Содержание к диссертации
Введение
I Кожа
1. Гистологическое строение кожи 7
2. Диференцировка кератиноцитов 9
3. Базальная мембрана кожи человека 11
4. Рецепторы кератиноцитов к элементам БМ кожи 13
5.Ламинин 21
5.1. Строение и изоформы ламинина 21
5.2. Организация ламининов в БМ кожи человека 25
5.3. Появление ламинина в эмбриогенезе 26
5.4.Ламинин-2/4 27
5.5. Рецепторы ламинина 28
6. Раневое заживление кожи 30
II Миграция клеток 34
1. Молекулярные механизмы миграции 34
2. Факторы, влияющие на миграцию кератиноцитов 36
2.1. Внеклеточный матрикс 36
2.2. Матриксные металлопротеиназы 39
2.3. Ростовые факторы 42
1. Изучение адгезии нормальных и трансформированных кератиноцитов к иммобилизованным на субстрате ламинину-1и ламинину 2/4 53
2. Адгезия с предварительной обработкой клеток ламининами 61
3. Определение миграционной активности клеток, связанных друг с другом межклеточными контактами 63
4. Определение миграционной активности одиночных клеток на различных субстратах 67
5. Изучение вклада интегринов, содержащих В4- и pi- субъединицы, и неинтегринового рецептора 67кДа во взаимодействие клеток с ламинином-2/4 в процессе адгезии 74
6. Изучение вклада интегриновых рецепторов, содержащих р4 и pl-субъединицы во взаимодействие клеток с ламинином-2/4 79
7.Определение участия ММП в процессе миграции клеток линии А431 на ламинине-2/4 под действием ЭФР 83
Обсуждение 86
Выводы 103
Список литературы 104
- Рецепторы кератиноцитов к элементам БМ кожи
- Появление ламинина в эмбриогенезе
- Факторы, влияющие на миграцию кератиноцитов
- Изучение адгезии нормальных и трансформированных кератиноцитов к иммобилизованным на субстрате ламинину-1и ламинину 2/4
Введение к работе
Формирование тканей и органов в процессе эмбриогенеза и регенерации происходит в результате пролиферации, дифференцировки и миграции клеток.
В эмбриогенезе взаимодействие клеток с элементами внеклеточного матрикса (ВКМ) является критическим фактором. ВКМ появляется в эмбриогенезе очень рано, уже на стадии двухклеточного зародыша появляются первые молекулы ВКМ, представленные ccl цепью ламинина, что служит свидетельством важности компонентов ВКМ в процессе развития. По мере развития организма состав матрикса меняется в зависимости, как от стадий развития, так и от мест локализации в зародыше. Эти изменения являются результатом деятельности эмбриональных клеток. В свою очередь, определенный набор компонентов ВКМ стимулирует миграцию клеток в эту область и влияет на формирование и характер организации специализированных структур тканей.
Регенерация утраченных или поврежденных органов и тканей также идет с участием ВКМ. Процесс заживления кожных ран неразрывно связан с миграцией в поврежденный участок клеток кожи (фибробластов и кератиноцитов), образованием базалыгай мембраны (БМ) и последующим восстановлением нормальной структуры ткани. Миграция клеток определяется субстратом и сигнальными молекулами. Сигнальные молекулы приводят клетки в состояние готовности к передвижению, а субстрат позволяет осуществить сложный двигательный процесс.
Процесс взаимодействия клетки с субстратом является определяющим фактором также при культивировании клеток. Для успешного размножения клетки должны сначала прикрепиться и распластаться на подложке. Поэтому для нормального роста и дифференцировки большинства первичных культур клеток необходим определенный субстрат, который складывается из элементов, предварительно нанесенных на подложку, элементов, адсорбируемых из культуральной среды и тех, которые секретируются самими клетками. Подбирая состав культуральной среды и элементов подложки, можно воссоздавать микроокружение клеток и моделировать некоторые аспекты поведения клеток in vivo. Применение подобных подходов дало толчок развитию клеточной заместительной терапии.
5 Клеточная заместительная терапия - это одно из направлений современной медицины, цель которой состоит в восстановлении структуры и функций поврежденной ткани путем трансплантации клеток, выращенных in vitro. Наибольшее развитие это направление получило в терапии кожных повреждений. В качестве кожных заместителей используют как сами клетки кожи (кератиноциты и фибробласты), так и комплексы клеток с элементами ВКМ. Использование белков ВКМ важно с двух точек зрения, во-первых, это позволяет создать при культивировании клеток микроокружение, характерное для определенного типа клеток, во-вторых, при трансплантации на рану элементы ВКМ могут стимулировать миграцию и пролиферацию собственных клеток пациента и, тем самым, способствовать быстрейшему закрытию раны. В этой связи изучение взаимодействий клеток кожи с элементами ВКМ является одним из важных вопросов регенеративной медицины.
В настоящее время в литературе имеется много данных о взаимодействии кератиноцитов с белками ВКМ. Тем не менее, практически полностью отсутствуют данные о влиянии на процессы адгезии и миграции ламинина-2/4, входящего в состав ВКМ кожи. Поэтому целью данной работы было выяснить, как влияет ламинин-2/4 на процессы адгезии и миграции нормальных и трансформированных кератипоцитов. А также установить, какие рецепторы принимают участие в осуществлении этих процессов.
Рецепторы кератиноцитов к элементам БМ кожи
Основным классом клеточных рецепторов к элементам ВКМ являются интегрины (Hynes, 1992). Интегрины представляют собой гетеродимеры, состоящие из а и р субъединиц. Субъединицы а варьируют в размерах 120-189 кДа и нековалентно связаны с (3 субъединицами, масса которых 90-110 кДа. Известно 8 Р субъединиц и 15 а субъединиц. Хотя комбинации этих субъединиц могут давать более 100 вариантов, на самом деле их число ограничено (известно около двадцати интегринов), так как многие а субъединицы могут взаимодействовать только с определенной (3 субъединицей. По типу Р субъединиц выделяют подклассы этого семейства рецепторов. Отдельные лиганды, как правило, узнаются более чем одним интегрином. В свою очередь, один интегрин может присоединять несколько лигандов. Специфичность определенного интегрина также зависит от типа клеток. В таблице 2 представлены известные интегрины с указанием их лиганд-специфичности к разным белкам ВКМ. Большинство интегринов узнают последовательность Arg-Gly-Asp (RGD), такую последовательность имеет коллаген, ламинин, фибронектин, витронектин и другие белки матрикса. Но не всегда взаимодействие интегринов с лигандами является RGD опосредованным (Ruoslahti, 1996).
Каждая субъединица интегрина имеет большой глобулярный внеклеточный домен, трансмембранный домен и короткий (до 50 а.к.) цитоплазматический домен. Внеклеточный домен присоединяется к белкам ВКМ, а цитоплазматический домен связывается с белками цитоскелета. Таким образом, интегрины обеспечивают механическую и информационную связь между внеклеточным и внутриклеточным пространствами.
Сила взаимодействия (аффинность) рецепторов клеточной адгезии с нерастворимым элементом ВКМ намного ниже силы взамодействия рецепторов с растворимыми факторами. Типичный интегриновый рецептор для ВКМ имеет, например аффинность 10 М, в то время как аффинность рецептора эпидермального фактора роста составляет 7х10"ш М. Общая сила взаимодействия клетки с субстратом зависит от аффинности индивидуальных рецепторов и количества рецепторов, вовлеченных в адгезию. Количество гликопротеинов клеточной поверхности составляет приблизительно 50% массы всей мембраны, поэтому у каждой клетки есть огромный набор рецепторов для тысячи различных лигандов, к тому же рецепторы определенного вида могут быть представлены тысячами копий, Например, каждый фибробласт имеет около 500 000 рецепторов для фибронектин а. Имея такое широкое разнообразие интегриновых рецепторов, клетка может изменять свои адгезивные свойства путем селективного синтеза интегринов.
Интегрины можно разделит на разные категории в зависимости от того, постояшю ли они существуют на поверхности кератиноцитов или появляются при патологических состояниях и повреждении кожи, большим ли числом копий они представлены или имеются в небольших количествах (Таблица 3). Наиболее многочисленными и постоянными инте гринами клеток эпидермиса являются интегрин cc2pi (коллагеновый рецептор), ссЗрі (преимущественно присоединяет ламинин-5) и абр4 (ламининовый рецептор) (Watt, Hertle, 1994). Интегрин avP5 также относится к постоянным рецепторам, но синтезируется на низком, по сравнению с другими рецепторами, уровне (Adams, Watt, 1991).
Интегрин cc5pl (рецептор фибронектина) и avp6 (рецептор фибронектина и витронектина) появляется при раневом заживлении кожи и в условиях культивирования (Breuss, 1995, Zambruno et aL, 1995). Интегрин xvp6 часто синтезируется в клетках чешуйчатой карциномы и опухолях кожи (Jones et al., 1997) . Интегрин a9pi (рецептор для тенасцина) обнаружен в неповрежденном эпителии, но его синтез изменяется при повреждении кожи (Stepp et аі., 1995, Hakkinen et al., 2000). Также в эпидермисе были найдены интегрины a8pi (Schapp et al., 1995), который является рецептором для тенасцина, фибронектина и витронектина и интегрин avp8 (Nishimura et al., 1994), который присоединяет витронектин. Интегрин a8pl находится в области мышцы, поднимающей волос, а интегрин avpS, в отличие от всех других интегринов кератиноцитов, отсутствует в базальном слое эпидермиса и появляется только в супрабазальных слоях (Stepp, 1999).
В нормальном неповрежденном эпидермисе интегрины синтезируются клетками базального слоя и клетками наружного корневого влагалища волосяных фолликул. Интегрин абр4 локализуется в зоне, граничащей с базальной мембраной, и является компонентом полудесмосом, в то время как другие интегрины распределены по базальной, латеральным и апикальной поверхностям клеток (Watt, Hertle, 1994). In vitro интегрин a6p4 находится в составе рудиментарных полудесмосом и на лидирующем крае мигрирующих клеток (Adams, Watt, 1991, Mercurio et al., 2001). Интегрины с pi-субъединицей в основном находятся в фокальных контактах и образуют кольцо по периферии клеток (Braga et al., 1998).
Появление ламинина в эмбриогенезе
Синтез ламининовых цепей является тканеспецифичным и зависит от стадии развития организма, одни цепи синтезируются клетками как мезенхимного, так и эпителиального происхождения, другие - только эпителиального (Tiger, 1997, Thomas, Dziadek, 1993). Синтез ламининовых цепей начинается на самых ранних стадиях эмбриогенеза и необходим для нормального развития эмбриона. На стадии 2-4 клеточного зародыша у мыши уже присутствуют pi и yl цепи (Dziadek, Timpl, 1985), а на стадии 16 клеток появляется БМ и присутствуют все три цепи ламинина-1. Ламинин-1 играет важную роль в эпителиально- мезенхимных взаимоотношениях (Ekblom, 1996) и делеции в гене LAMC1 препятствуют образованию БМ и нарушают развитие эмбриона. На поздних стадиях развития а 1 цепь синтезируется в местах контакта эпителия с соединительной тканью. Цепь al синтезируется как эпителиальными клетками, так и мезенхимными, в то время как а2 цепь ламинина-2 является продуктом только мезенхимных клеток (Schuger et al., 1997). Экспрессия цепей аЗ, рЗ, у2 ламинина-5 обнаруживается на 7 неделе развития эмбриона человека. Синтез цепей ламинина-5 ограничен эпителиальными клетками, цепь а4 ламинина-4, в основном, эндотелиального происхождения (АшпаШеу, Rousselle, 1999). Цепи pi, Р2, yl а5, наоборот, являются продуктом широкого спектра клеток (Tiger et аі., 1997). Интересно, что а5 цепь ламинина-10 синтезируется в зрелых эпителиях, где отсутствует al цепь ламинина-1 (Ekblom, 1996). Первоначально, в период открытия ламининов и активного изучения их распространения в тканях, многие авторы сообщали о присутствии ламинина-1 в кожи животных и человека (Engvall et al., 1990, Sanes et al., 1990, Burgeson et al, 1994). Но позднее было доказано, что антитела 4С7, с помощью которых идентифицировали al цепь ламинина-1, на самом деле взаимодействуют с а5 цепью ламинина-10 (Tiger et al., 1997, Church and Aplin,1998).
Основываясь на исследованиях экспрессии мРНК, соответствующих аЗ, а5, pi, р2, yl и у2 цепям, можно сделать вывод, что в базально-эпидермальном соединении содержатся ламинин-5, ламинии-6 и ламинин-10 (АшпаШеу, RousseIle,1999) (Рис.4). Позднее в дермально-эпидермальном соединении была найдена еще одна изоформа ламинина, содержащая а2 цепь - ламинин-2\4 (Sewry et al., 1996а, Monical, Kefalides, 1994).
Ламинин-2\4 представляет собой комплекс из ламинина-2 (a2Rlyl) и ламинина-4 (a2p2yl). О роли этой изоформы в морфогенезе кожи известно мато. Ламинин-2 имеет в своем составе три цепи, две из которых (pi, yl) идентичны соответствующим цепям ламинина-1, а третья (а2)- гомологична по доменному составу и на 50 % -по аминокислотной последовательности цепи al (Vuolteenaho et al., 1994). Цепи 82 и pi , несмотря на высокую гомологию, также имеют отличия в аминокислотных последовательностях (Durkin et al., 2001). Лам инин -2\4 изначально был обнаружен в составе мембран скелетных и сердечных мышц и Швановских клеток (Leivo, Engvall,1988, Vuolteenaho et al., 1994), Мутации в гене, кодирующем а2 цепь ламинина, становятся причиной различных нервно-мышечных заболеваний (Sewry et al., 1996а, Tiger et al., 1997,
Morandi et al., 1999). Исследования показали, что ламинин-2/4 участвует в регенерации периферических нервов: вызывает рост аксонов и миграцию Швановских клеток (Anton et al., 1994). Наличие ламинина-2/4 небходимо при миогенезе: если ламинин-1 вызывает образование мышечных волокон, то ламинин-2/4 обеспечивает их стабильность (Vachon et al., 1996). У больных с врожденной мышечной дистрофией отсутствие а2 цепи ламинина в скелетных мышцах сопровождается его отсутствием в коже, что служит надежным диагностическим признаком (Sewry et al., 1996b), но при этом нет никаких данных о структурных нарушениях в коже. По-видимому, отсутствие ламинина-2/4 в коже не сказывается непосредственно на ее структуре, но может повлиять на развитие таких патологических процессов, как опухолевая инвазия и реэпителизация после повреждения. Известно, что опухолевые клетки с высоким метастатическим потенциалом секретируют больше ламинина-2\4, чем клетки с низким метастатическим потенциалом (Jeng et al., 1994). В основе процессов опухолевой инвазии и реэпителизации лежит способность клеток к миграции.
Клетки взаимодействуют с ламининами посредством рецепторов, как интегриновой, так и неинтегриновой природы. Среди интегринов способностью взаимодействовать с ламинином обладают следующие рецепторы: аїрі, а2рі, аЗрІ, аб04, абрі, cc7pl, а9рї и avpl (Mecham, 1991, Aumailley et al., 1996). Среди них рецепторы а6р4, абрі, а7рі связываются только с ламинином, в то время как остальные служат рецепторами и для других элементов ВКМ.
Несколько мест связывания с клетками было идентифицировано сначала на ламинине-1, а затем и на других изоформах (Aumailley et al., 1996). Основным местом связывания для всех изоформ ламинина являются С- концевые глобулярные домены (Рис.З ). Хотя интегрины присоединяются к глобулярным доменам, присутствие линейной трехцепочечной спирали является необходимым условием для взаимодействия интегринов с ламининами-1, -2 , -4 и -5. Для некоторых изоформ N-концевая область узнается классическими коллагеновыми рецепторами аїріи а2рі.
Кроме интсгринов, во взаимодействии с ламининами принимают участия и некоторые неинтегриновые рецепторы. Наиболее изученными из них являются а-дистрогликан и рецептор ламинина с молекулярной массой 67 кДа (67 кДа ЛР). а-дистрогликан является внеклеточным компонентом целого комплекса, в который входят 5 трансмембранных элементов (Р-дистрогликан, а, р, у-саркогликаны, и 25 кДа белок) (Campbell, 1995). р-дистрогликан взаимодействует с внутриклеточным белком дистрофином, который, в свою очередь, связывается с актином (Ekblom, 1996). Дистрогликан первоначально был выделен из мышц как рецептор к компоненту БМ мышечной ткани - ламинину-2. Нарушение этих взаимодействий является одной из причин мышечной дистрофии (Campbell, 1995). Взаимодействие ламинина-2 с дистрогликаном осуществляется через фрагмент ЕЗ молекулы ламинина, через это же место связывания дистрогликан взаимодействует с ламинином-1 (Ekblom, 1998). Дистрогликан имеет широкое распространение в тканях эмбриона и взрослого организма. Кроме мышц дистрогликан эспрессируется в нервных тканях и в районе БМ многих эпителиев (Durbeej et ah, 1995, 1998). Ламини новый рецептор с молекулярной массой 67 кДа экспрессируется в основном клетками опухолевого происхождения (Mecham, 1991). Этот рецептор специфически взаимодействует с последовательностью YIGSR, которая находится в домене III pi цепи ламинина (Graf et ah, 1987). Кроме перечисленных рецепторов, с ламинином также взаимодействуют белок скелетных мышц аспартактин (66 кДа), кранин (ПО кДа) и рецепторы семейства лектинов (Mecham, 1991).
Факторы, влияющие на миграцию кератиноцитов
В процессе раневого заживления наблюдается последовательная смена набора элементов внеклеточного матрикса от исходного сгустка крови до матрикса восстановленного кожного покрова. Последовательные изменения функциональной активности кератин оцитов в ходе реэпителизации в значительной степени регулируются различными компонентами ВКМ. Коллаген.
Коллагены - семейство гликопротеинов, молекулы которых состоят из 3-х а цепей, скрученных в спираль, В зависимости от структуры, различают фибриллярный коллаген (1,П,Ш тип), не фибрилярный коллаген (IV тип) и FACIT коллаген (fibril-associated collagen with interupted triple helices). Идентифицировано 32 различных а цепи, 17 из них обнаружены в коже.
Коллагены I и III типа являются основными компонентами дермы кожи человека. Коллаген I типа составляет 80 % всего коллагена дермы и несет на себе всю механическую нагрузку. Коллаген Ш типа появляется в начальной фазе раневого заживления, а позднее замещается коллагеном I.
Коллаген I типа является примером матрикса, контакт с которым стимулирует миграцию кератиноцитов. Сравнение кератиноцитов с клетками различного происхождения (фибробласты человека, эндотелиоциты, меланоциты, клетки меланомы и саркомы) показало, что кератиноциты образуют удивительно длинные и прямолинейные миграционные треки, что соответствует большой скорости миграции (Chen et аі., 1994а).
Коллаген IV типа относится к не фибриллярным коллагенам, его молекулы формируют трехмерную сеть в базальной мембране. Коллаген IV типа также стимулирует миграцию кератиноцитов (Kim et аі., 1994). Взаимодействие осуществляется через Hep Ш домен внутри спиральных доменов молекулы. Кератиноциты используют а231 интегриновый рецептор при миграции на коллагене IV и блокирование функции этого рецептора ингибирует клеточное перемещение (Kim et аі., 1994).
Коллаген VII типа является компонентом крепящих филаментов, которые осуществляют связь между базальной мембраной эпидермиса и сосочковым слоем дермы. Синтез коллагена и образование крепящих филаментов относятся к поздним событиям кожной репарации. Восстановление адгезивных комплексов в коже после се реэпителизации может тянуться от нескольких месяцев до года (Woodley et al., 1990). Прямых данных о влиянии коллагена VII типа на миграцию кератиноцитов in vitro нет. Но есть данные, что кератиноциты, выделенные из кожи больных эпидермуллозной буллозой, у которых имеется мутация в гене, кодирующем коллаген VII , обладают гипермобильными способностями. При трансфекции немутаїггного гена, эти способности возвращаются к нормальному уровню (Chen et al., 2000). Фибронектин,
Фибронектин это гл и ко протеин с молекулярной массой 440 кДа, состоящий из двух идентичных цепей, связанных дисульфидными мостиками. После образования раны фибронектин становится основным компонентом временного матрикса, по которому кератиноциты мигрируют для закрытия раневой поверхности. Внутри фибронектиновой молекулы было идентифицировано множество биологически активных доменов. Кератиноциты прикрепляются к фибронектину посредством двух интегринов a5pl (классический рецептор фибронектина) и аЗрЧ, При добавлении в среду к мигрирующим кератиноцитам антител к а5рі интегрину или RGD пептида, миграция драматически блокировалась (Kim et al., 1992а). Ламинин.
Среди различных изоформ ламинина, их влияние на миграционные свойства кератиноцитов изучены хорошо только на двух изоформах: на ламинине-1 и ламинине-5. Известно, что ламинин-1 является слабоадгезивным субстратом для кератиноцитов и ингибирует процесс миграции эпидермальных клеток на коллагене (Adams, Watt, 1993; Woodley et al., 1988).
Влияние ламинина-5 на миграцию кератиноцитов зависит от целого ряда факторов и меняется как при процессинге молекулы, так и в результате протеолиза. Более подробно эти изменения будут рассмотрены в следующем пункте.
Протеолиз белков внеклеточного матрикса осуществляют тканевые сериновые протеазы и семейство матриксных металлопротеиназ (ММП). ММЛ -семейство цинковых металлопротеиназ, названных матриксными за способность осуществлять специфический протеолиз всех основных белков матрикса (Соловьева, 1998). По своей структурной организации и субстратной специфичности они объединены в несколько подсемейств: коллагеназы, желатиназы, стромелизины и группа неклассифицированных ММП. Металлопротеиназы в ране секретируются клетками различного происхождения и включают в себя как секретируемые протеиназы, так и протеиназы мембранного типа (МТ-ММП) Несмотря на то, что сериновые протеазы, также как и многие члены семейства ММП, секретируются в окружающие ткани, протеолитические события ограничены, в основном, околоклеточным пространством. Подобная локализация позволяет контролировать процессы протеолиза и обеспечивается разнообразными механизмами взаимодействия протеиназ с поверхностью клетки.
Разнообразны биологические функции матриксных протеиназ и процессы, в которые они вовлечены. Экспрессия ММП в нормальных тканях находится на низком уровне, но заметно возрастает в ситуациях, связанных с активными перестройками тканей и клеточной миграцией, таких как морфогенез, заживление ран и хроническое воспаление (Salo et al.,1994, Parks,1995, Vaalamo et al., 1997).Особую роль ММП играют в опухолевых инвазиях и метастазировании. В последнее время накопилось много фактов о том, что миграция клеток кожи -кератиноцитов, фибробластов и эндотелиальных клеток в процессе раневого заживления опосредована действием протеиназ, расщепляющих белки ВКМ.
Изучение адгезии нормальных и трансформированных кератиноцитов к иммобилизованным на субстрате ламинину-1и ламинину 2/4
Адгезивные свойства ламинина определяли, используя стандартные методы адгезии в 96-луночных платах, покрытых исследуемыми белками. Для начала предстояло определить оптимальную концентрацию ламинина в растворе, при которой прикрепляется максимальное количество клеток. Основываясь на литературных данных по адгезии клеток к различным субстратам (Karecla et al., 1994), были взяты следующие концентрации ламинина-2/4: 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл и 40 мкг/мл. Для выбора оптимальной концентрации использовали клетки линии А431. Как видно на рис.6 через 1 ч инкубации количество клеток, прикрепившихся в вариантах, где концентрация ламинина была 10, 20 и 40 мкг/мл, достоверно не отличалось друг от друга. Количество клеток при концентрации ламинина 5 мкг/мл было значительно меньше. Так как ламинин-1 и ламинин-2/4 являются изоформами со сходными характеристиками (молекулярный вес, гидрофобные и гидрофильные области и т.д.), то отдельно для ламинина-1 оптимальная концентрация не определялась, обе изоформы использовали в работе в концентрации 20 мкг/мл. В используемой модели адгезии процесс взаимодействия клетки с субстратом включает несколько этапов: контакт суспензионных клеток с иммобилизованными на подложке молекулами, распознавание имеющимися на клеточной поверхности рецепторами специфических мест связывания молекул белка, которое приводит к образованию лигад-рецепторных комплексов и распластыванию клеток на субстрате. Прикрепление клеток может сопровождаться синтезом дополнительных адгезивных молекул, необходимых для ее нормального функционирования или экспонированием на клеточной поверхности необходимого количества рецепторов. На кератиноцитах человека было показано, что синтез компонентов матрикса начинается уже через 30 мин после прикрепления (Zhang and Kramer, 1996), Таким образом, адгезивные характеристики того или иного субстрата отражают суммарный ответ клетки на контакт с ним и показывают степень специфичности этих взаимодействий. Время, необходимое для прикрепления и распластывания, определяется типом и состоянием клеток. Ранее было показано, что время, необходимое для распластывания клеток линии А 431 на субстрате, покрытом адгезивными молекулами, составляет 30-40 мин (Аре с соавт., 1999). Для культивируемых кератиноцитов и клеток А 431 мы выбрали в качестве сроков адгезии 30 мин, 1 ч и 2 ч. Для кератиноцитов первичной культуры оптимальные сроки инкубации составили 4 ч и 8 ч (столь долгие сроки прикрепления, по-видимому, объясняются повреждением клеток при выделении). Ксратиноцитами первичной культуры называются клетки, свежевыделенные из эпидермиса (Pilcher et al., 1997а). Они лишены миграционной активности. Способность к миграции появляется при раневых процессах in vivo (Takashima et al., 1986) и при культивировании in vitro (Takashima, Grinnell, 1985). Эта способность является результатом изменения состава интегриновых рецепторов и их активации в процессе культивирования (Toda et al., 1987, Guo et al., 1990). Поэтому в дальнейшем, чтобы различать выделенные из ткани кератиноциты и кератиноциты, растущие в культуре, далее в работе будут использованы обозначения "кератиноциты первичной культуры" и "культивируемые кератиноциты".
Большинству клеток для прикрепления и роста необходима подложка. Клетки постоянных клеточных линий, как правило, сами синтезируют необходимые адгезивные белки, в то время как для успешного культивирования клеток первичных культур требуется присутствие специфического для них матрикса. При культивировании кератиноцитов человека в качестве такой подложки используют матрикс, синтезируемый фидерными клетками -фибробластами (Rheinwald, Green, 1975). В составе такого матрикса преобладают цепи коллагена (Alitalo et al., 1982). Использование мономерного коллагена I типа, полученного из сухожилий хвостов крыс дает такой же положительный эффект для прикрепления и роста кератиноцитов. Коллаген I является преобладающим компонентом ВКМ кожи и является естественным адгезивным субстратом для кератиноцитов. Поэтому в опытах по адгезии первичных кератиноцитов мы использовали коллаген I типа в качестве положительного контроля для оценки адгезивных свойств ламинина. В качестве негативного контроля использовали БСА. Данные по адгезии кератиноцитов первичной культуры представлены на рис.7. Обнаружены различия в прикреплении клеток к исследуемым изоформам ламинина. Через 4 ч после посева количество кератиноцитов первичной культуры, прикрепившихся к ламинину-2/4 достоверно не отличалось от количества клеток на ламинине-1 .Через 8 ч различия в прикреплении клеток к изоформам ламинина стали достоверными. Однако, па обоих сроках количество кератиноцитов, прикрепившихся на коллаген, было достоверно больше, чем на ламинин-2/4 (в 2 раза через 4 ч инкубации и в 1,2 раза через 8 ч).
