Введение к работе
Актуальность проблемы. Мобильные элементы являются одной из наиболее интенсивно исследуемых областей организации и функционирования генома эукариот. Впервые информация о мобильных элементах появилась в работах по исследованию генетической нестабильности у кукурузы (McClintok, 1952). Молеку-лярно-генетически мобильные элементы исследуются с середины 70-х годов (Rubin et al.,1976; Georglev et al.,1977). В процессе этих исследований было установлено, что мобильными элементами являются последовательности ДНК, содержащие гены, экспрессия которых обеспечивает размножение этих последовательностей в геноме.
В настоящее время обнаружены и исследованы десятки мобильных элементов из различных, таксономических групп, включая микроорганизмы, животных и растения. Было обнаружено, что внедрением мобильных элементов вызвано большинство классических фенотипических мутаций Drosophila melanogaster, а также некоторые генетические болезни человека. В результате этих исследований произошли существенные изменения в представлениях о спонтанном мутагенезе. Существенно изменились представления и о стабильности генома. Было обнаружено, что в результате перемещения мобильных элементов может наблюдаться дестабилизация генома в виде гибридного дисгенеза, транспозиционных взрывов и микротранслокации.- Большая часть этой информации получена на D.melanogaster. При исследовании геномов других видов, таких как мышь и крыса, оказалось, что спектр мобильных элементов у различных видов сильно различается. Следовательно, одной из актуальных проблем исследования организации и функционирования генома эукариот в настоящее время является изучение мобильных элементов у разных видов.
Кроме того, до сих пор мало изучены происхождение, разнообразие и эволюция мобильных элементов. Полные нуклеотидные последовательности выявлены далеко не для всех известных мобильных элементов. Отсутствие такой информации существенно ограничивает понимание происхождения и эволюции мобильных элементов. По-видимому, решение этих проблей возможно при анализе информации о новых и ранее описанных мобильных элементах, обнаруженных' у видов из различных таксономических групп.
Использование хироноыид как экспериментальной модели для исследования мобильных элементов имеет ряд положительных аспектов:
-
Геномы хирономид представляют собой удобные объекты для молекулярно-цитологических исследований мобильных элементов, в первую очередь, в связи с тем, что в клетках некоторых тканей хирономид, в частности, в клетках слюнной железы расположены политенные хромосомы, наличие которых позволяет производить тонкую хромосомную локализацию изучаемых фрагментов ДНК в геноме.
-
Интенсивные работы в области .эволюционной цитогенетики хирономид являются существенным основанием для исследования эволюции мобильных элементов.
-
Наличие подвидов и видов-двойников в роде Chironoraus позволяет исследовать вопрос возможной взаимосвязи между дивергенцией видов и семейств мобильных элементов в геномах этих видов.
Следует также отметить, что у наиболее хорошо изученного среди хирономид вида - Chironoraus thtmroi - уже охарактеризовано 3 семейства мобильных элементов, относящихся к различным классам. Поэтому перспективным в плане описания разнообразия мобильных элементов хирономид в первую очередь является продолжение работы по исследованию новых мобильных элементов в геноме Chironoraus thunrai.
В продолжение' работ по молекулярно-цитологической характеристике мобильных элементов, проводимых в лаборатории клеточной биологии ИЦиГ, перспективными являлись исследования с использованием в качестве зондов клонов рС^2 и РС6.10" в результате исследования их нуклеотидных последовательностей только в клоне рС. о была обнаружена последовательность, по своей организации похожая на мобильный элемент, относящийся к группе транспозонов (Богачев и др., 1986). При этом полилокальная гибридизация этих клонов на политенных хромосомах ChironpmuB thuimii указывает на присутствие в обоих этих клонах последовательностей мобильных элементов.
Цель к задачи исследования. Целью настояшей работы, являлось обнаружение и характеристика новых мобильных элемен-, тов у хирономид. В задачу настоящей работы входило исследова-
ние мобильных элементов ChlronoimiB thunmi, содержащихся в клонах рС, 2 и pCg 10, и их полная характеристика. Второй задачей данной работы было исследование распространения в геномах других видов хирономид мобильных элементов, гомологичных выявленным нами. В работе решались следующие конкретные задачи: I.Скрининг геномной библиотеки ChlronoimiB thunmi на клоны
РС1.2яРСб.Ю-2.Молекулярно-цитологическая характеристика отобранных клонов.
3.Установление нуклеотидной последовательности мобильных
элементов и фланкирующих их последовательностей. 4.Сравнение установленных последовательностей с ранее
изученными. 5.Цитологический анализ распределения и Southern-blot анализ
структуры NLR1 мобильного элемента у видов двойников и
подвидов рода Спігопопшз.
Научная новизна работы. В процессе проведенного исследования было доказано, что ранее выявленная последовательность МЕС в геноме ChlronoimiB thunmi является дейстительно мобильным элементом. Впервые обнаружен и охарактеризован неизвестный ранее Non-LTR ретротранспозон NLRChl Chironomua thunmi и установлена его полная нуклеотидная последовательность.
Проведен анализ распределения NLR1 Ch-элемента в геномах 23 видов сем. Chironomidae. Впервые обнаружено, что этот мобильный элемент специфичен для видов рода ChironorauB. Максимальная его представленность обнаружена у вида, где он был обнаружен - Chironoimis thunmi, и близких ему видов: C.piger, C.dorsaliB.
Изучен межвидовой полиморфизм длин рестрикционных фрагментов NLR1Ch-элемента у видов-двойников группы рішювив и подвидов С.thunmi, C.piger. На основании этих данных установлено, что у видов рода Chironoimis присутствуют как минимум 3 различных по структуре семейства Лоп-LTR ретротранспозонов.
Научно-практическое значение. Полученные в работе данные подтверждают факт широкого распространения мобильных элементов разных типов в геномах эукариот и вносят вклад в понимание процессов дивергенции и распространения мобильных элементов. В структуре впервые описанного NLR1Ch-элемента выявлены
I
все характерные для Non-LTR ретротранспозонов структурные элементы. Показано, что по количественным и качественным характеристикам дивергенция семейств NLR1-элементов отражает степень эволюционного расхождения видов, в которых он исследовался. Из этих данных следует, что, используя последовательности ДНК Non-LTR ретротранспозонов в качестве зондов, можно выявлять степень родства малоизученных родственных видов, исследуя дивергенцию семейства мобильных элементов, а следовательно, и сопряженную с ним дивергенцию видов.
Доказательство мобильности ранее описанного вероятного транспозона ИЕС было крайне важно в связи с нетипичностью его структуры для мобильных элементов этого класса. На основании данных о структуре МЕС-элемента существенно расширяются представления о транспозонах. Как выяснилось, их концевые инвертированные повторы могут быть длинной более 100 п.н. и, по-видимому, содержать в своем составе промотор для РНК-полимеразы II. Эти данные расширяют представления о структурных характеристиках транспоэонов.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на VIII двустороннем симпозиуме СССР - ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1989), на VI международном совещании по структуре и функции Колец Бальбиани (Джексон, США, 1993).
Публикации. Основные результаты работы изложены в трех научных публикациях.
Структура и объем работы. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, включающих 12 рисунков и одну таблицу.. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы.
