Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование организации хромосом описторхид является актуальной фундаментальной задачей. Класс Trematoda (трематоды или сосальщики), к которому относятся исследованные в настоящей работе виды, представляет одну из наиболее эпидемиологически значимых групп паразитических червей. Характерной особенностью трематод является наличие сложного жизненного цикла ди- или триксенного типа, в течение которого происходит чередование бесполого (партеногенетического) и полового поколений. Дефинитивными хозяевами трематод являются пресмыкающиеся, птицы, млекопитающие, в том числе человек.
Некоторые виды (Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, Clonorchis sinensis), составляющие так называемую «описторхозную триаду», образуют обширные ареалы инвазии, практически сливающиеся друг с другом в один крупный очаг. Самый крупный очаг зараженности O. felineus расположен в Российской Федерации, в Обь-Иртышском бассейне, причем в некоторых его районах уровень инвазии среди местного населения может быть близок к 100%. Ареалы инвазии описторхидами расширяются, возникают новые ареалы, что в последние годы связано с активной миграцией населения в страны Европы. На сегодняшний день O. viverrini и C. sinensis официально внесены в список IARC (International Agency for Research on Cancer) биологических канцерогенов (Bouvard et al., 2009), O. viverrini и C. sinensis относятся к первому классу, O. felineus – к третьему классу канцерогенов (IARC, 2011). В странах, где эти виды широко распространены, самые высокие в мире показатели по возникновению холангиокарциномы (WHO, 1995).
В связи с этим, полноценное и разностороннее изучение описторхид стало актуальной задачей, решение которой будет иметь не только фундаментальное, но и практическое значение, например, при разработке чувствительных и специфичных методов диагностики, а также создания новых лекарственных препаратов.
Полноценное изучение описторхид помимо описания их морфологии, жизненного цикла, ареала зараженности, клинической картины вызываемых ими заболеваний, отношений паразит – хозяин, систем размножения должно включать также детальное изучение их генома. Описторхиды, несмотря на сложную программу онтогенеза, имеют небольшой размер генома (300-400 Mb) и кариотип представленный 6-8-ю парами хромосом.
Исследование структурно-функциональной организации хромосом является необходимым элементом при изучении геномов описторхид. Однако на данном этапе существует ряд технических проблем, без решения которых изучение организации генома на хромосомном уровне у описторхид невозможно. Одной из таких проблем является ограниченное количество материала, которое может быть использовано для цитогенетических исследований. Прежде всего, это вызвано небольшим размером описторхид и их сложным онтогенезом.
Основной причиной того, что хромосомы описторхид, как и у всех трематод слабо изучены, является сложный жизненный цикл этих паразитов. На сегодняшний день в лабораториях мира удавалось лишь частично воспроизвести жизненный цикл трематод (для кровяных сосальщиков полностью). В случае с описторхидами дополнительные проблемы обусловлены микст-инвазией первого промежуточного хозяина трематод - моллюска, и чрезвычайно низкой частотой заражения моллюсков мирацидиями в лабораторных условиях. Поэтому многие исследователи при изучении трематод работают с их дефинитивными стадиями, а именно: маритами. Одним из главных вопросов, которые встают перед исследователем при работе с хромосомами не только описторхид, но и трематод в целом, является следующий: какую ткань или орган мариты следует брать для приготовления хромосомных препаратов и каким образом фиксировать выбранный материал? Для ответа на этот вопрос было целесообразно провести комплексный микроскопический анализ, который предварял исследование непосредственно самих хромосом описторхид. Главной целью подготовительного этапа являлся поиск тканей или органов мариты описторхид, которые характеризуются высоким митотическим индексом.
Исследование структурно-функциональной организации хромосом подразумевает обязательное решение ряда вопросов: определение локализации ЯО (ядрышковый организатор) районов, выявление и описание блоков структурного гетерохроматина, анализ распределения в хромосомах кластеров повторенных последовательностей (теломерной ДНК и рДНК). Для успешного проведения исследований, направленных на детальное описание хромосом, необходимо получение препаратов хромосом, позволяющих выявлять и описывать их линейную дифференциацию. Имеющиеся на сегодняшний день данные, указывают на небольшой размер генома и малый размер хромосом у большинства трематод, что в значительной степени затрудняет использование стандартных методов хромосомного анализа и определяет необходимость поиска новых подходов в получении хромосомных препаратов трематод, обеспечивающих проведение цитогенетического анализа на высоком уровне разрешения.
В связи с высокой значимостью изучения структурно-функциональной организации хромосом описторхид, были сформулированы следующие цели и задачи настоящего исследования.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение особенностей структурно-функциональной организации хромосом описторхид.
В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
-
Разработать методы приготовления препаратов митотических и мейотических (в том числе пахитенных) хромосом из марит описторхид (Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, Metorchis xanthosomus, Metorchis bilis, Clonorchis sinensis);
-
Провести цитогенетический анализ хромосом описторхид с использованием методов дифференциального окрашивания и гибридизации in situ:
а) выполнить морфометрический анализ хромосом описторхид;
б) провести дифференциальное окрашивание хромосом исследуемых видов описторхид (С- и AgNOR-окрашивание);
в) получить микродиссекционные ДНК-пробы, специфичные хромосомам 1 и 2 O. felineus и M. xanthosomus;
г) изучить локализацию кластеров (рДНК, теломерные повторы) и распределение диспергированных повторенных последовательностей в хромосомах описторхид.
3. Выполнить сравнительный межвидовой анализ хромосом исследуемых видов описторхид.
Научная новизна
При изучении структурно-функциональной организации хромосом описторхид были использованы морфометрические и молекулярно-цитогенетические методы, в результате которых впервые:
дано описание кариотипа M. bilis;
показано, что кариотип C. sinensis из Дальнего Востока РФ содержит 7 пар хромосом;
проведен морфометрический анализ хромосом M. bilis, M. xanthosomus;
изучена локализация ЯО районов и С-позитивных блоков в хромосомах описторхид;
получены микродиссекционные ДНК-пробы для хромосом описторхид;
показано наличие хромосомоспецифичных кластеров повторенных последовательностей в хромосомах у плоских червей (у O. felineus и M. xanthosomus);
определена локализация рДНК в хромосомах описторхид;
установлено, что кластеры теломерной ДНК у описторхид состоят из повторов (TTAGGG)n и локализованы тольков в теломерных районах хромосом;
построены идиограммы мелких пахитенных хромосом описторхид.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты, полученные при проведении на современном уровне комплексного микроскопического анализа мариты O. felineus, могут быть использованы в курсе лекций по паразитологии и зоологии беспозвоночных. Данные, полученные при проведении цитогенетического анализа хромосом описторхид, являются весомым вкладом в развитие цитогенетики трематод. Впервые для плоских червей (для описторхид) были получены пахитенные хромосомы с выраженной хромомерной организацией; результаты сравнения хромомерной организации пахитенных хромосом описторхид являются первыми в сравнительной цитогенетике трематод. Разработанный автором метод приготовления препаратов пахитенных хромосом станет мощным инструментом в руках исследователей, как в области сравнительной цитогенетики, так и при проведении полногеномного секвенирования описторхид на этапе финальной сборки генома.
Положения, выносимые на защиту.
1) В ходе кариотипической эволюции представителей семейства Opisthorchiidae (O. felineus, O. viverrini, M. bilis, M. xanthosomus) имели место внутрихромосомные перестройки.
2) Хромосомы описторхид имеют единственный кластер рибосомных генов, состоящий из двух GC-богатых субблоков, разделенных АТ-богатым участком.
3) Теломерная ДНК описторхид представлена мотивом (TTAGGG)n и локализована только на концах плеч всех хромосом. В хромосомах описторхид интерстициальные кластеры теломерной ДНК отсутствуют.
4) Хромосомы представителей плоских червей (описторхид) характеризуются наличием хромосомоспецифичных кластеров повторенных последовательностей.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях и сессиях: на итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления “Живые системы” (Москва, Россия, 2009), на III Межрегиональной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 80-летию профессора К.П.Федорова (Новосибирск, Россия, 2009), на 7-ой Международной конференции по биоинформатике регуляции генома и структурной\системной биологии (BGRS/SB’2010) (Новосибирск, Россия, 2010), на V Международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных (KARYO V) (Новосибирск, Россия, 2010), на международной научной конференции “Теоретические и практические проблемы паразитологии” (Москва, Россия, 2010), на 18-ой Международной хромосомной конференции (18 ICC) (Манчестер, Великобритания, 2011), на отчетной сессии ИЦИГ СО РАН (Новосибирск, Россия, 2012), на 8-ой Международной конференции по биоинформатике регуляции генома и структурной\системной биологии (BGRS/SB’2012) (Новосибирск, Россия, 2012), на международной конференции “Хромосома 2012” (Новосибирск, Россия, 2012), на международной конференции “Современные проблемы общей паразитологии” (Москва, Россия, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 4 работы – статьи в отечественной и зарубежной печати, в журналах, входящих в список ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы, приложения. Работа изложена на 169-и страницах, иллюстрирована 32-мя рисунками, содержит 8 таблиц и 8 приложений.
