Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структурно-функциональная организация головного мозга белой крысы в норме и после ишемии (состояние проблемы) 11
1.1 Анатомо-гистологические принципы организации экранных и ядерных центров головного мозга 11
1.2 Современные представления о механизмах повреждения и восстановления нервной ткани головного мозга после ишемии 23
1.3 Морфологические проявления повреждения и восстановления нервной ткани головного мозга белой крысы в постишемическом периоде 44
1.4 Феномен селективного повреждения нейронов головного мозга млекопитающих при ишемии 55
Глава 2. Материал и методы исследования 63
2.1 Дизайн исследования 63
2.2 Объект и предмет исследования 65
2.3 Методы исследования 69
2.4 Статистический анализ 76
Глава 3. Новый подход к количественной оценке структурно-функционального состояния нервной ткани головного мозга белых крыс 78
Глава 4. Гистологическое изучение экранных и ядерных центров головного мозга белых крыс в контроле и постишемическом периоде 85
4.1 Отделы с экранным типом распределения нейронов 85
4.1.1 Неокортекс 85
4.1.2 Гиппокамп 102
4.2 Отделы с ядерным типом распределения нейронов 113
Глава 5. Иммуногистохимическое изучение экранных и ядерных центров головного мозга белых крыс в контроле и постишемическом периоде 121
5.1 Межнейронные взаимоотношения 121
5.2 Глиальные сети 132
5.3 Пролиферативная активность 138
5.4 Апоптоз 141
5.5 Нейроглиальные взаимоотношения 142
Глава 6. Ультраструктура экранных и ядерных центров головного мозга белой крысы в контроле и постишемическом периоде 149
6.1 Ультраструктура нервной ткани в контроле 149
6.1.1 Неокортекс 149
6.1.2 Гиппокамп 160
6.1.3 Миндалевидное тело 168
6.2 Ультраструктура нервной ткани в постишемическом периоде 180
6.2.1 Нейроны 180
6.2.2 Межнейронные синапсы 194
6.2.3 Нейроглия 201
6.2.4 Нейро-глио-сосудистые микроструктурные комплексы 208
Глава 7. Обсуждение полученных результатов 216
Выводы 231
Список литературы 233
- Современные представления о механизмах повреждения и восстановления нервной ткани головного мозга после ишемии
- Новый подход к количественной оценке структурно-функционального состояния нервной ткани головного мозга белых крыс
- Отделы с ядерным типом распределения нейронов
- Нейроны
Современные представления о механизмах повреждения и восстановления нервной ткани головного мозга после ишемии
Основные механизмы ишемического повреждения головного мозга хорошо изучены и представлены в многочисленных современных обзорах [Шляхто Е.В. и др., 2012; Lipton P., 1999; Janardhan V., Qureshi A.I., 2004; Doyle K.P. et al., 2008; Chavez J.C. et al., 2009; Hagberg H. et al., 2009; Ferriero D.M., Miller S.P., 2010; Niizuma K. et al., 2010; Pandya R.S. et al., 2011; Schweizer S. et al., 2013; Shichita T. et al., 2014; Granger D.N., Kvietys P.R., 2015; Kawabori M., Yenari M.A., 2015; Cuartero M.I., et al., 2016; Quillinan N. et al., 2016; Thornton C. et al., 2017].
Анализ этих работ позволил выделить основные механизмы и создать принципиальную схему патогенеза ишемического повреждения клеток головного мозга (схема 1). После ишемии формируется комплексный нейротоксический каскад, включающий в себя: 1) истощение энергетических хранилищ; 2) деполяризацию мембран; 3) выделение глутамата; 4) увеличение концентрации внутриклеточного кальция; 5) генерацию свободных радикалов кислорода; 6) стимуляцию катаболических ферментных систем (фосфолипаз, протеаз и эндонуклеаз); 7) активацию механизмов некроза и апоптоза; 8) индукцию воспаления [Евсеева М.А. и др., 2008; Иванов К.П., 2012; Janardhan V., Qureshi A.I., 2004; Doyle K.P. et al., 2008; Fernndez-Lpez D. et al., 2014; Tobin M.K. et al., 2014; Granger D.N., Kvietys P.R., 2015; Cuartero M.I. et al., 2016; Hirst J., Roessler M.M., 2016].
Метаболический ацидоз возникает на фоне истощения энергетических хранилищ и дисфункции митохондрий во время и после ишемии в результате накопления лактата [Blomgren K. et al., 2003; Borutaite V., 2010; Jordan J. et al., 2011; Kalogeris T. et al., 2014; Granger D.N., Kvietys P.R., 2015; Hirst J., Roessler M.M., 2016; Wirth C. et al., 2016].
Настоящее время хорошо изучены структурно-функциональные комплексы митохондрий, играющие ключевую роль в энергообеспечение нейронов [Chen S.D. et al., 2011; Fernndez-Lpez D. et al., 2014; Kalogeris T. et al., 2014; Hirst J., Roessler M.M., 2015; Hirst J., Roessler M.M., 2016; Lenaz G. et al., 2016; Wirth C. et al., 2016].
В очаге инсульта признаки наличия гипоксической деполяризации, оксидативного стресса, эксайтотоксичности, активации генов раннего ответа появляются в течение часа после начала ишемии и сохраняются до 10–12 часов. Активация транскрипционных факторов – от 1 часа до 4 сут, белков теплового шока – от 1 часа до 1 сут, цитокинов – от 1,5 часов до 4 сут. Необратимые повреждения митохондрий начинаются через 30–60 мин и выявляются в течение 1-х сут, проявления стресса эндоплазматической сети – от 2 часов до 3 сут. Воспалительные изменения – от 3 часов до 4–5 сут, реакция астроцитов – от 4–5 часов до 6–7 сут, глиоз – от 3–4 сут до 10 сут, ангиогенез – от 4 сут до 10–14 сут [Острова И.В. и др., 2007; Busch H-J. et al., 2003; Arundine M., Tymianski M., 2004; Chavez J.C. et al., 2009; Chen H. et al., 2011; Naranjo D. et al., 2013; Shichita T. et al., 2014; Zhang J. et al., 2015; Zhao M. et al., 2016].
Необратимая гибель нейронов при ишемии и период реперфузии происходит в результате кальций-зависимого включения различных путей и программ клеточной смерти: процессов некроза, апоптоза и фагоцитоза [Zeng Y.S. et al., 2000; Bursch W., 2004; Janardhan V., Qureshi A.I., 2004; Muller G.J. et al., 2004; Zille M. et al., 2012; Naranjo D. et al., 2013; Tobin M.K. et al., 2014; Granger D.N., Kvietys P.R., 2015; Hu Z. et al., 2015; Zhang J. et al., 2015; Quillinan N. et al., 2016; Thornton C. et al., 2017].
Следует отметить, что митохондриальная дисфункция вызывает фатальный каскад, приводящий к аксональному повреждению (отек аксонов, распад элементов цитоскелета) и апоптозу [Rugarli E.I., Langer T., 2012].
Механизмы эксайтотоксичности реализуются в глиальных клетках [Matute C. et al., 2002]. Аутофагия имеет решающее значение для поддержания нейронального гомеостаза и действует как локальный процесс «уборки», так как нейроны требуют эффективной деградации белка для предотвращения накопления токсичных агрегатов [Uchiyama Y. et al., 2008]. Дисфункция процесса аутофагии, что может быть в постишемическом периоде, вызывает накопление аномальных белков и/или поврежденных органелл. Такое накопление связано с синаптической дисфункцией, клеточным стрессом и нейрональной смертью. Аномальная аутофагия может быть при хронических нарушениях нервной системы (болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона), так при острых ишемических повреждениях мозга. В целом аутофагия полезна, но ее высокая активация может приводить к аутофагической нейрональной смерти [Larsen K.E., Sulzer D., 2002; Rami A., 2009; Xilouri M., Stefanis L., 2010].
Аутофагия рассматривается как внутриклеточная система массовой деградации самых долгоживущих белков и клеточных органелл. Цитоплазматические составляющие, включая органеллы, секвестрируются в двойные мембранные аутофагосомы, которые впоследствии смешиваются с лизосомами, где подвергаются деструкции. Аутофагия имеет место при различных физиологических процессах, включая транспорт белка и органелл, стресс-реакции, клеточной дифференциации, запрограммированной смерти клеток и патологических состояниях [Uchiyama Y. et al., 2008].
Аутофагия занимает решающее место в метаболизме клетки, может обеспечить нейропротекторный механизм, спровоцировать апоптоз и некроз клеток. Следовательно, аутофагия, с одной стороны, обеспечивает выживания нейронов, а с другой стороны может быть частью запрограммированной клеточной смерти. Недостаточный аутофагического ответа может сделать нейроны более восприимчивыми к стрессовым воздействиям, а длительная активация может привести к полному «самоперевариванию» клетки [Rami A., Kgel D., 2008; Rami A., 2009; Wang Y. et al., 2016].
В последнее время установлено, что для выживания нейронов в постишемическом периоде большое значение имеет процесс, названный митофагией, – селективная деградация поврежденных митохондрий. Удаление поврежденных митохондрий препятствует активации митохондриального пути апоптоза. Ключевыми белками митофагии являются PINK1/Parkin, Bnip3, Nix, Fundc1 [Yuan Y. et al., 2015].
Таким образом, ишемия и в особенности реперфузия запускают процесс программируемой гибели нейронов — апоптоз, механизмы которого на сегодняшний день достаточно хорошо изучены. Однако, параллельно и, особенно, при прекондиционировании головного мозга запускаются многочисленные процессы, препятствующие апоптозу, которые могут быть связаны с активацией рецепторов, внутриклеточных киназных каскадов, транскрипционных факторов, определенных митохондриальных белков и ядерных эффекторов [Шляхто Е.В. и др., 2012]. Все это свидетельствует о едином комплексе взаимосвязанных механизмов повреждения и защиты в головном мозге в период реперфузии. Следует отметить, что гипоксическое прекондиционирование становится одним из самых изучаемых и перспективных направлений немедикаментозной защиты головного мозга от острой ишемии [Baillieul S. et al., 2017].
Некроз. Процесс, обусловленный прекращением циркуляции крови в сосудах головного мозга. Некроз может быть коагуляционным и колликвационным. Некрозу предшествует быстрый или длительный период умирания (некробиоз). В этот период в нейронах развиваются изменения, представляющие собой тот или иной вид дистрофии (гидропическая, белковая). Функции нейронов при этом ослабевают и прекращаются, но на начальных этапах процесса они могут восстановиться, если ликвидирована причина некробиоза. Если же причина продолжает действовать, дистрофия становится необратимой, некробиоз переходит в некроз и функции нейрона прекращаются. Некротизированные ткани под действием гидролитических ферментов подвергаются разложению – аутолизу. В области очага некроза развивается воспаление как ответная реакция организма на гибель его части [Chalmers-Redman R. M. et al., 1997; Семченко В.В. и др., 1999; Туманский В.А. и др., 2008; Шаврин В.А. и др., 2010; Fernndez-Lpez D. et al., 2014; Tobin M.K. et al., 2014; Lychko V.S. et al., 2015].
Микроскопические признаки некроза складываются из необратимых изменений ядер и цитоплазмы клеток. В период некробиоза клетки теряют воду, поэтому при некрозе ядра сморщиваются и уплотняются (кариопикноз), Затем нуклеиновые кислоты из ядра в цитоплазму клетки, происходит распад ядра (кариорексис), ядерное вещество растворяется (кариолизис). В цитоплазме развиваются плазморексис и плазмолиз, растворяется вся клетка (цитолиз) [Туманский В.А. и др., 2008; Chalmers-Redman R. M. et al., 1997; Zeng Y.S. et al., 2000; Muller G.J. et al., 2004; Zille M. et al., 2012; Lychko V.S. et al., 2015; Zhang J. et al., 2015].
До сих пор не решена проблема соотношения смерти клеток и появления «темных» нейронов – нет основания для связи темно окрашенных нейронов с гибелью клеток. Многие из них восстанавливаются до нормохромных. Поэтому судить о гибели нейронов можно только на основании сравнительного изучения общей численной плотности нейронов и плотности нормохромных нейронов в динамике постишемического периода [Hou S.T., Macmanus J.P., 2002; Zille M. et al., 2012]. Не решены методические проблемы подсчета гомогенных темных нейронов. При подсчете темных нейронов их численная плотность закономерно завышается. Это связано с невозможностью визуализации темных клеток по их ядрышкам (самый надежный метод оценки плотности клеток). Один темный нейрон без видимого ядрышка попадает в несколько (3–4) срезов [Weibel E.R., 1979]. Поэтому для сравнения количества нейронов в динамике постишемического периода более правильно проводить морфометрию только нормохромных нейронов.
Новый подход к количественной оценке структурно-функционального состояния нервной ткани головного мозга белых крыс
Количественную оценку структурно-функционального состояния нервной ткани головного мозга белых крыс осуществляли с использованием программы ImageJ 14.6. Исходные цифровые растровые изображения трансформировали в палитровые (уменьшение возможных вариантов оттенков до 256). Это существенно облегчало статистический анализ цифрового материала. В каждом из пикселей изображения хранился номер цвета в палитре — от 0 до 255. Устанавливались одинаковые для всех изображений значения цвета, яркости, контрастности, количественного распределения пикселей по цвету и яркости, плотность пикселей (300 на дюйм). Это позволяло создать стандартные условия для последующего выделения видимых структур нервной ткани (например, только ядра, цитоплазму или только нейропиль и межклеточное пространство) на гистограммах растровых изображений. Затем запускался апплет "Гистограмма", который создавал гистограмму, отражающую палитру и количественное распределение составляющих изображение пикселей.
На первом этапе получали гистограмму всего изображения. Как правило, использовались два объектива 10 и 40 (рисунок 6, 7). На рисунках видно, что гистограммы на разных увеличениях одного и того же участка головного мозга (кора) имели одну палитру и сходное распределение пикселей. При этом показатели моды (89 и 81) и среднего значения (105,5 и 109,9) статистически значимо не различались. Палитра не менялась и при программном увеличении фрагментов изображений до предельных размеров (уровень пикселя). Это имело большое значение, так как позволяло отдельно оценивать пиксельный состав структурных компонентов нервной ткани - осуществлялось своеобразное зондирование по выделенным точкам.
Таким образом, гистограмма полученная на первом этапе, содержала информацию о всех структурах изображения - нейронах (ядра и цитоплазма), глиальных, эндотелиальных клетках, клетках крови, крупных отростках нейронов (дендриты и аксоны), нейропиле (войлокообразная структура, включающая мелкие отростки и синапсы нейронов, отростки глиальных клеток), крови. На втором этапе (зондирования), при соответствующих увеличениях, получали гистограммы конкретных структур нервной ткани, например нейроны и нейропиль, ядра, ядрышки (рисунок 8 а, б).
Сравнение показывает, что полученные гистограммы статистически значимо различались по форме и по центральным тенденциям (среднее, мода) и разбросу значений (стандартное отклонение). Цифровые представления гистограмм в виде электронных таблиц распределения частот помещались в приложения Excel и Statistica 8.0 для дальнейшей статистической обработки и сравнения препаратов контрольной и основной группы (до и после ишемии).
В норме, когда нет контрастных однородных патологически измененных структур (например, темных сморщенных нейронов), оценка тинкториальных свойств неровной ткани по палитре изображения количественно позволяет оценить только площадь конденсированного хроматина в ядрах. То есть, корректно разделить базофильные и эозинофильные структуры. Определить площадь и плотность нормохромных нейронов, площадь нейропиля по гистограммам нельзя, так как изображения этих структур имели одинаковые характеристики части пикселей (происходило наложение зон нейронов и нейропиля на гистограмме) (рисунок 8а, б). Появление после ишемии контрастных однородных патологически измененных темных нейронов (рисунок 9а) позволяло определять их численную плотность, общую площадь и среднюю площадь тела на палитровых изображениях.
Статистический анализ гистограмм показал, что тела гиперхромных (темных) нейронов на рисунке 1а занимали 3,0%, 88,0% - нейропиль, а все остальные структуры - 9,0%.
Таким образом, в норме гистограммы цветных палитровых изображений нервной ткани коры головного мозга при окраске гематоксилином и эозином имели нормальное распределение, а зоны соответствующие нейронам и нейропилю, значительно накладывались друг на друга. Это не позволяло только по анализу гистограммы изображения автоматически определить площадь всех нейронов. При ишемических изменениях распределение пикселей в гистограмме отличалось от нормального, становилось асимметричным, появлялись эксцессы (рисунок 9б, в, г), что позволяло точно выделить зону темного нейрона на гистограмме и анализировать ее. Программа ImageJ 1.46 давала возможность автоматически оценить параметры изучаемых структур (в частности, плотность клеток, их площадь) другим путем - на бинарных масках изображений. Можно рассчитать размеры, площадь (исключить структуры меньше и больше заданных), численную плотность всех клеток и только нейронов (при высокой степени циркулярности на масках отражались только овальные ядра глии, эндотелиальных клеток, при низкой - только круглые ядра нормально функционирующих нейронов) [Мыцик А.В. и др., 2012].
Для сравнения результатов применения первого (по гистограмме реального цветного изображения) и второго (бинарное изображение) способа использовали пример рисунка 9а. Проводились следующие действия. Для визуального контроля создавалась маска клеток на бинарном варианте исходного изображения, устанавливались параметры включения и исключения объектов (рисунок 10б). После выполнения апплета "Analyze particles" формировалась таблица, содержащая данные о количестве объектов, их площади, периметре, длине, ширине каждой частицы, общей площади поля, на котором производился подсчет. При однотипных изображениях последовательность действий записывалась в макрос и их можно было обрабатывать пакетом [Мыцик А.В. и др., 2012].
Сравниваемые способы дали одинаковые результаты - тела гиперхромных нейронов занимали 3,0 и 3,1% поля зрения соответственно. Тем не менее, для определения численной плотности нормохромных нейронов лучше использовать препараты, окрашенные по Нисслю. При этой окраске клетки выявлялись более контрастно на фоне бледного межклеточного пространства (рисунок 11а). А также применять апплет "Cell Counter" или дополнительно усиливать контраст нормохромных нейронов для визуального контроля и последующего автоматического подсчета количества клеток (рисунок 11б).
Изображения, полученные исходно в формате tif (RGB цвет, размер изображения 2048х1536 пикселей, разрешение 300 пикселей на дюйм) можно было трансформировать в 8-битные цветные (палитровый, градиент оттенков 0-255), 8-битные черно-белые (градации серого 0-255) и 2-битные (черно-белые маски) изображения. Далее задаются параметры отсечения (пороги размеров частиц) и на изображении остаются только нормохромные нейроны, определяемые по наличию ядрышка. Для морфометрического анализа во всех случаях определяли численную плотность нормохромных нейронов со срезом на уровне ядрышка. Содержание темных нейронов оценивали по доли (%) площади их срезов в поле зрения. Например, в неокортексе в норме этот показатель составлял 0,5% (95% ДИ: 0,001-4,6%, n=100), а после ишемии увеличивался до 3,1% (95% ДИ: 0,7-8,8%, n=100, рисунок 9 и 10).
Отделы с ядерным типом распределения нейронов
Большое значение имеют данные морфометрического анализа о том, что в постишемическом периоде, по сравнению с контролем, в поле СА1 не было выявлено изменения размеров ядер, но отмечалось статистически значимое снижение показателей ЯЦО сохранившихся нормохромных пирамидных нейронов (рисунок 26): через 1 сут - до 1,3 (1,2-2,0), 3 сут - до 1,5 (0,80-1,9) и через 30 сут - до 1,8 (1,4-2,3); в контроле - 2,7 (2,5-2,9). Это, вероятно, свидетельствовало в пользу компенсаторной гипертрофии цитоплазмы активно функционирующих нормохромных нейронов - повышение метаболической активности нейронов для перестройки нейронных сетей.
Таким образом, после острой ишемии, вызванной 20-минутной ООСА, в гиппокампе, наряду с необратимой деструкцией нейронов, активировались защитно-адаптивные механизмы, позволяющие предотвратить или задержать развитие нейродегенеративных процессов. 4.2 Отделы с ядерным типом распределения нейронов
Миндалевидное тело (МТ, миндалина, amigdala) является сложным многоядерным центром головного мозга, расположенным под височной корой (рисунок 32а).
МТ является гетероморфным образованием палеокортекса, состоящим из различных мелко-, средне- и крупноклеточных ядер (рисунок 32б). В контроле в них выявляются «нормохромные» (цитохромные), «темные» и «светлые» нейроны. Крупноклеточные ядра МТ состояли из нормохромных нейронов, а мелкоклеточные – из кариохромных и светлых нейронов. Нормохромные нейроны крупнее «темных» и «светлых» нейронов, имели богатое эухроматином клеточное ядро, упорядоченное расположение элементов гранулярной эндоплазматической сети – классические нейроны (рисунок 33б, таблица 10).
По своим основным характеристикам перикарионы этих крупных мультиполярных клеток похожи на крупные пирамидные нейроны неокортекса (рисунок 33б). Однако для мультиполяных нейронов МТ не характерно наличие крупного апикального дендрита, все отростки имели примерно одинаковый диаметр. Площадь перикариона мультиполярных клеток была выше, чем самых крупных пирамидных клеток неокортекса (моторная кора): 556,9 (512,4-578,5) и 504,2 (448,5-554,3) мкм2 соответственно за счет цитоплазмы. Соответственно отличалось ЯЦО. ОЧПН была выше в неокортексе (таблица 6 и 10).
Средние нормохромные нейроны ядер МТ имели близкие характеристики с нейронами слоя III неокортекса. Однако, в МТ плотность этих клеток была статистически значимо выше на 18,6% (таблица 6 и 10). Основные морфометрические характеристики крупных и средних нормохромных нейронов МТ статистически значимо различались (таблица 10).
В постишемическом периоде в ядрах МТ появляются единичные и группы вакуолизированных нейронов, клетки тени, ишемические несморщенные и сморщенные (пикноморфные гомогенизированные и негомогенизированные) темные нейроны (рисунки 34–37).
Через 1 сут среди патологических превалировали нейроны с гидропическими изменениями, одиночные клетки-тени и несморщенные темные (рисунок 34).
Через 3 и 7 сут увеличивалось содержание сморщенных темных нейронов и нейронов в состоянии фагоцитоза, увеличивалось количество свободных и сателлитарных нейроцитов (рисунок 34, 35).
Через 14 сут отмечались очаговые проявления отека-набухания, глиальная реакция, высоким оставалось содержание сморщенных клеток, клетки-тени не выявлялись. Часто встречались картины фагоцитоза гиперхромных нейронов и нормохромные нейроны с сателлитами (рисунок 36).
Через 30 сут после ишемии сохранялось неутилизированные сморщенные нейроны, отмечались участки с низкой плотностью нейронов. Признаков гипертрофии не было выявлено (рисунок 37).
Морфометрический анализ проводили только для популяции нормохромных нейронов МТ. По данным морфометрического анализа, в течение 30 сут наблюдения необратимой деструкции подвергалось 15,1% средних по размеру перикариона нормохромных нейронов и 6,2% крупных нейронов (таблица 11).
Основная часть поврежденных нейронов подвергалась фагоцитозу, вероятно, в течении 7 сут после острой ишемии (таблица 11). Изменение ОЧПН сопровождалось сначала увеличением НГИ до 2,1 (через 7 сут, средние нейроны) и 2,8 (через 7 сут, средние нейроны), а затем – снижением этого показателя через 21, 30 сут (таблица 12).
Таким образом, после реперфузии в МТ увеличивалось содержание реактивно, дистрофически и некробиотически измененных нейронов. ОЧПН при этом в конце наблюдения (30 сут) уменьшалось незначительно – 15,1% средних и 6,2% крупных по размеру перикариона нейронов. Отмечалась выраженная реакция нейроглии – НГИ увеличивался соответственно на 23,8 и 14,3%.
Нейроны
В постишемическом периоде в нервной ткани головного мозга белых крыс выявлены изменения ультраструктуры всех ее компонентов - нейронов, их отростков, синапсов, глиальных клеток, а также микрососудов. Характер реактивных, деструктивных и компенсаторно-восстановительных изменений нейронов прежде всего зависел от периода после реперфузии - условно: острый (1-3 сут), ранний восстановительный (7-14 сут) и поздний восстановительный период (21-30 сут), а также отдела мозга и типа нейронов.
В остром постишемическом периоде (1 и 3 сут) выявлялись структурные изменения, связанные с нарушениями энергозависимых водно-электролитного и белкового обмена, приводящие к нарушениям коллоидно-осмотического давления в клетке и развитию цитотоксического отека-набухания. В наибольшей степени повреждались отростки фибриллярных астроцитов вокруг микрососудов, протоплазматических астроцитов и других структур нейропиля (синаптические терминали, мелкие дендриты). Гидропическая дистрофия также проявлялась значительными изменениями тел астроцитов (рисунок 86, 87 и 88).
Гидропическая дистрофия характеризовалась появлением в цитоплазме нейронов вакуолей, наполненных свободной жидкостью, жидкость также накапливалась в цистернах эндоплазматической сети и в митохондриях, реже в ядре клетки (рисунок 88а).
Дальнейшая «судьба» нейронов с нарушением водно-электролитного обмена и сопутствующим изменением коллоидно-осмотического давления в клетке была не однозначной и, вероятно, зависела от множества факторов, в частности, от состояния астроцитов (рисунок 88б).
В клетках с высокой степенью нарушения энергетического обмена (деструкция митохондрий) и проницаемости мембран отмечался распад их структур и активация высвободившихся гидролитических ферментов лизосом, которые разрывали внутримолекулярные связи с присоединением воды (рисунок 89а).
В постишемическом периоде, по тинкториальным свойствам и количеству красителя на единицу площади, выявлялось несколько типов клеток: нормохромные, гиперхромные (темные), гипохромные и клетки-тени (колликвационный некроз). Наиболее многочисленными и вариабельными были гиперхромные нейроны. Для них было характерно наличие электронноплотного ядра и цитоплазмы (рисунок 90, 91, 92, 95). В этой группе нейронов их функциональное состояние оценивали на основании сравнительного анализа показателей: 1) транскрипционной активности (гетеро- и эухроматин, РНП-частицы), 2) структурной организации ядрышка (размеры, форма, плотность, состав), 3) состояния ядерных мембран (инвагинации, поры, перинуклеолярное пространство), 4) белоксинтезирующего аппарата цитоплазмы (ГЭС), 5) энергетической системы (популяции митохондрий), 6) аппарата Гольджи и системы вакуолей. В постишемическом периоде выделялось несколько состояний гиперхромных нейронов: 1) состояние повышенной активности, 2) напряжения, 3) сниженной активности и 4) дегенеративные (необратимых) изменения (пикноморфные нейроны - коагуляционный некроз).
В раннем (остром и подостром) постишемическом периоде преобладали гиперхромные нейроны в состоянии сниженной активности и дегенеративных изменений (1, 3 сут), раннем (7, 14 сут) восстановительном периоде – в состоянии повышенной активности и напряжения, а в позднем (21, 30 сут) – в нормальном состоянии и состоянии повышенной активности. Мозаика распределения подобных нейронов существенно отличалась в экранных и ядерных нейронных скоплениях.
Снижение функциональной активности нейронов проявлялось: 1) уменьшением размеров ядра и ядрышка, 2) увеличением содержания гетерохроматина и отсутствием интерхроматиновых гранул, 3) выраженной осмиофилией кариоплазмы, 4) плотным ядрышком на периферии ядра около выраженного краевого хроматина, 5) неравномерно расширенным перинуклеарным пространством, 6) складками поверхности ядра, 7) многочисленными светлыми митохондриями с разрушением крист, 8) расширением канальцев эндоплазматической сети (рисунок 90). При этом подобные нейроны сохраняют неповрежденные аксосоматические синапсы (рисунок 90б).
По данным литературы, подобные нейроны расцениваются как клетки завершившие транскрипционные процессы, но имеющие высокую вероятность восстановления до нормального состояния [Jortner B.S., 2006].
Тяжелые ишемические повреждения нейронов через 1 и 3 сут после ишемии прогрессировали в кариоцитолизис или коагуляционный некроз нервных клеток (пикноморфные нейроны).
Для пикноморфных нейронов (рисунок 91) было характерно:
1) выраженная осмиофилия ядра и цитоплазмы,
2) уменьшение размеров тела за счет сморщивания,
3) выраженная деформация клеточного ядра, инвагинации,
4) массивные скопления гетерохроматина под внутренней ядерной мембраной,
5) фрагментация ядрышка и перемещение его частей к внутренней ядерной мембране,
6) суженное перинуклеарное пространство (в сравнении с другими гиперхромными нейронами),
7) увеличенные в размерах митохондрии со светлым матриксом и разрушением большей части крист,
8) узкие, часто плохо различимые канальцы эндоплазматической сети, между ними были расположены участки гомогенной цитоплазмы. По данным литературы, вероятность восстановления подобных клеток очень низкая [Jortner B.S., 2006].
Как правило, пикноморфные нейроны были окружены зоной отека-набухания астроцитарных отростков, а их окончательное формировании было, вероятно, связано с истощением у них и астроцитов защитного потенциала (рисунок 91).
Через 1 и 3 суток постишемического периода в поврежденном головном мозге из-за сходных ультраструктурных характеристик очень сложно дифференцировать коагуляционно-ишемический некроз нейронов и апоптоз.
Однако, для ишемического коагуляционного некроза нейронов такие ультраструктурные изменения, как набухание митохондрий, локальная коагуляция, гиперосмиофилия протеинов мембран, микротрубочек, крист митохондрий и цистерн эндоплазматической сети, конденсация хроматина ядра в плотные глыбки, увеличение в кариоплазме количества плотных перихроматиновых гранул, уплотнение агрегированного хроматина завершались в течение суток распадом РНП ядрышка и его дезинтеграцией. Параллельно от цистерн гранулярной эндоплазматической сети отделялись рибосомы, значительно расширялись цистерны оболочки вокруг ядра и эндоплазматической сети. Все это свидетельствовало о том, что в таких нейронах прекращались процессы биосинтеза – клетка погибала. Наступала необратимая денатурация белков цитозоля, которая завершалась их коагуляцией в стойкие, трудно расщепляемые неструктурированные соединения (рисунок 91).
Следует отметить, что при коагуляционном некрозе не выявлялось ультрацитохимических признаков активации лизосом (нет вторичных лизосом) (рисунок 91), а утилизация остатков нейронов происходила длительное время с привлечением фагоцитов. Отсутствие аутофагосом, в которых обычно разрушаются поврежденные органеллы (секвестры), свидетельствовало о необратимости ишемического повреждения нейронов.
В отличие от ишемически измененных темных нейронов, клеток с признаками апоптоза было очень мало. Наиболее надежным дифференциальным морфологическим признаком, отличающим ишемический коагуляционный некроз от апоптоза нейрона, в раннем постишемическом периоде являлось состояние ядрышка. При апоптозе в пикнотизированном ядре с гофрированными контурами ядрышко сохранность. При коагуляционном некрозе наблюдался глубокий пикноз ядра с разрушением ядрышка (рисунок 91).
Нами выявлены разнообразные ультраструктурные изменения, которые можно трактовать как проявления апоптоза: 1) конденсация ядерного хроматина, 2) фрагментация ядер, 3) конденсация цитоплазмы, 4) формирование в ней полостей (рисунок 92, 93, 94). Максимальное количество нейронов с признаками апоптоза выявлялись в остром постишемическом периоде.