Введение к работе
Актуальность проблемы.
Известно, что морфологически однородные клетки ряда тканей обладают различными тинкторизльними свойствами: одни интенсивно окрашваатся гистологическими красителями, поэтому их стает называть "темными" клетками, другие хуже воспринимают краситель - их каэывают"светлыми" ( Яевоин, 19-18; Секамо-ва. Бекетова, 1975; Коломниа, 1985).
Были высказаны многочисленные лредполс.тения о морфо-функциональных различиях к биологическом значении темных и светлых клеток, причем многие кз этих предположений представляют собой азаимоиеключзюгциеся гипотезу.
Так. наличие темных и светлых клеток часто связывают с отражением различных функциональных состонний одного и того хе клеточного типа, либо с существованием самостоятельных клеточных популяция С Секзмовз, Бекетова.1975: Лвоутденко, Маршак. 1983). Согласно одной точка зрения, темные клетки наименее дифференцированные элементы ткани { Хлопин, 1946; Яс-Еоин. 1948; Крымский и др. , 1968), которые чаще всего встречается в ростковых слоях ткани и очагах регенерации (Сазар-зик, Румянцев. 19465; согласно другсй теории различия в диф-Фэрениярозк.е и проллферативной активности темню: и светлых клеток отсутствуют С Струве и др. , 1975). Вопрос о природе и биологическом значении темных и светлых клеток до сих пор не решек и остается дискуссионным. Повтору представляется необходимым провести более упорядоченный и глубокий анализ ноофо-фуккциокальных отличий темных и светлых клеток с привлечением современных морфологических, гистохимических и здектронномик-роскопических исследований на одном типе клеток. Наиболее
удобным объектом исследования являются гепатоциты, поскольку в литературе имеется их детальная морфо-функциональная характеристика. Кроие того, для этих целей может, быть использована первичная культура гепатоцитов, которая по маркерным синтезам первые 3 -4 дня не отличается от клеток печени in vivo, и на клетках которой удобно проводить прижизненные наблюдения и гистихимические реакции. .Цель и вадачи исследования.
Целью настоящей работы было выявление морфологических и функциональных особенностей темных и светлых гепатоцитов с помоїцью сбєтооптичєских и злектронномикроскопических методов.
Были поставлены следующие задачи:
1. Провести сравнительную характеристику морфо - функци
ональных особенностей клеток паренхимы печени на мазках и.
срезах по следующим параметрам;
а) частота встречаемости темных и светлых клеток в зависимости от их локализации в печеночной дольке
0) относительные размеры клеток
в) сравнение количества ДНК, РНК, общего белка,гликогена, а так хз уровня включения меченых предшественников ДНК и РНК в темные и светлые клетки паренхимы печени.
2. Используя первичную культуру клеток печени провести
сравнительную характеристику темных и светлых гепатоцитов:
а) выявить гистохимический! методами, различаются ли
х-зыхые и светлые клетки содеряанием РНК, суммарного белка,
нейтральных и связанных липидов. гликогена, кислых мукополи-
сахаридов и гликопротеидов ь цитоплазме.
б) соавнить уровни включения меченых предшественников
- з -Tax.
3. Сравнить биоэнергетические свойства теыных и светлых гепатоцктов.
4. Сравнить значения внутриклеточного рН темных и светлых гепатоцитов в первичной культуре.
-
Выяснить, являются ли темные и светлые гепатоциты равличныыи субпопуляцияыи клеток или они представляют ссбоа переменные клеточные состояния.
-
Используя первичную культуру гепатоцктов, выяснить природу более интенсивного ократмвания темных клеток.
Научная новизна работы.
Е настоящей работе впервые предпринята попытка сравнения структурно-функциональных характеристик гепатоцитов и их тинкториадьных свойств с помоідьс метода картирования индивидуальной клетки. Используя картирование отдельных гепатоцитов удалось показать, что темные гепатоциты отличаются от светлых высоким энергетическим потенциалом митохондрий и более активным синтезом АТФ. Наряду с этим установлено, что темные и светлые гепатоциты не являются различньми сублопуля-цияии клеток, а представляют собой переменные клеточные состояния, различагазяеся энергетической активностью. Культивируемые темные гепатоциты также, отличаются от светлых более высоким содержанием гликопротеидов и уровнем включения меченых углеводов в процессе синтеза гликопротеидов в клетках. Впервые установлено, что темные культивируемые гепатоциты обладают более низким значением прижизненного внутриклеточного рН, которое могкет меняться с течением времени и коррелирует с тиккториалъныыи свойствами клеток. Получены данные, из которых следует, что причиной болеа интенсивного окрашивания тем-
- 4. -кых клеток является большее количество карбоксильных групп белков.
Ііаучно- практике о кое значение работы.
Выполненная работа в целом имеет теоретический характер и ее значение заключается, главным образом, в выявлении структурно-функциональных особенностей темных и светлых клеток. Результаты работы, такл» позволили показать, что один и тот же гепатоцит моиет находиться в различных физиологических состояниях, сопровождаемых изменением уровня энергизации митохондрии, уровнем прижизненного значения рК. уровнем синтеза гликопротеидов. что вероятно и определяет его способность в резной степени связывать краситель после фиксации. Таким образом показано, что использование простой окраски метиленовим синим может служить критерием оценки физиологического состояния клетки.
Апробация диссертационного материала.
Основные результаты были доломекы ка межкабораторном семинаре Института биологии развития и ка XXI конференции молодых ученых биологического факультета МГУ (1990).
Публикации.
11о теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.
Структура и объем работы.