Введение к работе
Актуальность проблемы. Расшифровка механизмов действия биологически активных веществ на клетки-мишени ведет к пониманию закономерностей регуляции клеточной активности и позволяет осуществлять направленный контроль процессов жизнедеятельности. Проблема функционирования внутриклеточных регуляторних систем связана с решением таких фундаментальных проблем биологии развития как созревание реагирующих систем развивающихся организмов, приобретение ими способности специфически отвечать на воздействие индуктора. В конечном ятоге, именно на клеточном уровне реализуются все регуляторные воздействия, обеспечивающие раовитие органиома, его существование как единой системы, гомеостаз и адаптацию к изменяющимся условиям внешней среды (Турпаев, Манухин, 1981).
Данная проблема прямо связана и с таким важным вопросом естествознания как формирование и раовитие половых клеток. Нервная система оказывает регуляторное действие на гаметогенез морских беспозвоночных с помощью химических передатчиков - медиаторов и гормонов (Walkei, 1984.; Paiisi et al., 1987; Smiley, 1990). Достаточно обширный фактический материал доказывает участие биогенных моноаминов, медиаторов моноаминергической системы, в регуляции роста и созревания гамет морских беспозвоночных. Исследования в втсй области ведутся по таким направлениям как идентификация биогенных моноаминов в нервной ткани (Cottiell, Pentieath, 1970; Pentteatb, 1972; Huet, Fianquinet, 1981; Хотимченко, 1989); изучение сезонной динамики уровня этих веществ в ЦНС и половых железах (Хотимченко, Деридович, 1988); выяснение роли биогенных моноаминов в регуляции обмена веществ в гонадах (Khotimchenko, 1982), стимуляции вымета половых клеток (Iwata, 1976; Matsutani, Namura, 1982). Молекулярные механизмы действия медиаторов моноаминергической системы на половые клетки изучены крайне слабо. Лишь оксперпментальные исследования, посвященные влиянию ка-техоламинов и индолилалкиламинов на активность аденилатциклазы
ооцитов и орелых ятгц иглоіожих, позволяют предположить участие аде-,нилатцихлазной системы в проведении регуляторного сигнала, индуцированного биогенными моноаминами (Renaud et al., 1983; Shenker et al., 1985; Parisi et al., 1987; Хотиыченхо, 1989). В связи с этим возникают следующие вопросы. Какие рецепторы опосредуют действие биогенных моноаминов? Каким обраоом эти рецепторы взаимодействуют с адени-латциклаоой? Каковы свойства и особенности регуляции аденилатци-клааы в половых клетках? Как поменяется функциональная активность аденилатциклааы в период внутригонадного оогенеоа? Ответы на эти вопросы особенно необходимы в связи с открытием донервных нейро-трансмиттеров и рецепторних обраоованнй как внутри ооцитов, так и на поверхностной мембране (Буоников, 1987; Kusano et al., 1978, 1982; Miledi, 1980; Eusebi et al., 1984). В этом отношении ооциты иглокожих представляют удобную модель для изучения функционального соотношения внутриклеточных и расположенных на клеточной поверхности трансмиттерных рецепторов, а также для исследования взаимодействия отих'рецепторов с внутриклеточными регуляторными системами. Уникальность этой модели заключается и в том, что исследования можно проводить как на живых клетках, так и на мембранных препаратах.
Цель и задачи работы. Цель работы состояла в изучении структуры и механизма действия аденилатциклаоной системы-ооцитов иглокожих. Для этого необходимо было решить следующие оадачи:
1. Методами световой цитохимии и электронной гистохимии исследо
вать локализацию аденилатциклааы в гонадах иглокожих.
2. изучить свойства и особенности регуляции активности адени-
латциклаоы. Сравнить полученные результаты с литературными дан
ными.
-
Выявить и идентифицировать клеточные рецепторы, связанные с аденилатциклао ой.
-
Провести исследования функциональной активности аденилатциклаоной системы в период роста ооцитов и в раннем эмбриогенеое.
Научная новизна. Впервые проведены детальные исследования свойств
аденилатцикпаоы ооцитов иглокожих. Показано, что аденипатциклаоа входит в состав мембранного комплекса, включающего, кроме фермента, рецепторную и регуляторную субъединицы.
Установлено, что основные свойства аденилатциклаоного комплекса ооцитов амурской овеоды, такие как: кинетические константы воаимо-действия фермента с субстратом; способность активироваться ионами магния, марганца, фтора, гуаниловыми нуклеотидами и биогенными моноаминами,- схожи со свойствами одноименного комплекса соматических клеток других животных организмов. Особенность регуляции аденилат-циклаоы ооцитов Заключается в том, что рецепторная субъединица представлена рецепторами двух типов - дофаминовыми и адренергическими, связанными с ферментом через стимулирующий Gs-6enoK.
Впервые идентифицированы адренорецепторы в ооцитах амурской овеоды. Радиолигандный аналио покавал, что оти рецепторы относятся к /5-типу. Показано, что по мере роста ооцитов активность аденнлатци-клаоы снижается. Это свжэано с уменьшением количества фермента в мембране и изменением механиома регуляции его активности, что выражается в "исчезновении" рецепторов к биогенным моноаминам, свяоан-ных с Gs-6ensoM.
Теоретическое и практическое оначение. Совокупность полученных в работе данных дает детальную картину функционирования аденилатциклаоного комплекса в ооцитах иглокожих - важнейшей системы регуляции клеточной активности. Это расширяет представления о механизмах действия медиаторов моноаминергической системы на формирование и развитие половых клеток. Исследование особенностей регуляции активности аденипатциклааы в оогенезе вносит определенный вклад в понимание эволюционных процессов становления гормональных регуляторних систем.
Иовестно, что аденилатциклаоная система половых и соматических клеток имеет больше сходств, чем раоличил. В свяои с этим, ооциты иглокожих являются наиболее вероятным претендентом на роль модельного объекта для исследований действия многих биологически активных
веществ и биопрепаратов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Советско-финском симпозиуме по биологии развития "Сигнальные молекулы и клеточная дифференцировка" (Суодаль, 1991), на Международной конференции "Нейрофармахология на рубеже двух тысячелетий" (Санкт-Петербург, 1992), на 8 Международной конференции по иглокожим (Дижон, Франция, 1993), на ежегодных отчетных сессиях ИБМ (1992, 1993).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.
Структура д объем диссертации. Работа состоит но введения, 6 глав, выводов; список литературы включает 190 источников, в том числе 166 иностранных. Диссертация наложена на 135 стр. и включает 3 таблицы, 28 рисунков (графики, схемы, макрофотографии).
Исследования проводили на иглокожих, обитающих в проливе Старка (зал. Петра Великого, Японское море),- двух видах морских ежей Strongy-locentrotas wtermedius (серый еж), 5. nudus (черный еж),- и двух видах морских овеод - Asterias a-muiensis (амурская овеода), Aphelasterias japon-іса (афеластерия японская). Животных собирали с помощью легководо-лаоной техники и либо сраоу обрабатывали, либо помещали в аквариумы с аэрируемой проточной морской водой, где они находились до опытов.
Для гистологических исследований материал фиксировали в жидкости Буэна и заключали в парафин по общепринятым методикам. Среоы толщиной 3-5 мкм, приготовленные на санном микротоме, окрашивали гематоксилином Эрлиха.
Модифицированным для светооптической микроскопии способом исследовали яожалБоапшо аденипатщшлаоы в оогщтах. Для получения оо-цитов, женские гонады извлекали из лучей половоорелых морских овеод, промывали в искусственной ледяной бескальцевой морской воде и быстро раореоали на мелкие кусочки. Суспензию ооцитов фильтровали через тонкий гас и отмывали от фолликулярных клеток в этой же воде
трехкратным иереосажденнем с помощью ручной центрифуги в течение 2-3 мин. Зрелые яйца морского ежа получали методом описанным Г.А.Бувниковым (1975).
Для выявления локализации аденипатпдклаоы клетки фиксировали 2,5% глутаральдегидом на 0,1 М Трис-иалеатном буфере, содержащем 4,5% глюгооы, рН 7,4, в течение 30 млн. Промывали тем же буфером, содержащем 8% глюкозы, 2 раса по 10 мин п помещали на 90 мин в инкубационную среду: 0,88 М Трис-малеатного буфера, рН 7,4; 0,5 аденшшли-мидодифосфата; 8% глюкозы; 2 мМ теофиллина; 4 мМ MgSO^ . В конце инкубации добавляли 2,4 мМ Pb[NO^)2 и выдерживали материал в течение 4 ч при комнатной температуре. Промывали дистилированной водой, обрабатывали 1% уксусной кислотой 1 мин. Для перевода неокрашенного пирофосфата свинца в темноокрашенныи продукт материал 5 мин обрабатывали 0,5% раствором Na2S, оаключали в глицерин-желатину; Контрольные обраоцы инкубировали в среде без субстрата. Количественное определение активности аденипатциклаоы производила на пжтофо-тометре "Vikers". Использовали маску А4, ,\ = 550 нм.
Электронно-цитохимическим методом (Culter, 1983; Zajic, Schacht, 1983) исследовали локализацию аденилатцнкяаоы в клетках гонад. Кусочки тканей префшхнровапп в 1% растворе глутаральдегида на 0,1 М какодилатном буфере в течение часа при 0С, отмывали и помещали на 30 мин при 20С в инкубационную среду: 100 мМ Трис-малеатного буфера, 5 мМ ЪЛ.дС12, 5 мМ SrCl2, 0,5 мМ 5-аденипилимидодифдсфат, 5 мМ теофиллина, 207 мМ NaCl и 10% декстрозы; осмотилность среды 1200 mOsM; рН 8,6. Для проявления стронциевого преципитата нспольоовали 2% раствор Pb(N03)2- После ополаскивания, фиксации и дегидратации материал оаключали в Эпон 812. Контрольные обраоцы инкубировали в среде без субстрата и в среде с субстратом, к которой добавляли 10 мМ фторида натрия, либо нагревали инкубационную среду до 60"С для инактивации фермента.
Локализацию адренорецепторов в ооцптах изучали методом радиоавтографии. Клетки инкубировали в искусственной морской воде, содержащей 10_еМ меченого [3Н]-дигидроальпренолола (L-Dichydroalprenolol-l-
propil-2,3-3H, удельная активность 2,005 ТБк/ммоль, "Izinta"). Черео 90 мнн ооциты осаждали с помощью ручной центрифуги и после двухкратной отмывки охлажденной искусственной морской водой фиксировали в 3% растворе глутаральдегида на морской воде. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм покрывали фотоэмульсией марки "М", время експооиции составляло 45 суток. После проявления срезы окрашивали гематоксилин-эоовном.
Для идентификации адренорецепторов испольоовали метод радиоли-гандного анализа, Суспеноию ооцитов инкубировали в искусственой морской воде с добавлением определенного количества меченого [3Н]-дигидро-альпренолола в присутствии или отсутствии агонпстов или антагонистов различных рецепторов. Общий объем пробы составлял 1 мл. Реакционную смесь инкубировали 30 мин лри 15С и пропускали черео GF/C фильтр. Фильтры промывали и после высушивания помещали в виалы, оаливали 5 ил сцинцилляционной жидкости марки Ж-8,.черео 2-3 ч подсчитывали радиактивность с помощью "51.-4221" (Франция). Неспецифическое связывание определяли при добавлении в среду инкубации 10_4М немеченого пропранолола. Для определения специфического связывания но среднего еначенид общего вычитали неспецифическое свявыванве.
Активность аденплатциклаоы определяли в мембранных препаратах ооцитов морских овезд и гомогенатах яиц и ранних эмбрионов морского ежа модифицированным методом Ткачука и Балденкова (1978). Мембранную фракцию ооцитов морских овеод получали методом Doree (1978). Яйца и оародышей морскою ежа S.intexmedius гомогенизировали не более двух мин в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 7,4, содержащем 2 мМ ЭДТА. Количество пАМФ определяли методом Джильмана (Gilman, 1970) с помощью набора реактивов "Cyclic AMP assay Kit" фирмы Amer-sham (Англия).
Концентрацию белка в обраоцах определяли методом Gieenbeig и Jad-dock (1982) с помощью БФ-реактива.
Экспериментальные методы. Для поучения свойств аденилатциклао-ной системы в раннем эмбриогенезе морского ежа животных собирали в сеоон раомноження. Получение половых продуктов, оплодотворение и
раавптие зародышей проводили по методике Г.А. Буоникова (1975). Эксперименты по поучению влияния биогенных моноаминов на созревание ооцитов морских овеод выполняли в период нереста. Для индукции созревания применяли арахпдоновую кислоту в конечной концентрации 5 10~5М. В опытах с ооцитами использовали только тех животных, у которых процент индуцированного созревания составлял не менее 98%. Выделенные ооциты инкубировали при 20"С в искусственной морской воде (10%-ная суспензия объемом 1 мл) в трех вариантах опытов: без добавок (для определения процента спонтанного созревания), с добавлением арахидоновой кислоты (для определения процента индуцированного созревания), с. добавлением арахидоновой кислоты после 20 мин преин-кубации ооцптов с различными концентрациями препаратов. Исходные растворы адреналина, норадреналина, дофамина были приготовлены на искусственной морской воде. Процент созревания определяли через 30 мин после начала инкубации по числу ооцитов с растворенным зародышевым пузырьком из расчета на 100 клеток.
Для работы использовались следующие препараты : дофамин гидрохлорид ("Fluka"), норадреналжн битартрат, адреналин ("Serva"), арахи-доновая кислота, выделенная из бычьей печени (Лаборатория сравнительной биохимии Института биологии моря).
Данные обрабатывали методами вариационной статистики. Различия между средними величинами считали достоверными при Р < О,05.