Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 8
1.1 Основные особенности процесса инцистирования и организации цист покоя у инфузорий 9
1.1.1 Дегидратация цитоплазмы и аутофагия 9
1.1.2 Защитная оболочка цисты 12
1.1.3 Изменения в организации ядерного аппарата, хроматина макронуклеуса и модификации днк при инцистировании 16
1.2 Результаты исследований вегетативных клеток, предцистных клеток и цист покоя инфузорий bursaria truncatella 22
1.2.1 Морфология вегетативных клеток в. Truncatella 22
1.2.2 Процесс инцистирования. Морфология цист покоя в. Truncatella 27
1.2.2.1 Структурно-функциональная организация хроматина соматического ядра бурсарий на разных стадиях жизненного цикла 33
1.2.2.2 Ядерные тедьца, выявляемые в соматическом ядре цист покоя 38
1.2.3 Существует ли вид в. Ovata? 42
1.3 Заключение. Цель и задачи исследования 44
Глава 2 Материал и методы 46
2.1 Культивирование инфузорий б. Truncatella и в. Ovata в лабораторных условиях 46
2.2 Методы световой микроскопии 47
2.2.1 Прижизненная микрофотосъёмка 47
2.2.2 Метод непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания 48
2.3 Методы трансмиссионной электронной микроскопии 49
2.3.1 Метод ультратонких срезов 49
2.3.2 Метод дисперсии хроматина в растворах низкой ионной силы 50
2.3.3 Высокоразрешающая электронная авторадиография в сочетании с методом дисперсии хроматина 51
2.3.4 Метод иммуноэлектронной цитохимии 52
Глава 3 Результаты исследований 54
3.1 Ультраструктурная организация вегетативных клеток в. Ovata 54
3.2 Ультраструктурная организация цист покоя в. Truncatella и в. Ovata 62
3.2.1 Ультраструктурная организация «молодых» цист покоя 6. Truncatella 63
3.2.2 Ультраструктурная организация «зрелых» цист покоя 6. Ovata 72
3.2.3 Ядерные тельца, выявляемые в соматических ядрах цист покоя б. Truncatella и б. Ovata 80
3.3 Надмолекулярная организация хроматина соматических ядер в. Ovata на поздних стадиях инцистирования. Природа полигональных структур, выявляемых в соматических ядрах предцистных клеток 86
Глава 4 Обсуждение 97
4.1 Сравнительный морфологический анализ вегетативных клеток и цист покоя в. Ovata 97
4.2 Сравнительный морфологический анализ «молодых» и «зрелых» цист покоя в. Truncatella 100
4.3 Сравнительный морфологический анализ цист покоя в. Truncatella и в. Ovata. Существует ли вид б. Ovata? 103
Выводы 108
Список литературы 110
- Изменения в организации ядерного аппарата, хроматина макронуклеуса и модификации днк при инцистировании
- Структурно-функциональная организация хроматина соматического ядра бурсарий на разных стадиях жизненного цикла
- Ядерные тельца, выявляемые в соматических ядрах цист покоя б. Truncatella и б. Ovata
- Сравнительный морфологический анализ «молодых» и «зрелых» цист покоя в. Truncatella
Введение к работе
Крупные пресноводные инфузории рода Bursaria (Ciliophora) длительное время являются объектами как общебиологических, так и протозоологических исследований (Lund, 1914а, 1914b; Schmahl, 1926; Poljansky., 1934; Ruthmann, Heckmann, 1961; Сергеева, 1976a, 19766, 1977; Martinkina et al., 1983; и др.). Описаны три вида: Bursaria truncatella O.F.M. 1786, В. ovata Beers, 1952 и В. caudata Dragesco, 1972 (Foissner, 1993). Начиная с 1976, когда была разработана методика получения массовой периодической культуры бурсарий (Сергеева, 1977), эти инфузории активно используются для изучения различными молекулярно-биологическими методами в Лаборатории цитологии одноклеточных организмов Института цитологии РАН, при этом особое внимание уделяется ультраструктурной организации ядерного аппарата на разных стадиях жизненного цикла (Сергеева, 1976а, 19766; Сергеева, 1977; Борхсениус, Сергеева, 1979; Сергеева, Полянский, 1981; Martinkina et al., 1983; Сергеева и др., 1987; Сергеева, Бобылёва, 1988; и др.). Настоящая работа является продолжением этих исследований.
При наступлении неблагоприятных условий среды инфузории p. Bursaria, как и многие другие представители Protozoa, образуют цисты покоя. На этих особых стадиях жизненного цикла организмы не проявляют видимых признаков жизни и по морфологии даже отдаленно не напоминают клетки метаболически активных стадий (Lund, 1914а, 1914b; Beers, 1948, 1952; Corliss, Esser, 1974; De Puytorac et al., 1987; Gutierrez et al., 1990, 1998a, 1998b; Foissner, 1993, и др.). В последнее время цисты покоя простейших рассматривают как один из ярких примеров криптобиотического состояния — состояния «скрытой» жизни (см. обзоры: Ушатинская, 1990; Gutierrez et al., 2001).
Несмотря на широкое распространение явления инцистирования среди простейших, структурно-функциональная организация цист покоя остаётся до сих пор недостаточно изученной, главным образом из-за значительной обезвоженности клеток, обычно высокой плотности цитоплазмы и наличия, часто сложно организованных, защитных оболочек. В особенности слабо изучена ультраструктурная организация ядерного аппарата в цистах и её изменения в ходе инцистирования и эксцистирования. Между тем изменения, происходящие в генетическом аппарате при переходе к «скрытой» жизни, представляют несомненный интерес в плане структурно-функциональной организации хроматина при различных физиологических состояниях клетки. Исследованию ультраструктурной организации цист покоя у инфузорий p. Bursaria и прежде всего организации ядерного аппарата при инцистировании посвящена наша работа.
Особенностью нашего подхода к изучению ультраструктуры цист покоя у бурсарий явилось сопоставление ее с ультраструктурной организацией вегетативных клеток и сравнение цист разного возраста.
В качестве основного инструмента исследования был использован трансмиссионный электронный микроскоп (ТЭМ). Соответственно, мы использовали такие связанные с ним современные методы, как метод ультратонких срезов, дисперсии хроматина в растворах низкой ионной силы, высокоразрешающая электронная авторадиография в сочетании с дисперсией хроматина и иммуноэлектронная цитохимия.
В результате проведённого исследования:
Удалось подтвердить, что ультраструктура инфузорий p. Bursaria в состоянии криптобиоза сильно изменена по сравнению с таковой активных (вегетативных) клеток и характеризуется специфической организацией цитоплазмы, цитоплазматических органелл и ядерного аппарата (соматических ядер), а также наличием сложноорганизованных защитных оболочек.
Впервые показано, что при подготовке к криптобиозу происходит кристаллизация хроматина без разрушения петельно-розеточной упаковки путем специфической одинаковой упаковки хроматиновой нити в пределах
7 каждой петли розетки. Предложена схема этого процесса. Также впервые с помощью метода дисперсии хроматина в сочетании с высокоразрешающей авторадиографией показано наличие ДНК в кристаллоподобных структурах в соматических ядрах инфузорий в состоянии криптобиоза.
Впервые в соматическом ядре инфузорий в криптобиозе методами световой иммунофлуоресцентной микроскопии и электронной иммуноцитохимии обнаружены ядерные тельца, имеющие фибро-гранулярную структуру и связывающиеся с антителами к карбоксильному концу коилина многоклеточных организмов.
Получены дополнительные электронно-микроскопические данные в пользу выделения самостоятельного вида В. ovata Beers, 1952 в составе рода Bursaria.
Изменения в организации ядерного аппарата, хроматина макронуклеуса и модификации днк при инцистировании
Ядерный дуализм (два типа ядер в одной цитоплазме) — главная особенность ядерной системы инфузорий. Различают обычно мелкий и округлый микронуклеус (Ми) и, как правило, гораздо более крупный, различной формы в зависимости от вида инфузории макронуклеус (Ма). Инфузории могут содержать один или более, чаще всего диплоидных, Ми и один или более амплиплоидных Ma (Raikov, 1989, 1995). Микронуклеус выполняет, главным образом, генеративную функцию, т.е. обеспечивает обмен ДНК в ходе полового процесса (конъюгации) и даёт начало новым Ма, тогда как макронуклеус является соматическим ядром, которое отвечает за физиологическую активность клетки на протяжении всего жизненного цикла (вегетативное размножение, конъюгация, инцистирование). По этой причине ядрышки присутствуют исключительно в Ма. Оба ядра — типичные эукариотные ядра, окружённые ядерной оболочкой с типичными порами, хроматин имеет нуклеосомную организацию. Ми и Ма очень отличаются в отношении структурной организации хроматина. Хроматин в Ми вегетативной клетки однородный, плотно упакованный, тогда как хроматин Ма организован в форме многочисленных, разной степени конденсации хроматиновых глыбок, рассеянных по нуклеоплазме (Raikov, 1995).
В ходе инцистирования инфузорий происходят существенные изменения в организации ядер, главным образом, Ма. Эти изменения включают: слияние Ма, если их несколько, конденсацию хроматина Ма, изменения структурно-функциональной организации ядрышек, потерю части ДНК Ма (экструзивные тела), модификацию ДНК (например, метилирование). Все эти ядерные изменения, очевидно, существенно влияют на экспрессию генов, что приводит к инактивации транскрипции, главной характеристике криптобиотического состояния.
Так, у инфузорий, имеющих один Ма как на вегетативной стадии, так и на стадии цист покоя, в процессе инцистирования происходит значительное уменьшение объёма Ма и конденсация хроматина — например, у Bursaria truncatella (Sergejeva et al., 1993; Сергеева, Ливолан, Да Консейкао, Самошкин и др., 1995), у Euplotes rariseta (Dallai et al., 1987), у E. teylori (Garnjobst, 1928), у Colpoda cuculus (Kawakami, Yagiu, 1963; Kidder, Gaff, 1938), у С. steinii (Frenkel, 1980), у С. inflata (Martin-Gonzalez et al., 1991), у Diophtys scutum (Walker, Maugel, 1980) и у TilUna magna (Frenkel, 1992).
Макронуклеусы ряда исследованных инфузорий, имеющих несколько Ма на вегетативной стадии, соединяются в одну ядерную массу, суммарный объем которой существенно уменьшен (Gutierrez et al., 1998 b). Процесс слияния Ma описан главным образом у стихотрих и гипотрих, таких как: Histriculus muscorum (Matsusaka, Kimura, 1981), Gastrostyla steinii (Walker et al., 1980; Gutierrez, 1985), Gonostomum sp. (Walker, Hofmman, 1985), Laurientiella acuminata (Gutierrez et al., 1983), Onychodromus acuminatus (Jareno, 1985), Oxytricha bifaria (Kay, 1945; Verni et al, 1984), O. fallax (Grimes, 1973), O. nova (Callejas, Gutierrez, 1997), Sterkiella hlstriomuskurum (Adl, Berger, 1997), Stylonychia mytilus (Walker et al., 1975), S. pustulata (Kay, 1945). Однако есть и исключения: так, Pleurotricha sp. (Matsusaka, 1976) и Urostyla grandis (Rios et al., 1985) на стадии цист покоя, каки на вегетативной стадии, имеют несколько небольших по размеру Ма, хотя в процессе инцистирования у Urostyla grandis всё же происходит уменьшение числа Ма и конденсация хроматина (Tittler, 1935).
О механизмах и клеточных элементах, вовлеченных в слияние нескольких Ма в один, в настоящее время практически ничего неизвестно (Gutierrez et al., 1998b). Волкер с соавторами (Walker et al., 1980) обнаружили в цитоплазме у Gastrostyla steinii в зоне слияния Ма высокую плотность ми кротру бочек. Исследователи предполагают, что в процессе инцистирования микротрубочки могут функционировать пассивно, обеспечивая направленное движение сливающихся Ма, или могут активно расширять перешеек, соединяющий сливающиеся макронуклеусы. Однако у ряда исследованных инфузорий в цитоплазме в течение инцистирования микротрубочки не были обнаружены (Grimes, 1973; Gutierrez, Perez-Silva, 1983; Verni et al., 1984; Jareno, 1985; Walker, Hoffman, 1985). Поэтому, вероятно, в слиянии Ма при инцистировании участвуют и другие факторы (например, дегидратация клетки), что требует дальнейших исследований.
Конденсация хроматина Ма сопровождается радикальными изменениями в его ультраструктуре и организации (Gutierrez et al., 1998). На ЭМ уровне наблюдается слияние хроматиновых глыбок Ма, в результате чего происходит увеличение их размера (Kawakami, Yagiu, 1963; Grimes, 1973; Kink, 1973; Frenkel, 1980; Walker, Maugel, 1980; Gutierrez, Perez-Silva, 1983; Verni et al, 1984; Jareno, 1985; Walker, Hoffman, 1985; Dallai et al., 1987; Foissner, Foissner, 1987; Sergejeva et al., 1993; Сергеева, Ливолан, Да Консейкао, Самошкин и др., 1995, и др.). Слияние хроматиновых глыбок сопровождается конденсацией хроматина. Уровень компактизации хроматина особенно высок в цистах покоя некоторых кольподид, таких как Bursaria truncatella (Сергеева и др., 1987; Сергеева, Бобылёва, 1988) и Colpoda inflata (Gutierrez et al., 2001). Предполагают, что в конденсации хроматина могут участвовать микротрубочки (Walker et al., 1980). Возможно, что определённую роль при конденсации хроматина Ма играют специализированные основные белки (Gutierrez, 1985). Микроспектрофотометрический анализ, проведённый на Gastrostyla steinii, показал, что Ма цист имел примерно в 1.23 раза больше гистонов, чем вегетативный Ма, и что гистоны цист были примерно в 1.59 раза более богаты аргинином, чем гистоны вегетативных клеток (Gutierrez, 1985). Гутиеррец предполагает, что высокая конденсация ДНК Ма в цистах покоя может происходить и из-за присутствия таких богатых аргинином белков, как протамины, — как и в клетках многоклеточных организмов, где замена гистоновых белков на протамины при сперматогенезе связана с чрезвычайно плотной упаковкой хроматина.
У Bursaria truncatella (Сергеева и др., 1987; Сергеева, Бобылёва, 1988) и Colpoda inflata (Gutierrez et al., 2001) в Ma предцистных клеток и цистах покоя были впервые обнаружены кристаллоподобные гексагональные, предположительно хроматиновые структуры. На характеристике этих структур мы подробно остановимся ниже, в разделе «Результаты».
Структурно-функциональная организация хроматина соматического ядра бурсарий на разных стадиях жизненного цикла
В этом разделе будут рассмотрены более подробно изменения в ультраструктурной организации хроматина Ма вегетативных и предцистных клетках, цистах покоя. Эти данные были получены в основном методами ЭМ ультратонких срезов и дисперсии хроматина по Миллеру (Сергеева, 1975, 1976а, 19766, 1977, 1980; Мартынкина и др., 1983; Венгеров и др., 1983; Тихоненко и др., 1984; Tikhonenko et al., 1984; Сергеева и др., 1987, и др.). На основании изучения ультратонких срезов Ма вегетативных и коньюгирующих В. truncatella авторы пришли к выводу о том, что хроматин Ма имеет организацию, принципиально сходную с организацией хроматина других эукариот. Были высказаны предположения о том, что элементарные фибриллы ДНП в пределах отдельных хроматиновых глыбок (основного структурного элемента амплиплоидных ядер инфузорий по данным электронной микроскопии — см. обзоры: Осипов, 1981, Raikov, 1995) могут быть упакованы в виде «розетки» (Сергеева, 1976а) и могут иметь нуклеосомную природу (Сергеева, 1977).
Применение метода дисперсии хроматина по Миллеру подтвердило эти предположения (Мартынкина и др., 1983; Венгеров и др., 1983; Тихоненко и др., 1984): нуклеосомные фибриллы ДНП в хроматиновых глыбках диаметром 100—300 нм организованы в «розеткоподобные структуры», сходные с описанными в метафазных и интерфазных хромосомах других эукариот (Okada, Comings, 1979; Zatsepina et al., 1983; Прусов и др., 1985). Размеры глыбок (100—300 нм) и петельная упаковка ДНП в них позволяют думать об их структурно-функциональном соответствии хромомерам высших эукариот. При эксцистировании бурсарий, когда наблюдается естественная декомпактизация хроматина Ма, на наиболее развернутых петлях, отходящих от центров глыбок, формируются транскрипционные комплексы нерибосомных генов (Тихоненко и др., 1984).
Сочетание метода дисперсии хроматина с электронной авторадиографией позволило показать, что в растущих после деления клетках 3Н-уридин интенсивно включается в естественно декомпактизованный хроматин и в фибриллы РНП, но практически не включается в плотно упакованный хроматин глыбок (Венгеров и др., 1983). Таким образом, метод дисперсии хроматина соматических ядер бурсарий позволил показать, что хроматиновые глыбки размером 100—300 нм (хромомеры) являются структурно-функциональным и единицами интерфазного хроматина, степень компактизации которых может отражать уровень его активности, а радиально-петельная упаковка ДНП и глыбках может способствовать локальной активации хроматина в пределах индивидуальных петель.
Метод дисперсии дал возможность увидеть также одновременную транскрипцию на сестринских нитях ДНП в политенных участках Ма (Венгеров и др., 1983), существование которых в Ма В. truncatella предполагалось ранее на основании изучения ультратонких срезов (Сергеева, 1977).
Исследования хроматина Ма при инцистировании с помощью модифицированного метода дисперсии по Миллеру показали, что значительная часть хроматина Ма компактизуется с образованием очень плотных хроматиновых тяжей — хромонем двух типов (Сергеева и др., 1987). Подвергая изолированные Ма дисперсии в растворах низкой ионной силы, удалось показать, что хромонемы I типа постепенно декомпактизуются вначале в хроматиновые глыбки, а затем в «розеткоподобные» структуры с радиально расположенными петлями ДНП вокруг компактных центров хроматиновых глыбок. Хромонемы же И типа при коротких сроках дисперсии вначале разворачиваются в параллельно расположенные фибриллы ДНП толщиной от 30 до 70 нм, а затем — в нуклеосомные и ненуклеосомные нити.
Кроме того, на препаратах диспергированного хроматина при коротких сроках дисперсии Ма (1—15 мин), изолированных из ранних предцистных бурсарий, были визуализированы кристаллоподобные структуры, имевшие вид пластинок гексагональной формы. При этом обнаруженные два типа гексагональных пластинок четко различались по внутренней организации (Сергеева, Бобылёва, 1988). В этой работе было показано, что гексагональные пластинки обоих структурных типов начинают формироваться на самых ранних стадиях инцистирования. На более поздних стадиях гексагональные пластинки часто выявлялись в виде кластеров или рассыпавшихся стопок. При этом в составе одной стопки иногда наблюдалось чередование пластинок обоих структурных типов. Однако на очень поздних стадиях инцистирования и в цистах покоя бурсарий почти весь хроматин Ма практически не поддавался диспергированию при использованных в работе коротких сроках дисперсии. Кроме того, в таких препаратах можно было наблюдать присутствие скоплений трёхмерных кристаллоподобных кубических и полиэдрических микроструктур, внутреннюю организацию которых не удавалось визуализировать из-за их высокой электронной плотности. Параллельно проведенный анализ ультратонких срезов Ма поздних предцистных клеток В. truncatella показал, что многие глыбки конденсированного хроматина и некоторые фибриллярные ядрышки имели форму четырёх-, пяти- и шестиугольников (Сергеева, Бобылёва, 1988). На основании полученных данных было высказано предположение о том, что при инцистировании значительная часть хроматина Ма переходит в упорядоченное, жидкокристаллическое состояние. Следует отметить, что на препаратах диспергированных Ма, изолированных из метаболически активных клеток Bursaria, кристалл on одобные и полигональные структуры пока обнаружены не были (Сергеева, 19766, 1977, 1980; Martinkina et al., 1983; Vengerov et al., 1983; Sergejeva, Bobyleva, 1995).
Ядерные тельца, выявляемые в соматических ядрах цист покоя б. Truncatella и б. Ovata
Для Ма физиологически активных вегетативных особей характерно наличие ядерной оболочки, пронизанной многочисленными порами, многие из которых несут центральные гранулы (рис. 12). Количество ядерных пор иногда может быть настолько значительным, что в некоторых участках ядерной поверхности трудно различить собственно ядерную оболочку. В кариоплазме легко различимы многочисленные мелкие электронно-плотные хроматиновые глыбки неактивного хроматина (характерный элемент соматического ядра инфузорий) и значительно более крупные (также многочисленные) ядрышки (рис. 12, 13).
В ЭМ ядрышки у вегетативных особей имеют вид очень компактных, часто сложной конфигурации образований, состоящих в основном из фибриллярного компонента. К сожалению, микронуклеусы нами ни разу не были обнаружены на ультратонких срезах.
Проведённое ЭМ исследование вегетативных клеток В. ovata выявило сходство их ультратонкой организации с организацией вегетативных клеток В. truncatella, описанной в литературе (Сергеева, 1977; Герасимова и др., 1979). 1) У обоих видов поверхностные слои эктоплазмы формируют продольные гребни, между которыми располагаются ресничные ряды; отмечается сходство в организации пелликулы, клеточных органелл (митохондрии и т.д.), обнаруживаемых в поверхностном слое эктоплазмы; характерно наличие так называемого «альвеолярного» слоя. 2) Эндоплазма чрезвычайно вакуолизирована за счёт обилия пищеварительных вакуолей и многочисленных вакуолей иной природы. 3) Кинетосомы ресничных рядов образуют триады или диады; в случае триад две задние кинетосомы имеют реснички, а в случае диад ресничками обладают обе кинетосомы. Сходство обнаруживается и в ультратонкой организации мембранелл адоральноЙ зоны. 4) Соматическое ядро имеет типичную двойную ядерную оболочку с ядерными порами, а кариоплазма содержит многочисленные мелкие электронно-плотные хроматиновые глыбки и крупные ядрышки различной конфигурации (Сергеева, 1977).
В то же время наблюдаются различия в организации соматического кортекса у вегетативных клеток обоих видов. Так, от проксимальных концов соматических кинетосом вегетативных клеток В. ovata отходят хорошо развитые корневые нити, соединяющиеся с пучком продольных фибрилл (рис. 8). По данным Герасимовой с соавторами (1979), корневые нити у соматических кинетосом вегетативных клеток В. truncatella отсутствуют. Однако для более детального сравнительного анализа организации кортекса вегетативных клеток обоих видов необходимы дополнительные ЭМ исследования.
На фоне рассмотренных в предыдущем разделе данных по организации вегетативных клеток далее будут описаны полученные нами оригинальные материалы по ультраструктурной организации цист покоя. Подавляющее большинство работ по цистам инфузорий посвящено изучению либо формирующихся цист, либо цист через несколько суток или недель после их формирования. Вместе с тем, для понимания механизмов криптобиоза не менее существенно изучение цист и при длительных сроках их хранения — в течение 1 года и более — и сравнение «молодых» и «зрелых» цист. Поскольку в литературе уже имеются данные по ультраструктурной организации «зрелых» цист В. truncatella (Sergejeva et al., 1993; Сергеева, Ливолан, Да Консеикао, Самошкин и др., 1995), мы ограничились исследованием «молодых» (2 сут после формирования) цист В. truncatella. Кроме того, с таксономической точки зрения представляло интерес сравнить цисты В. truncatella и В. ovata примерно одного возраста. Поэтому мы исследовали «зрелые» (около 1 года после формирования) цисты В. ovata, чтобы сравнить результаты с имеющимися литературными данными по «зрелым» цистам В. truncatella. Затем мы представим наши данные по исследованию ядерных телец Ма цист В. truncatella разного возраста.
Ниже мы будем описывать наши данные по «молодым» цистам В. truncatella, сравнивая их с данными литературы по «зрелым» цистам (Sergejeva et al., 1993; Сергеева, Ливолан, Да Консеикао, Самошкин и др., 1995).
Снаружи 2-суточные («молодые») цисты, как и «зрелые» цисты, покрыты защитной оболочкой, состоящей из трёх различных по структуре слоев: экто-, мезо- и эндоцисты (рис. 14—16). У «молодых» цист на поверхности оболочки имеется временный слизистый слой (рис. 15), образующийся на поверхности клетки в процессе инцистирования и полностью отсутствующий в «зрелых» цистах.
Сравнительный морфологический анализ «молодых» и «зрелых» цист покоя в. Truncatella
Выше при описании ультраструктуры Ма «молодых» цист В. truncatella мы указывали на наличие ядерных телец фибро-гранулярной структуры. Этот тип временных ядерных телец (ЯТ) был впервые обнаружен в 1.5-летних цистах В. truncatella и определялся как фибро-гранулярные сферы (Sergejeva и др., 1993, Сергеева, Ливолан, Консейкао, Самошкин и др., 1995). Ниже мы подробно описываем ультраструктуру этих ЯТ и их взаимоотношения с ядрышками и окружающим хроматином в «молодых» цистах В. truncatella. Будут также приведены наши данные по иммуноцитохимическому анализу природы ЯТ в Ма цист В. truncatella разного возраста, как на светооптическом, так и на ультратонком уровнях. ЯТ фибро-гранулярного типа в «молодых» цистах В. truncatella всегда обнаруживались почти рядом или в прямом контакте с ядрышками (рис. 20). Тесный контакт фибро-гранулярных ЯТ с глыбками хроматина был отмечен ранее (Sergejeva и др., 1993; Сергеева, Ливолан, Консейкао, Самошкин и др., 1995). Диаметр таких фибро-гранулярных ЯТ колеблется в пределах 1.5—2 мкм. Все фибро-гранулярные ЯТ состоят из гранул диаметром 26—46 нм и волокон (рис. 24). В свою очередь волокна, толщина которых колеблется между 24 и 28 нм, сформированы из тонких и длинных фибрилл толщиной 5 нм, сильно скрученных по отношению к длинной оси волокон. Следует отметить, что при эксцистировании ЯТ фибро-гранулярного типа в Ма исчезают (Livolant et al., 1993).
Околоядрышковые ядерные тельца другого морфологического типа, отличного от фибро-гранулярных, были нами описаны в Ма цист В. ovata (см. раздел 3.2.2 «Ультраструктурная организация «зрелых» цист покоя В. ovata»). Однако если фибро-гранулярные тельца цист В. truncatella могут предположительно рассматриваться как структуры, соответствующие тельцам Кахала многоклеточных, то структура ЯТ в Ма цист В. ovata скорее наводит на мысль о сегрегации ядрышковых организаторов вследствие резкого снижения интенсивности метаболизма ядрышек в цистах.
К настоящему времени получены убедительные данные о том, что тельца Кахала (ранее обозначавшиеся как скрученные тельца, «coiled bodies»), выявляемые в ядрах многоклеточных эукариот, «представляют собой мелкие ядерные органеллы, которые содержат три эукариотические РНК-полимеразы и ряд факторов, участвующих в транскрипции и процессинге всех типов РНК. Ряд этих факторов, как и субъединицы полимеразы II, после их инъекции в клетку быстро и специфически накапливаются в тельцах Кахала. Предполагается, что комплексы транскрипции и процессинга полимеразы I, полимеразы II и полимеразы III перед их транспортом в сайты транскрипции на хромосомах и в ядрышки предварительно собираются в тельцах Кахала» (Gall, 2001).
Для проведения на светооптическом уровне иммуноцитохимического анализа природы ядерных телец, обнаруживаемых в макронуклеусе цист В. truncatella, нами был использован метод непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания изолированных ядер антителами, специфическими к карбоксильному концу молекулы белка коилина — маркерного белка телец Кахала, к Sm-эпитопу мяРНП и к отличному от мяРНК фактору сплайсинга SC35 (смотри «Материал и методы»).
Были получены следующие результаты: — В макронуклеусах «молодых» (неделя после формирования) и «зрелых» (1 год и 3 мес после формирования) цист были обнаружены немногочисленные окрашиваемые с помощью антител домены, предположительно ядерные тельца (рис. 36). Невыявление ЯТ в Ма «зрелых» цистах других возрастов может быть связано с плохой сохранностью цист или с маскированием немногочисленных ЯТ ядерным материалом и остатками цитоплазмы. — При окрашивании препаратов макронуклеусов с помощью моноклональных антител Y12 не было обнаружено никакой реакции ни на одном из исследованных препаратов, что может говорить или об отсутствии данных факторов мяРНК в исследованных клетках, или о необходимости изменения методических подхода при окрашивании указанными антителами. — При окрашивании препаратов с помощью антител против фактора сплайсинга SC35, только в «зрелых» цистах (1 год 3 мес) была выявлена иммуноцитохимическая реакция; при этом ядра обнаруживали равномерное свечение (иллюстрация не представлена). Гомогенный характер свечения и отсутствие дискретных фокусов флуоресценции может говорить либо о неспецифичности окрашивания, либо об отсутствии данных факторов в ядерных тельцах исследуемых клеток. Однако в проведённых контрольных опытах не было выявлено свечения, следовательно, неспецифическое окрашивание, по-видимому, можно исключить. Для идентификации структур, обнаруживших на светооптическом уровне свечение при окраске антителами, специфичными к карбоксильному концу белка коилина, мы провели дополнительное иммуноцитохимическое электронно-микроскопическое исследование внутриядерных структур макронуклеуса цист В. truncatella разного возраста с использованием тех же антител. В макронуклеусах «молодых» цист, залитых в смесь эпона с аралдитом, метка обнаруживалась преимущественно над внутриядерными структурами фибро-гранулярного типа (рис. 37). При заливке материала в LR White над структурами, соответствующими ядерным тельцам в макронуклеусе «зрелых» цист (подробнее смотри «Материал и методы»), также была обнаружена метка. Однако тонкая структура этих телец на электронно-микроскопических снимках была трудно различима по сравнению с таковой цист, залитых в смесь Эпона с Аралдитом. Итак, нами впервые для инфузорий показано, что ядерные тельца фибро гранулярного типа присутствуют в кариоплазме не только «зрелых» цист В, truncatella, но и в недавно образованных «молодых» цистах. На основании наших светооптических и электронно-микроскопических иммуноцитохимических данных о природе ядерных телец фибро-гранулярного типа судить пока ещё преждевременно. Данные об их биохимическом составе также пока отсутствуют. Однако можно всё же предположить, что они соответствуют тельцам Кахала, обнаруживаемым у многоклеточных организмов.
