Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Последовательность структурных, функциональных и биохимических изменений скелетных и сердечных мышц в онтогенезе 7
2. Ионные соотношения в скелетных и сердечных мышцах в ходе онтогенеза 16
3. Ионный состав среды в онтогенезе 28
4. Формирование электрических свойств скелетных и сердечных мышц в онтогенезе 30
5. Функциональная роль ионов К, Mg , На , Са и Р в процессах жизнедеятельности клеток 39
6. Заключение по обзору литературы и постановка задачи настоящего исследования 48
ГЛАВА II. МЕТОДИКА,ЭКСПЕРИМЕНТ
1. Объект исследования 51
2. Подготовка ткани к исследованию 51
3. Режимы исследований . 54
4. Количественный рентгеновский микроанализ 56
5. Статистическая обработка экспериментальных данных . 58
6. Сравнение различных методов подготовки ткани к рентгеновскому микроспектральному исследованию 59
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Результаты электронно-микроскопического исследования структуры скелетной и сердечной мышц крысы в эмбриогенезе 60
2. Соотношение внутриклеточных концентраций К, Na и
Р в эмбриогенезе скелетной мышцы белой крысы .... 97
3. Соотношение внутриклеточных концентраций К, На и
Р в эмбриогенезе сердечной мышцы крысы 125
ГЛАВА ІУ. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 133
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 146
ВЫВОДЫ 147
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 149
ЛИТЕРАТУРА 150
ПРИЛОЖЕНИЕ 186
- Последовательность структурных, функциональных и биохимических изменений скелетных и сердечных мышц в онтогенезе
- Количественный рентгеновский микроанализ
- Результаты электронно-микроскопического исследования структуры скелетной и сердечной мышц крысы в эмбриогенезе
Введение к работе
Актуальность работы. Для современной биологии клетки чрезвычайно важно установить корреляции, существующие между ультраструктурными, химическими и функциональными изменениями. В связи с этим очевидна необходимость исследовать их параллельно.
Известно, что в эмбриональном миогенезе ультраструктурные, химические и функциональные изменения происходят одновременно. Однако до сих пор они изучались раздельно. Имеющиеся сведения фрагментарны. Ультраструктурные превращения наблюдали на различных мышцах животных разных видов. Это внесло элемент несопоставимости существующих данных об ультраструктуре дифференцирующихся мышц. Прямые измерения внутриклеточных концентраций элементов в эмбриональном миогенезе вообще не проводились. Как правило, для анализа элементного состава использовали пламенную фотометрию/ Klein,I960; Harsch ,Green ,1963; Бакланова и др.,1973; McDonald »DeHaan ,1973; Ritchie , Fambrough ,1975/. Но этот метод дает верное представление только о тканевых концентрациях.
В настоящее время эффективным методом исследования содержания и распределения химических элементов в тканях является рентгеновский микроанализ /РМА/, который позволяет независимо от определения объема внеклеточного пространства измерять концентрацию элементов непосредственно в клетке и в отдельных ее органел-лах. Этот метод был успешно применен для исследования содержания и распределения Ж&9 K,Mg, Са, р , CI и других элементов в мышцах взрослых животных / Somlyo et al#,1977а;б;1978а;б/.
Сочетание рентгеновского микроанализа с просвечивающей электронной микроскопией при исследовании эмбриогенеза функционально различных мышц может оказаться весьма перспективным для выясне- ния реальных взаимоотношений функциональной активности, ультраструктуры и элементного состава клетки в процессе развития. Цель работы; параллельное исследование ультраструктуры и внутриклеточного содержания химических элементов в эмбриогенезе двух функционально различных мышц одного и того же животного - крысы.
Основные задачи исследования. разработать способ прямого определения концентраций элементов в отдельных клетках эмбриональных мышц с использованием количественного рентгеновского микроанализа. измерить содержание К и На на разных стадиях эмбриогенеза в клетках двух функционально различных мышц крысы: скелетной и сердечной. в тех же самых клетках измерить содержание Р, так как внутриклеточная концентрация этого элемента коррелирует с уровнем физиологической активности клетки. параллельно рентгеновскому микроанализу провести сравнительное электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры клеток скелетной и сердечной мышц на разных стадиях развития.
Научная новизна. Впервые для исследования внутриклеточного содержания К и На в клетках эмбриональной ткани применен метод рентгеновского микроанализа. Разработаны способы приготовления эмбриональной ткани для количественного микроанализа, режимы измерения и способы расчетов. Впервые определено содержание К, Паи Р в клетках скелетной и сердечной мышц от 13-го до 19-го дня эмбриогенеза и новорожденных крыс и установлена закономерность изменения внутриклеточного содержания К, НаиРв ходе пренатального развития. Впервые на тех же мышцах и в те же сроки проведено сравнительное исследование ультраструктуры скелетной и сер- дечной мышц методом просвечивающей электронной микроскопии.
Практическая ценность. Разработка адекватного метода определения внутриклеточных концентраций На, К, Р и других биологически важных элементов в отдельной клетке и клеточных структурах эмбриональной мышечной ткани крыс делает этот объект удобной моделью для медицинских исследований, связанных с воздействием на плацентарный барьер и плазматические мембраны клеток в процессе их ди-фференцировки в норме и патологии лекарственных препаратов.
Апробация. Материалы диссертации докладывались на симпозиуме "Методы подготовки сложных объектов и анализ электронно-микроскопических изображений" /Петрозаводск,1976/, на 2-ом Всесоюзном симпозиуме "Криогенные методы в электронной микроскопии" /Пушино, 1977/, на Международной конференции "Микрозонд-78" /Дрезден,1978/, на 11-ой Всесоюзной конференции по электронной микроскопии /Таллин, 1979/, на 7-ой Всесоюзной конференции по локальным рентгеновским спектральным исследованиям и их применению /Черноголовка, 1979/, на 11-ой Международной конференции по электронной микроскопии и микроанализу /Сегед,1979/, на 9-ой Международной конференции по оптике рентгеновских лучей и микроанализу /Гаага,1980/, на объединенном семинаре Института эволюционной физиологии и биохимии АН СССР и Института цитологии АН СССР /Ленинград, 1983/.
Последовательность структурных, функциональных и биохимических изменений скелетных и сердечных мышц в онтогенезе
Известно, что различные скелетные мышцы развиваются из разных сомитов мезодермы / Chevaiiier et аі.,І977/. В отличие от скелетных мышц сердечные происходят из эпителиальных клеток спланхномезодермы /Кнорре,1981; Заварзин,1976; Manasek ,1968/.
В самом начале миогенеза презумптивные миобласты и клетки прекардиальной мезодермы имеют сходную ультраструктуру. Даже с
помощью электронного микроскопа трудно отличить такие клетки от окружающих клеток другого типа - хондро- и фибробластов /Konig-sberg I963;Manasek ,1968; Fischman ,1970/. Все они имеют одно центрально расположенное ядро, не менее одного ядрышка. В цитоплазме таких клеток содержится набор органелл, обычный для всякой недифференцированной клетки: свободные рибосомы и гликоген, гранулярный эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, вакуоли, несколько мелких митохондрий и никаких признаков миофибрилл / Hay, 1963; Konigsberg ,I963;Manasek ,1968;-Lentz ,1969; Fisch-man,I972; Holtzer .,1970/.
Клетки скелетных и сердечных мышц этого периода миогенеза сходны тем, что синтезируют ДШ, цитоплазматические белки, а также митотически делятся. Однако несколько позже кардиомиогенез идет с очень большой скоростью и значительно опережает формирование скелетных мышц.
В то время, как скелетные мышцы еще совсем не различимы, миграция клеток прекардиальной мезодермы приводит к образованию примитивного трубчатого сердца. Происходит это в разные сроки эмбриогенеза у разных животных: к 29-33 часам у эмбрионов кур Ма.-nasek ,1968/ и К 8 суткам у мышиных эмбрионов / Viragh, Challice 1973/. Сначала трубчатое сердце беспорядочно пульсирует. Позже сокращения становятся ритмическими и обеспечивают ток крови /Ма-nasek,I968; Chacko ,1972; Viragh , Challice ,1973;: Румянцев, 1982/. Поскольку к этому времени в массу миогенных клеток сердца еще не врастают нервные окончания / Gomez?1958/, природу ранних ритмических сокращений считают миогенной. Важной особенностью раннего миогенеза является относительная независимость последовательных морфологических превращений от наличия или отсутствия сокращений /малааек » Monrol Д9 /»
Клетки сокращающегося трубчатого сердца уже имеют миофибрил-лы. Время их появления варьирует в зависимости от вида животных.
Из литературы известно,что в кардиомиоцитах куриных эмбрионов ми-офибриллы возникают через 40-45 часов развития / Lindner,I960; Wainrach , Sotelo ,1961 /, у эмбрионов мыши - на 8-9 /Viragh , Challice ,1973/,» у крысы - на 9,5-10 день пренатальной жизни /viragh Porte ,1963; Viragh ,1964; okamoto et al.,I969; Morris , 1975/. К 11-13 суткам развития крысиного эмбриона число миофиламентов значительно увеличивается. Известно, что в начале миофиб риллогенеза появляются разрозненные миофиламенты, рыхлые пучки миофиламентов, материал z -полосы, фрагменты саркомеров, миофи-брилл и, наконец, целые миофибриллы. Существует большое число работ, в которых детально представлена картина миофибриллогене-за развивающегося миокарда кур / Lindner ,1960; Wainrach , Sote-lo ,1961; Caravita , Gibertini ,1966; Manasek ,1968; 1973/, мывшей / Viragh , Challice ,1973; Platzer ,1978/ и крыс / Viragh , 1964; Okamoto et al .,1969; Chacko ,1972/. Закономерности процесса миофибриллогенеза наиболее полно отражены в обзорах Фишмана, Жукова с соавторами и Подлубной /pischman,I972; %ков и щ ., 1974; Подлубная, 1981/. Показано., что миофибриллы и отдельные
фрагменты миофибрилл имеют саркомерное строение. Саркомеры образуются, по-видимому, самосборкой толстых, миозиновых /15 нм/ и тонких, актиновых /5-8 нм/ миофиламентов. При самосборке соблюдается гексагональный порядок. Не решен окончательно вопрос о преимущественной локализации миофибриллогенеза в кардиоцитах. Одни считают, что процесс идет по всей цитоплазме кардиомиоци-тов /Viragh, 1964; Manasek ,1968; Morris ,1975/. Другие приводят факты о начале миофибриллогенеза под сарколеммой /Holtzer et аЗ.,1959; Rash et al .,1970/ и последующем смещении образовавшихся МИОфибриЛЛ ВГЛубЬ ЦИТОПЛаЗМЫ /Rash et аЪ»19?0; Sheldon et al.,I976/.
Количественный рентгеновский микроанализ
Для получения количественных данных сравнивали интенсивность излучения / в режиме счета импульсов/ исследуемого элемента на тонком образце и массивном эталоне. В качестве эталонов использовали полированные кристаллы KAISi Og, uaCI и ЗСаз/РО 21 0. Калинин) калия и фосфора выделяли с помощью кристалла PET, а К -линию натрия - с помощью кристалла RAP. Счет вели в течение сорока секунд. Фон измеряли, уходя с линии; на срезе чистого эпона или на криосрезе чистого альбумина. Эти способы давали фактически одинаковые результаты и рассматривались как равноценные.
Расчет концентраций вели по методу, описанному Вуровиной и Пивоваровой /Буровина, Пивоварова,1978/. Для вычислений использовали формулу:- концентрации исследуемого элемента А, соответственно, в образце и в эталоне в весовых %; 1Аб и 1АТ - интенсивность счета на образце и на эталоне; Р/А/ - поправочный коэффициент, который учитывает нелинейность соотношения концентраций и скоростей счета в образце и эталоне из-за различного состава матриц и условий возникновения и поглощения излучения; P/h / -поправочный коэффициент, учитывающий толщину среза.
Результаты электронно-микроскопического исследования структуры скелетной и сердечной мышц крысы в эмбриогенезе
Скелетная мышца раннего эмбриогенеза. Настоящие наблюдения показали, что на 13-ый день эмбрионального развития крысы задние конечности находятся на стадии почки. К этому времени почки задних конечностей приобретают форму лопатки. Известно /Карлсон, 1983/, что в почке конечности мезенхимные клетки, из которых впоследствии развиваются скелетные мышцы, имеют определенную локализацию. В соответствии с этим ткань для исследований брали из той части почки, где сосредоточены клетки, детерминированные как мышечные. На рис. 2.А и 2.В изображена форма почки задней конечности 13-суточного крысиного зародыша и обозначена область мезо-дермального слоя почки, которая использовалась для экспериментов.
Предосторожность такого рода необходима, поскольку на 13-ый день эмбриогенеза крыс презумптивные миобласты не отличимы по морфологическим признакам от мезенхимных клеток, имеющих другую тканевую детерминацию.
Миобласты 13-го дня эмбрионального развития крысы являются недифференцированными клетками. Размер таких клеток 3-5 мкм. Из рис. 3 видно, что недифференцированные миобласты неплотно упакованы в почке. Площадь, занимаемая ими на срезе, не превышает 50%. Основную часть объема недифференцированных миобластов занимает ядро. В ядре одно и больше ядрышек. Для ядер недифференцированных миобластов характерно наличие в нуклеоплазме диффузного хроматина, а также пристеночного и рассеянного в виде отдельных глыбок конденсированного хроматина /рис. 3-4; 6-8/. Ядра различных недифференцированных миобластов 13-суточных эмбрионов значительно различаются электронной плотностью нуклеоплазмы /рис. 3-4/. Цитоплазма миобластов скелетной мышцы имеет набор органелл, типичный для любой недифференцированной клетки: несколько мелких митохондрий, обилие гликогена, свободных рибосом и полисом, развитый аппарат Гольджи, гладкий и гранулярный эндоплазматический ре-тикулум, вакуоли, лизосомы, липидные капли, мембранные образования, микротрубочки /рис. 4; 6-9/. Наблюдения показали, что плотность цитозоля отдельных недифференцированных миобластов 13-го дня эмбриогенеза весьма различна /рис. 3-4; 6/. Однако для всех недифференцированных миобластов характерно отсутствие в цитоплазме миофиламент. В то же самое время в примембранных зонах цитоплазмы таких клеток, а также в зонах выростов и межклеточных контактов видны отдельные разрозненные филаменты промежуточного диаметра 8-13 нм /рис. 5-6; 9/.
