ВИЧ культуры плазмоцитоидных дендритных клеток 68
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 71
Заключение 80
Выводы 82
Список сокращений 83
Список литературы 86
- Молекулярные механизмы развития ВИЧ инфекции
- Выделение ВИЧ-1 из периферической крови человека
- Выделение плазмоцитоидных дендритных клеток методом отрицательной магнитной сепарации
- Плазмоцитоидные дендритные клетки в двенадцатиперстной кишке у ВИЧ-инфицированных пациентов
Молекулярные механизмы развития ВИЧ инфекции
Проникновение ретровируса в клетку-мишень – сложный, многоступенчатый процесс, который реализуется взаимодействием гликопротеинов вирусной оболочки и рецепторами клетки-мишени, что приводит, в конечном итоге, к слиянию вирусной и клеточной мембран. Инфицирование начинается со связывания поверхностного гликопротеида gp120 с рецептором CD4 на поверхности клетки (рисунок 2). Рецептор CD4 представляет собой мономерный гликопротеин массой 58 кДа. Его можно обнаружить на поверхности примерно 60% T-лимфоцитов (как зрелых, так и клеток-предшественников), моноцитов, макрофагов, эозинофилов, дендритных клеток и клеток микроглии центральной нервной системы (ЦНС) (Witmer and Danovich 2009). Связывание рецептора CD4 с гликопротеинов вирсной оболочки gp120 запускает конформационные изменения в gp120, что облегчает его взаимодействие с вирусным ко-рецептором, которым обычно служат белки CXCR4 и CCR5 (хемокиновые рецепторы для лимфа– и моноцитотропных штаммов ВИЧ-1, соответственно). Связывание с ко-рецептором запускает дальнейшие конформационные изменения в gp41 — гликопротеине, закрепленном во внешней оболочке вируса и нековалентно связанном с gp120. Изменения в gp41 приводят к внедрению его концевого домена («белка слияния») в клеточную мембрану (Delelis, Zamborlini et al. ; Zeichner 1994). Таким образом, вирус проникает в клетку-мишень, где продолжается клеточный цикл развития вируса.
Обратная транскрипция и транспорт в ядро. Обратная транскрипция (синтез провирусной ДНК на матрице вирусной РНК в цитоплазме клетки под действием фермента обратной транскриптазы) и декапсидизация («раздевание») вируса – тесно связанные процессы (Ocwieja, Sherrill-Mix et al.). Молекулярный механизм, лежащий в основе РНК-ДНК преобразования вируснорй РНК, достаточно хорошо изучен, но каким именно образом происходит декапсидизация вируса, до сих пор окончательно не ясно. Ранние исследования показали, что вирусная частица подвергается декапсидации вскоре после ее проникновения в клетку (Betancor, Alvarez et al. ; Bure, Makhdoomi et al. ; Ocwieja, Sherrill-Mix et al.). Однако, недавние результаты демонстрируют, что это процесс может произойти позже (Betancor, Alvarez et al.), вблизи центросомы или ядерной оболочки.
Используя механизм клеточного ядерного транспорта, ВИЧ-1 переносит преинтеграционный комплекс (ПИК) в ядро с последующей интеграцией в клеточную ДНК. Преинтеграционный комплекс это комплекс вирусных нуклеопротеинов, таких как нуклеокапсид (Воронкова О.В.), матрикс (MA), обратная транскриптаза (ОТ), интеграза (ИН), а также нескольких клеточных белков, связанных с геномом вируса (Betancor, Alvarez et al.). Пока продолжается обратная транскрипция, комплекс ОТ постепенно трансформируется в ПИК (Das, Jeeninga et al. ; Zeichner 1994).
Известно, что цитоплазма клеток, являясь вязкой средой, содержащей органеллы и элементы цитоскелета, встроенные в плотный белковый матрикс, делает невозможной пассивную диффузию вирусных частиц (Brenchley, Schacker et al. 2004). Для достижения ядра, ретровирусные белки взаимодействуют с элементами цитоскелета и компонентами двигательного молекулярного комплекса (комплекс Гольджи) (Akhmanova and Hoogenraad). Входящий в ПИК gag-белок соединяется с легкой цепью микротрубочки (МТ) двигательного динеина и накапливается в зонах от центросомы до места ядерной транслокации (Kandel, Chou et al.). Кроме того, проникающие ВИЧ-1 частицы доставляются по сети MT от периферии клетки к центросоме (Delelis O., et al., 1994). Было проведено исследование по влиянию белка импортина- альфа (Imp – ) на репликацию ВИЧ-1. Количественный анализ полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени показал, что «выключение» Impalpha3 в клетках HeLa, CD4+C8166 Т-клетках и макрофагах привело к значительному снижению уровня 2-LTR, в тоже время не было зарегистрировано подобного эффекта в отношении обратной транскриптазы ВИЧ. Эти данные подтверждают важность Impalpha3 в ядерном импорте ВИЧ. Интеграза (ИН) способна взаимодействовать с Impalpha3 как в клеточной (экспрессионной) системе на основе культуры клеток 293T, так и в ВИЧ-инфицированных CD4+ Т-клетках. В целом, это исследование впервые продемонстрировало, что Impalpha3 является ко-фактором ПИК (Delelis, Zamborlini et al. ; de Jong, Aarts et al. 2009). ПИК включает белок эмерин (EM) (Bhattacharya, Alam et al. ; Li, Song et al. ; Melcon, Kozlov et al. 2006). Группой исследователей было показано, что фосфорилирование EM индуцируется в ранние сроки инфицирования неделящихся клеток (Li, Song et al.). Этот процесс зависит от активности вирион-ассоциированной митоген-активирующей протеинкиназы (МАПК). Специфическое подавление активности МАПК с помощью ингибиторов киназы заметно снижало фосфорилирование EM и приводило к подавлению процессов интеграции провирусной ДНК в хроматин. Этот фермент играет важную роль в содействии интеграции кДНК после ядерной транслокации (Melcon, Kozlov et al. 2006; Meira, Nobrega et al. 2009; Wang, Xie et al. 2009).
Выделение ВИЧ-1 из периферической крови человека
Супернатанты собирали в отдельные пробирки и хранили при -80С. Для определения титра вирусного стока использовали набор для иммуноферментного выявления (ИФА) и подтверждения наличия антигена p24 ВИЧ-1 (Вектор Бест, Уфа).
Сам метод основан на твердофазном иммуноферментном анализе. Принцип метода выявления заключается во взаимодействии антигена p24 ВИЧ-1 из исследуемого образца с моноклональными антителами, иммобилизированными в лунках полистиролового планшета. Связавшийся антиген выявляют с помощью биотинилированных анти-ВИЧ-1 антител и конъюгата стрептовидина с пероксидазой хрена (Вектор-Бест 2013).
Подтверждение наличия белка p-24 вируса ВИЧ осуществляется методом конкурентного иммуноферментного анализа, основанного на принципе нейтрализации p-24-антигена специфическими антителами. Использовали 4 стрипа для проведения ИФА.
От здорового донора была выделена культура клеток МКПК. К клеточной суспензии добавили стримулятора клеточной пролиферации фитогемаглютинина (ФГА, ПанЭко), в концентрации 10 МЕ на мл в среде RPMI 1640 (ПанЭко). Клетки культивировали 24 часа в CO2 инкубаторе при 37 С и 5% содержании CO2. На следующие сутки к культуре клеток добавили вирус иммунодефицита человека. Плашку с культурой клеток и вирусом инкубировали в CO2 инкубаторе при 5% содержании CO2 120 часов. 2.5 Проточная цитофлуорометрия мононуклеарных клеток периферической крови человека для определения количества ПДК и ВИЧ-инфицированных клеток Культуру клеток отмывали 2 раза центрифугированием при помощи стерильного раствора ФСБД (ПанЭко). Согласно протоколу (http://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp?id=flow), клетки фиксировали в 4% раствора параформальдегида и инкубировали 10 минут при 37 С. Затем к раствору добавляли холодный раствор метанола (ТатХимПродукт) и инкубировали 30 минут на льду. Добавляли 2 мл буфера для инкубации (0,5 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) на 100 мл 1X фосфатно-солевого буфера (ФСБ)) и 2 раза отмывали центрифугированием с раствором ФСБД. Затем добавляли антитела, конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом к специфичному маркеру пДК (FITC Anti-human CD303 (BDCA-2) Antibody, 2371035, BioLegend) и конъюгированные с фикоэритрином антитела к внутриядерному белку ВИЧ-1 p-24 (Santa Cruz, sc-69728). Инкубировали 1 час при комнатной температуре в темном месте. Результаты оценивали при помощи метода проточной цитометрии FACS Canto II, используя программу FACS Diva (BD Biosciences).
Принцип работы основан на иммуномагнитном выделении клеток, с помощью иммуномагнитного сортера (Biotec). Биотин-конъюгированные моноклональные антитела прикрепляются к мононуклеарам, кроме пДК. Данные моноклональные антитела выступают в качестве основного агента маркировки, а анти-биотин моноклональные антитела, конъюгированные с микрошариками, в качестве вторичного агента маркировки. Магнитно-меченые не-пДК остаются на колонке MACS в магнитном поле. В то время, как немаркированные дендритные клетки проходят через колонку. От здорового донора было получено 10 мл гепаринизированной крови.
Методом седиментации в градиенте плотности фиколла 1,077 г/л (ПанЭко) были выделены МКПК. Клетки были подсчитаны при помощи камеры Горяева для последующего использования в магнитной сепарации. Использовался набор для магнитной сепарации фирмы MACS (Miltenyi Biotec I) Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit. Клетки были разведены в буфере. Буфер состоит из фосфатно солевого раствора с pH 7.2, 0.5% раствора BSA (бычий сывороточный альбумин) и 2 мM EDTA (от англ. ethylenediaminetetraacetic acid). Раствор необходимо держать на льду при температуре 4С во время всего проведения эксперимента. Клетки были подсчитаны в камере Горяева. После этого клетки центрифугировали при 300g 10 минут, весь супернатант удаляли. Осадок был разведен в 400 мкл буфера. Затем добавили 100 мкл PDC Biotin-Antibody Cocktail, аккуратно ресуспензировали и инкубировали в холодильнике в течение 10 минут. После этого промывали клетки, добавляя 10 мл раствора-буфера, центрифугируя при 300g в течение 10 минут. Супернатант удаляли и промывали еще раз. Далее клеточный осадок разводили в 400 мкл буфера и добавляли 100 мкл Anti-Biotin MicroBeads. Инкубировали 15 минут в холодильнике. Промыли клетки как описано выше. Клеточный осадок ресуспензировали и вносили в магнитную колонку. После магнитной сепарации, отфильтрованные клетки центрифугировали и производили подсчет в камере Горяева. Данные клетки представляли собой плазмоцитоидные дендритные клетки, содержащие поверхностный маркер CD303.
Процедуру забора материала проводили на базе ГАУЗ РКИБ РТ им. Проф. А.Ф. Агафонова в отделении гастроскопии, совместно с заведующей отделением согласно протоколу проведения фиброгастродуоденоскопии (ФГДС) (Wies Langenberg, 1990,). У всех больных было взято добровольное согласие на проведение процедуры. У 6 пациентов с диагнозом ВИЧ-инфекция и 6 пациентов из контрольной группы бла проведена ФГДС, с последующей прижизненной биопсией двенадцатиперстной кишки. Материал помещали в 30% раствор сахарозы для последующего проведения иммуногистохимического анализа. Информированное согласие было получено от каждого участника исследования в соответствии с протоколом (статья 20 Федерального закона "О праве граждан об охране здоровья Российской Федерации" N323- ФЗ, 11.21.2011)
Выделение плазмоцитоидных дендритных клеток методом отрицательной магнитной сепарации
Дендритные клетки (ДК) играют важную роль в иммунологическом распознавании вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Различают две основные популяции ДК: миелоидные и плазмоцитарные. Важно отметить, что эти две популяции ДК отличаются между собой по механизму распознавания антигена и презентации его эффекторным клеткам. Например, если миелоидные ДК (мДК) после распознавания антигена мигрируют в лимфатический узел, где представляют антиген активированным лимфоцитам, то плазмоцитарные ДК (пДК) процессируют и представляют антиген в инфекционном очаге и не мигрируют в региональные лимфатические узлы (Groot, van Capel et al. 2006). Однако, было показано, что ВИЧ способен использовать ДК для поддержания вирусной репликации. Так например, работа Катрин Джонс и коллег показала, пДК могут служить резервуаром для ВИЧ in vitro (Kathryn S Jones 2011). Незрелые ДК после встречи с инфекционными агентами и микроорганизмами становятся активированными и мигрируют в лимфатические узлы, где стимулируют нативные Th клетки (Tel, Smits et al. 2012). Бин Су и соавторами было показано, что ВИЧ-инфицированные пДК, при ко-культивировании с активированными Т-клетками человека, способны передавать вирус ВИЧ Т-лимфоцитам in vitro. Этими же авторами был подтвержден факт, что пДК инфицируются вирусом значительно выше в присутствии CD4 Т-клеток, по сравнению с отдельным культивированием пДК с вирусом Эти данные свидетельствуют о роли пДК в патогенезе ВИЧ-инфекции не только как переносчика инфекции, но и поддержании постоянного резервуара вируса в организме. Кроме того наши исследования так же показали, что клетки пДК человека чувствительны к заражению ВИЧ in vitro. Нами было показано, что после инкубации мононуклеарных клеток периферической крови от здорового донора с ВИЧ in vitro, процент инфицированных пДК составил 98,28%, что подтверждает приоритетное инфицирование пДК вирусом.
Циркулирующие пДК составляют около 0,5% всех лейкоцитов в крови здорового человека. Кроме того, существует фракция пДК расположенных преимущественно в лимфоидной ткани желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей (Lombardi and Khaiboullina ; de Heer, Hammad et al. 2004; Kingham, Chaudhry et al. 2007). Во время воспалительных процессов количество пДК обычно значительно увеличивается (Bromley, Iaboni et al. 2001; Kapsenberg 2003). Активированные пДК способны высвобождать провоспалительные цитокины (Sabado, O Brien et al.). Однако, при различных патологических состояниях пДК способны мигрировать в пораженные ткани. Например, было показано увеличение миграции пДК в кожу у больных СКВ (Chan, Nie et al.). Так же увеличение количества пДК в кишечнике у больных с синодромом хронической усталости . Интересно, что увеличение тканевой фракции пДК сопровождается снижением количества этих клеток в циркулирующей крови. Измененное распределение пДК у ВИЧ-инфицрированных животных было показано Маллере с соавторами (Malleret, Maneglier et al. 2008). Эти данные получили дальнейшее подтверждение в исследованиях Брауна с соавторами, которые наблюдали быстрое снижение циркулирующих пДК, этот факт подтверждает их миграцию в лимфатические узлы (Brown, Wijewardana et al. 2009). Уменьшение количества циркулирующих пДК было так же показано у больных ВИЧ. (Sabado, O Brien et al. ; Schmidt, Scott et al. 2004; Schmidt, Fujimura et al. 2006). Было высказано несколько гипотез, объясняющих снижение количества циркулирующих пДК при ВИЧ-инфекции, включая возможность цитопатического эффекта вируса на пДК, а так же возможное перераспределение пДК в ткани (Yamakami, Honda et al. 2004; Mullerrutwin and Hosmalin 2005; Mavilio, Lombardo et al. 2006; Swiecki, Gilfillan et al. 2010). Нами были проведены исследования по выяснению распределения пДК в организме ВИЧ 73 инфицированных больных. В диссертационной работе отражены данные о том, что в крови пациентов с ВИЧ-инфекцией количество циркулирующих пДК в 2 раза меньше, чем в контрольной группе. Эти данные подтверждают данные, полученные другими исследователями. Более того, нами было показано, что снижение циркулирующих пДК связано с их перераспределением в ткани ЖКТ. Так с помощью метода иммуногистохимии нами было выявлено, 6 кратное увеличение количества пДК увеличено в слизистой двенадцатиперстной кишки у ВИЧ-инфицированных лиц по сравнению с контролем. Интересно, что наши данные совпадают с результатами, полученными при исследовании распределения пДК при вирусе иммунодефицита обезьян. Известно, что пДК инфильтрируют колоректальную область ЖКТ у макак-резусов, инфицированных ВИО в остром периоде заболевания (Kwa, Kannanganat et al.). Схожие результаты были показаны Ривзом с коллегами, где сообщалось о повышенном накоплении пДК слизистой кишечника у обезьян с ВИО (Reeves, Evans et al.). Кроме того, Ли и коллеги наблюдали четырехкратное увеличение пДК в лимфатических узлах тонкого и толстого кишечника макак-резусов, инфицированных вирусом ВИО (Liu and Berkhout). Миграция CD4+ лимфоцитов в ткань объясняется повышением экспрессии хоуминг-рецептора CD103 (Reeves, Evans et al.). Таким образом, нами было показано перераспределение пДК в организме ВИЧ-инфицированных пациентов. Наши данные совпадают с опубликованными результатами, полученными на модели инфекции у животных. (Bruel, Dupuy et al. 2014). Но еще не было показано, какой фенотип могут иметь пДК мигрировавшие в слизистую пДК ВИЧ-инфицированного больного.
Во время хронической стадии ВИЧ-инфекции, пДК уменьшают продукцию ИНФ (Tilton, Manion et al. 2008). пДК из костного мозга не могут производить ИНФ I типа, так же как зрелые пДК. Они имеют фенотип, отличный от зрелых циркулирующих пДК, который зависит от стадии их дифференцировки (Martin-Martin, Almeida et al. 2009). В связи с этим фактом, было исследовано на каких стадиях дифференцировки могут находиться пДК в организме больного ВИЧ-инфекцией.
Различают три стадии развития и дифференцировки пДК. На всех стадиях развития пДК экспрессируют маркер CD123 . Этот маркер является рецептором для ИЛ - 3, который служит ростовым фактором для пДК (Fonteneau, Larsson et al. 2004). Кроме того, экспрессия маркера CD184 (CXCR4) обнаружена на всех трех этапах развития пДК. Однако экспрессия других маркеров изменяется в зависимости от стадии дифференцировки. Так например, экспрессия CD4 отсутствует у пДК, находящихся на 1 стадии дифференцировки. Однако, на поздних стадиях пДК, характеризуется экспрессией CD4, стадия II, III (Martin-Martin, Almeida et al. 2009). Известно, что ВИЧ использует CD4 и СD 184 для проникновения в клетку-мишень. Поэтому можно сделать заключение, что пДК могут быть мишенью для ВИЧ и инфицирование возможно через связывание с CD184 и CD4 рецепторами этих клеток. Наши результаты по инфицированию лейкоцитов человека подтверждают это предположение. Поскольку экспрессия CD184 и CD4 рецеторов обнаруживается начиная со II стадии дифференцировки, возможно, что инфицирование пДК происходит на поздних стадиях развития этих клеток.
В диссертационной работе было показано, что пДК в двенадцатиперстной кишке экспрессируют маркер Ki-67, который отсутствует у пДК в контрольной группе. Интересно, что эти результаты соответствуют данным, полученным у макак циномолгус, зараженных ВИО, где пДК, находящиеся в ЖКТ экспрессируют клеточный маркер пролиферации Ki-67 (Bruel, Dupuy et al. 2014). Однако нами, впервые была показана экспрессия Ki-67 у пДК у человека. Известно, что пДК в крови не делятся, а клетки в ЖКТ у обезьян, возможно являются предшественниками из костного мозга. Экспрессия белка Ki-67 связана с пролиферацией клеток.
Плазмоцитоидные дендритные клетки в двенадцатиперстной кишке у ВИЧ-инфицированных пациентов
Прогрессирование ВИЧ-1 связанно с патологией ЖКТ и повреждением ткани кишечника, что ведет к увеличению проницаемости эпителия кишечника и является отличительной чертой ВИЧ-инфекции (Stiksrud, Nowak et al.). Показано, что процесс повреждения целостности эпителиального покрова остается необратимым даже после длительной антиретровирусной терапии (Mehandru, Poles et al. 2004; Guadalupe, Sankaran et al. 2006; Chun, Nickle et al. 2008). Обнаруженная нами экспрессия гранзима B в клетках пДК кишечника ВИЧ-инфицированных больных, позволяет по новому объяснить повреждение эпителия кишечника. Известно, что гранзим В связывается с клеткой-мишенью вызывая апоптоз. (Ullrich, Zeitz et al. 1992; Dandekar 2007; Sankaran, George et al. 2008). Ранее не было описано, что у больных ВИЧ-инфекцией в пДК в лимфоидной ткани ЖКТ происходит повышение экспрессии гранзима B и снижение уровня экспрессии маркера CD123. В связи с тем, что активированные цитотоксические T-лимфоциты экспрессуирют маркер CD56, было проведено исследование по обнаружению данного маркера среди пДК (Kumar, Perdomo et al.).
Оказалось, что большинство пДК клеток также экспрессируют CD56 (NCAM 1-нейрональная молекула клеточной адгезии), данное наблюдение хорошо согласуется с предыдущими работами, в которых описано, что в пДК, активированных вакциной к вирусу клещевого энцефалита, наблюдается ко-экспрессия маркеров CD303, CD56, и гранзима B. (Tel, Smits et al. 2012).
Нами впервые показано перераспределение пДК из крови у ВИЧ-инфицированных больных в слизистую кишечника. Однако, наши исследования так же показали, что заражение ВИЧ in vitro вызывает апоптоз пДК. Поэтому в завершении проведенных нами исследований, была предпринята попытка изучить механизм гибели пДК клеток при ВИЧ-инфекции in vitro. Апоптоз играет ведущую роль в поддержании постоянства численности клеток организма и их соотношения, а так же удаление генетически-дефектных клеток. (А.А.Яриллин 2010). Инфицированные CD4 позитивные клетки теряют способность к пролиферации in vitro и подвергаются запрограммированной гибели в ответ на определенные раздражители. В настоящее время апоптоз является ведущим фактором снижения численности CD4 позитивных клеток при ВИЧ-инфекции (Ameisen, Groux et al. 1992). Во время апоптоза клетки высвобождают фосфатилидсерин на клеточной поверхности. Аннексин V, являющийся фосфолипид-связывающим протеином, в присутствии ионов кальция селективно, с высокой аффинностью, связывает фосфатидилсерин. Он проявляет очень низкую аффинность к таким фракциям фосфолипидов, как фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин и фосфатидилхолин. При помощи набора Annexin-V FITC/PI (Sigma), в данной работе показано, что под действием ВИЧ инфекции снижение пДК в крови так же обусловлено явлениями апоптоза на поздней стадии, когда происходит деградация ДНК. Поскольку при некрозе происходит нарушение целостности мембраны, что может послужить причиной попадания меченного Annexin V внутрь клетки, то двойном окрашивании с красителем PI можно проследить три пула клеток. Annexin V–/PI– (живые), Annexin V+/PI– (раннеапоптотические) и Annexin V+/PI+ (некротические и позднеапоптотические) (С. В. Глушен и др., 2009). Начальная фаза апоптоза включает активацию bsl-2 белка и деполяризацию митохондрий, этот процесс происходит достаточно интенсивно и в короткие сроки, как правило, от 30 минут до нескольких часов. Поздняя фаза апоптоза, после активации каспаз и образования апоптотических телец может занять от 4 до 48 часов (R. Nardacci et al., 2015). В данной диссертационной работе было in vitro, результаты фиксировали после 120 часов инкубации с ВИЧ, тем самым были продемонстрированы некротические и позднеапоптотические изменения в МКПК человека.
В работе исследована способность ВИЧ-1 инфицировать плазмоцитоидные дендритные клетки в мононуклеарной фракции здорового донора в условиях in vitro. По данным проточной цитометрии процент клеток, экспрессирующих видоспецифичный антиген ВИЧ p-24 составил более 98%. Этот факт может свидетельствовать о преимущественном инфицировании пДК в начале заболевания ВИЧ.
Ранее в литературе были описаны гистологические изменения в слизистой желудочного-кишечного тракта у обезьян, зараженных вирусом иммунодефицита обезьян (Evans, Li et al. ; He, Brocca-Cofano et al. ; Xu, Wang et al.). Однако, таких исследований у человека не проводилось. В данной работе впервые показано, что у больных ВИЧ-инфекцией в периферической крови обнаружено статистически значимое снижение количества плазмоцитоидных дендритных клеток, в то время как в слизистой двенадцатиперстной кишки происходит их статистически значимое увеличение. По сравнению с контролем этот показатель увеличился в 6 раз. Больные, кровь которых была исследована на присутствие плазмоцитоидных дендритных клеток, находились на разных стадиях заболевания и в разные периоды приема антиретровирусной терапии. Уровень пДК у больных коррелирует с уровнем иммунодефицитного состояния, а так же c вирусной нагрузкой.
При проведении иммуногистохимического анализа биопсийного материала больных ВИЧ, гистологические срезы были окрашены на различные маркеры, такие как CD303, CD80, CD123, Ki-67, CD56, CD4, Гранзим B и CD11c. В работе был изучен материал от 6 ВИЧ-инфицированных больных, не принимавших антиретровирусную терапию. Увеличение экспрессии маркера плазмоцитоидных дендритных клеток CD303 было в 6 раз. В частности маркер активации Т-лимфоцитов CD80 присутствовал у больных ВИЧ-инфекцией, но наблюдалось его отсутствие в контрольной группе. Однако, опираясь на факт выработки дендритными клетками ИЛ-3, не было обнаружено предполагаемой экспрессии CD123 в биоматериале от ВИЧ-инфицированных лиц. Так же выявлено наличие в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки больных ВИЧ цитотоксического фермента гранзима B, который активирует внутриклеточный каскад каспаз, приводящий к апоптозу, а так же играет роль в повышении проницаемости слизистой оболочки при ВИЧ-инфекции. В свою очередь гранзим В активирует выработку гликопротеина CD56 на лимфоцитах осуществляющих лизис клеток-мишеней, в частности натуральных киллеров.
В диссертационной работе был произведен анализ механизма гибели клеток, зараженных ВИЧ, непосредственно мононоуклеарные клеток в совокупности с дендритными клетками крови in vitro. В культуре клеток выявлены апонекротические изменения. Таким образом, можно предположить, что пДК истощаются в крови не только в результате перераспределения в ткань желудочно-кишечного тракта у больных ВИЧ-инфекцией, но и в результате запущенного инфекцией механизмов апоптоза.