Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 16
1.1 Современные представления об исследуемой проблеме 16
1.2 Опухолевые стволовые клетки мультиформной глиобластомы 23
1.3 Стволовые клетки в лечении опухолей головного мозга 33
1.4 Существующие подходы к лечению глиальных опухолей мозга с использованием клеточных технологий 41
2 Материалы и методы 50
2.1 Опухолевые клетки различных типов 51
2.2 Методы исследования миграции стволовы и соматических клеток млекопитающих к клеткам глиомы линии С6 in vitro 52
2.3 Методы исследования особенностей миграции стволовых клеток человека к клеткам злокачественных опухолей in vitro 53
2.4 Методы исследования механизмов миграции клеток in vivo 54
2.5 Методы фармакологического тестирования in vitro и in vivo 56
2.6 Иммуноцитохимические исследования клеток в культуре 58
2.7 Методы окраски клеток флуоресцентными красителями 59
2.8 Методы морфологического и иммуногистохимического исследования 60
2.9 Метод цитофлуориметрии 61
2.10 Методы изучения противоопухолевого действия стволовых клеток in vitro и in vivo 66
2.11 Методы сравнительного исследование клеточных протеомов... 68
2.12 Методы изучение воздействия TGF - 1 на клетки линии U глиобластомы человека
2.13 Методы иммуноферментного анализа 73
2.14 Статистическая обработка результатов 73
Результаты собственных исследований
3 Анализ взаимодействия стволовых и опухолевых клеток in vitro 74
3.1 Закономерности миграции нейральных и гемопоэтических стволовых клеток к опухолевым клеткам различных линий in vitro 74
3.1.1 Миграция стволовых клеток млекопитающих в сочетанных культурах с клетками различных линий in vitro 74
3.1.2 Миграция стволовых клеток человека в сочетанных культурах с клетками злокачественных опухолей различных линий in vitro
3.2. Взаимодействие стволовых клеток человека с клетками злокачественных опухолей in vitro 82
3.2.1 Взаимодействие гемопоэтических стволовых клеток с на модели глиомы линии С6 in vitro 88
3.2.2 Взаимодействие гемопоэтических стволовых клеток с клетками злокачественных опухолей человека 92
3.3 Обсуждения результатов главы 3 98
3.3.1 Обсуждение результатов исследования миграции нейральных и гемопоэтических стволовых клеток к опухолевым клеткам различных линий in vitro 98
3.3.2 Обсуждение результатов исследования взаимодействие стволовых клеток человека с клетками злокачественных опухолей in vitro 102
4 Анализ взаимодействия стволовых и опухолевых клеток in vivo
4.1.1 Общая характеристика экспериментальной модели глиобластомы in vivo 109
4.1.2 Морфологические свидетельства миграции гемопоэтических стволовых клеток в опухолевый очаг 114
4.1.3 Морфологические свидетельства миграции нейральных стволовых клеток в зону неоплазии 122
4.1.4 Обсуждение результатов исследования миграции гемопоэтических и нейральных стволовых клеток в опухолевый очаг на модели мультиформной глиобластомы in vivo 125
4.2. Взаимодействие трансплантированных стволовых клеток с клетками глиомы С6 в опухолевом очаге 127
4.2.1 Морфологическая характеристика опухолевых узлов в головном мозге крыс контрольной группы 127
4.2.2 Морфологическая характеристика опухолевых узлов в головном мозге крыс группы клетки 139
4.2.3 Иммуногистохимическое исследование ткани опухоли после введения гемопоэтических стволовых клеток 142
4.2.4 Иммуноферментный анализ экспрессии цитокинов в опухоли и прилегающей ткани мозга после введения стволовых клеток 156
4.2.5 Обсуждение результатов исследования взаимодействия трансплантированных стволовых клеток с клетками глиомы С6 в опухолевом очаге 158
5. Модификация гемопоэтических стволовых клеток как способ усиления их противоопухолевого потенциала 160
5.1 Изучение особенностей и механизмов действия фаскаплизина в отношении клеток глиомы С6 in vitro 162
5.2 Сопоставление in vitro эффективности фаскаплизина и стандартных средств фармакотерапии глиальных опухолей 168
5.3 Сравнительная эффективность традиционной терапии темозоломидом и адресной доставки фаскаплизина в очаг глиомы in vivo 169
5.4 Подбор концентраций фаскаплизина, вызывающих модификацию стволовых (CD34+) клеток in vitro 172
5.5. Сокультивирование модифицированных гемопоэтических стволовых клеток с клетками глиомы С6 175
5.6 Сравнение противоопухолевой эффективности нативных и модифицированных фаскаплизином ГСК in vivo 178
5.7 Сопоставление уровней экспрессии ключевых цитокинов в ткани мозга крыс после введения модифицированных стволовых клеток 190
5.8 Обсуждение результатов модификации гемопоэтических стволовых клеток как способа усиления их противоопухолевого потенциала 193
6 Сравнительный анализ протеомов опухолевых и стволовых клеток человека 200
6.1 Сравнительный анализ протеомов клеток линии U87
глиобластомы человека до и после стимуляции TGF- 1 201
6.1.1 Анализ биологического значения белков клеток линии U87 203 глиобластомы человека значительно увеличивших уровень синтеза после стимуляции TGF- 1 202
6.1.2 Анализ биологического значения белков клеток линии U87 значительно снизивших уровень синтеза после стимуляции TGF-1 204
6.1.3 Анализ изменений экспрессии белков глиобластомы U87 в после стимуляции TGF-1 в пределах функциональных кластеров 206
6.2 Сравнительный анализ протеомов опухолевых стволовых CD133+
клеток глиобластомы, нейральных CD133+ и мезенхимальных CD29+ CD44+ CD73+ CD90+ СD34– стволовых клеток человека 214
6.2.1 Распределение белков на функционально значимые кластеры 215
6.2.2 Прецизионный анализ протеомных профилей сравниваемых клеток 218
6.3 Обсуждение результатов главы 6 219
8. Заключение 225
9. Выводы 249
10. Список литературы
- Стволовые клетки в лечении опухолей головного мозга
- Методы исследования особенностей миграции стволовых клеток человека к клеткам злокачественных опухолей in vitro
- Миграция стволовых клеток млекопитающих в сочетанных культурах с клетками различных линий in vitro
- Иммуногистохимическое исследование ткани опухоли после введения гемопоэтических стволовых клеток
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Мультиформная глиобластома (МГБ) – одна из самых распространённых злокачественных опухолей головного мозга (Brodbelt, 2015; Dolecek, 2013; Louis, 2014). Стандартное лечение включает хирургическую операцию, облучение и химиотерапию (Коновалов, 2009; Hwang, 2012). Прогноз болезни неблагоприятный, медиана выживаемости больных 6 - 12 мес (Omuro, 2013; Stupp, 2010; Son, 2013). Одна из ведущих причин терапевтической резистентности МГБ (Aposoli, 2016; Kobayashi, 2008; Piccirillo, 2010) связанна с наличием в составе клеточной популяции МГБ опухолевых стволовых клеток (ОСК), обладающих уникальными сигнальными и морфогенными свойствами.
ОСК занимают ведущие место в иерархии клеточной популяции МГБ (Chen,2010; Lin, 2010). Клетки этого типа иммортализованны, в максимальной степени независимы от внешних сигналов, обладают мультипотентностью, самой высокой пролиферативной активностью среди всех клеток МГБ, способностью к самообновлению и восстановлению поврежденной ДНК (Bao? 2006; Apostoli, 2016 ). ОСК взаимодействуют как с общим пулом клеток МГБ, так и с клетками других типов, рекрутируемых опухолью – микроглиоцитами, клетками эндотелия кровеносных сосудов, фибробластами, моноцитами и иммунными клетками (Charles, 2012; Godlewski, 2015; Golebiewska, 2013, Hambardzumyan, 2016), что делает эту цель практически не доступной для поражения с применением существующих методов и технологий (Chen, 2015). В свою очередь, способность ОСК к взаимодействию с патологически измененным внеклеточным матриксом позволяет клеткам этого типа исключительно быстро запустить процессы пролиферации и инвазивного роста, ведущих к рецидиву опухоли и смерти больных МГБ.
Указанные обстоятельства требуют разработки принципиально новых подходов к терапии МГБ, одним из которых является применение собственных стволовых клеток (СК) больного. Стволовые и прогениторные клетки различных типов составляют значительную часть клеточного пула рекрутируемого МГБ из кровеносного русла и окружающих тканей. Наличие у СК противоопухолевых свойств активно обсуждается с 1960-х гг, однако четкие представления о закономерностях и механизмах взаимоотношения СК с клетками глиальных опухолей на сегодняшний день практически отсутствуют.
Не менее важным препятствием на пути внедрения клеточных технологий в протоколы лечения больных МГБ является необходимость предварительной модификации СК, что до недавнего времени было возможно только путем внесения изменений в клеточный геном (Xie, 2013). Альтернативой методу генной инженерии является модификация СК посредствам предобработки
индукторами апоптоза, что с одной стороны расширяет спектр линий СК потенциально применимых для лечения МГБ, с другой, позволяет использовать такие клетки для регуляции инвазивных и пролиферативных свойств ОСК глиобластомы.
Как известно, ОСК – это гетерогенная клеточная популяция (Dahlrot, 2013), однако инвазивный рост МГБ связывают с ОСК мезенхимального субтипа (Binda, 2012; Brown, 2015). Между другими клетками МГБ и мезенхимальным субклоном возможен пронейрально-мезенхимальный переход (ПМП) который принято считать одним из ключевых процессов комплексной программы инвазивного роста. На моделях солидных опухолей (Muthusamy, 2015) показана ведущая роль в этом событии трансформирующего фактора роста-1 (TGF -1), продуцируемого «секреторными ансамблями» образуемыми ОСК (Ratajczak, 2013) в тесном взаимодействии с другими опухолевыми клетками и их микроокружением. Теоретически, модифицированная СК способна разрушить стереотипные схемы межклеточной коммуникации в опухолевом очаге и препятствовать ПМП, исключив основное событие, ведущее к инвазии, диссеминации и генерации новых субпопуляций ОСК, что обеспечит формирование стойкой ремиссии, улучшит выживаемость больных МГБ.
Помимо регуляции межклеточных взаимоотношений в опухолевом очаге модифицированная СК способна оказать влияние на взаимодействие ОСК с межклеточным матриксом, что является одним из ключевых механизмов регуляции численности этого типа клеток (Chen, 2015). Мишени для регуляции этого процесса, очевидно, следует искать в самой природе ОСК. В последние годы, в качестве основного источника этого типа клеток рассматриваются собственные СК организма человека (Rispoli, 2014), вследствие чего их потомки (ОСК) не распознаются и не уничтожаются иммунной системой больного . В этой связи, потенциальными целями для воздействия на ОСК должны стать мембранные белки, связанные с внутриклеточными путями сигнальной трансдукции, ответственными за управление ключевыми функциями всех типов СК человека, и при этом не пострадавшими в процессе трансформации нормальной стволовой клетки в ОСК. Идентификация таких мишеней требует сравнительного изучения метаболических (протеомных) карт нормальных тканеспецифических стволовых клеток и ОСК, что возможно только с использованием современных технологий клеточной биологии.
Цель работы: Изучить взаимодействие и взаимовлияние постанатальных стволовых и опухолевых клеток, и обосновать возможность создания новых молекулярно-биологических подходов к терапии мультиформной глиобластомы.
Задачи исследования: 1. Изучить закономерности взаимодействия стволовых и опухолевых клеток in vitro;
-
Изучить взаимоотношение трансплантированных стволовых клеток с опухолевыми клетками на модели МГБ in vivo;
-
Разработать способ модуляции противоопухолевого потенциала стволовых клеток и показать его эффективность на модели МГБ in vitro и in vivo
-
Провести протеомный анализ клеток глиобластомы линии U87 до и после стимуляции трансформирующим ростовым фактором - 1 и установить его роль в механизмах пронейрально-мезенхимального перехода;
-
Провести сравнительное картирование и биоинформационный анализ протеомов нейральных, мезенхимальных стволовых клеток человека и ОСК глиобластомы человека, и выявить внутриклеточные пути сигнальной трансдукции, пригодные для таргетного регуляторного воздействия на ОСК.
Научная новизна. Впервые с использованием современных методов молекулярной и клеточной биологии изучены закономерности миграции СК к клеткам различных линий in vitro. Установлено, что миграция нейральных стволовых клеток (НСК) к CD133+ клеткам глиобластомы более выражена по сравнению с их подвижностью в отношении клеток иного происхождения. Показано, что после внутривенного введения интактным животным гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) распределяются в мозге диффузно, а НСК мигрируют преимущественно в субвентрикулярную зону головного мозга. У животных с экспериментальной глиобластомой трансплантированные стволовые клетки (как НСК, так и ГСК) мигрируют в опухоль и накапливаются в очагах инвазии и некроза неопластической ткани. В условиях in vitro выявлена способность ГСК человека адгезировать к клеткам глиальных опухолей, замедляя темпы их пролиферации. Процесс межклеточного взаимодействия сопровождается переносом цитоплазматического материала ГСК в опухолевые клетки, что более выражено для клеток линии С6 в сравнении с CD133+ клетками линии U87. Установлено, что накопление гемопоэтических CD34+ стволовых клеток в опухолевом очаге in vivo сопровождается усилением синтеза эндотелина 1, подавлением продукции TGF-1 и увеличением числа iba-1+ глиальных клеток.
С использованием протеомного анализа показано, что воздействие TGF-1 сопровождается трансформацией молекулярного фенотипа клеток линии U87 глиобластомы человека, вызывая экспрессию белков пролиферации, резистентности, инвазии и репарации ДНК и угнетая синтез белков апоптоза, взаимодействия с межклеточным матриксом и аэробного метаболизма.
Установлено, фаскаплизин дозозависимо вызывает апоптоз клеток глиомы С6. В концентрации 2 мкМ эффективность цитотоксического действия фаскаплизина превосходит противоопухолевый препарат темозоломид. При уменьшении концентрации фаскаплизина до 0,5 мкМ эффективность цитотоксического действия снижается, а формируемый цитостатический эффект
возрастает с увеличением времени экспозиции. Эпигенетическая модификация ГСК фаскаплизином трансформирует цитостатическое действие клеточного препарата в цитотоксическое, сопровождаясь достоверным уменьшением объема опухоли и увеличением продолжительности жизни экспериментальных животных.
Методом биоинформационного анализа показано, что 63,2% белков протеома НСК и ОСК являются сходными, что значительно превосходит другие типы тканеспецифических стволовых клеток. Установлено, что при неопластической трансформации минимально изменены сигнальные пути интегринов и фокальной адгезии, что определяет возможность таргетного воздействия на них.
Теоретическое и практическое значение работы. Изучены фундаментальные свойства стволовых клеток человека. Установлены закономерности взаимодействия опухолевых и тканеспецифичных (гемопоэтических, мезенхимальных и нейральных) стволовых клеток человека, описаны их протеомные профили, проведен биоинформационный анализ и определены вероятные цели таргетного воздействия на опухолевые клетки. Обоснована роль трансформирующего фактора роста 1 в процессе пронейрально-мезенхимального перехода. Предложены новые молекулярно -биологические подходы к персонифицированной терапии мультиформной глиобластомы человека. Разработаны принципы применения клеточных и постгеномных технологий в нейроонкологии.
Положения, выносимые на защиту:
-
Постнатальные стволовые клетки способны к направленной миграции в очаг глиальной опухоли головного мозга;
-
Стволовая клетка представляет собой потенциальный инструмент для управления пролиферативными процессами в опухолевой ткани;
3. Модификация гемопоэтических стволовых клеток синтетическим
фаскаплизином (аналогом пигмента морской губки Fascaplisinopsis sp.)
усиливает их противоопухолевый потенциал.
4. Стимуляция трансформирующим фактором роста - 1 увеличивает
инвазивные свойства клеток глиобластомы, что позволяет рассматривать этот
белок в качестве мишени для молекулярно-нацеленной терапии;
5. Сравнительный анализ протеомов опухолевых и тканеспецифических
стволовых клеток позволяет идентифицировать перспективные мишени для
регуляции ключевых свойств глиобластомы;
Степень достоверности результатов. Фактические материалы, представленные в диссертации, соответствуют первичной документации. Достоверность результатов основывается на использовании современных методов исследования, достаточном объеме выборки и корректном анализе
полученных данных использовании современных методов статистического анализа.
Апробация работы. Материалы работы доложены на всероссийских конференциях: III Международном симпозиуме «Актуальные вопросы клеточных технологий» (Москва, 2010), I Национальном конгрессе по Регенеративной медицине (Москва, 2013); Научно-практических конференциях по итогам реализации ПНИЭР по приоритетному направлению «Науки о жизни» в рамках ФЦП «Исследования и разработки на 2014–2020 годы». (Москва, 2014 и 2015), Научно–практической конференции Отечественные противоопухолевые препараты (Москва, 2015); на международных конференциях: 20th Meeting of the European Neurological Society, Germany (2010), Annual Congress of the North American Society of the Tissue Engineering and Regenerative Medicine, USA (2010); International Association of Neurorestorology VI & 10th Global College of Neuroprotection and Neurorestarology, Romania (2013); 9th International Conference of Anticancer Research, Greece (2014); 20th World Congress on Oncology and 18th International Symposium on Molecular Medicine, Greece (2015).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 статей в отечественных и зарубежных реферируемых научных журналах, 8 глав в монографиях, тезисы 10 докладов на научно-практических конференциях и конгрессах, 2 патента на изобретение. В журналах списка ВАК РФ опубликовано 20 статей, проиндексировано международными базами Web of Science – 10, Scopus – 10 публикаций по теме исследования. Получены патенты РФ № 2535972 (2014); № 2572574 (2016).
Личный вклад автора. Идея настоящего исследования, разработка его дизайна, плана и методологического сопровождения, организация научного коллектива принадлежат автору. Экспериментальная часть работы выполнена автором или под его непосредственным руководством. Все опубликованные работы и доклады на конференциях выполнены лично автором.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение № 14.575.21.0038 идентификатор проекта RFMEF157514X0038). Все работы с нейральными стволовыми клетками человека и животных выполнены за средства Российского научного фонда, проект № 14 - 15 – 00084; синтез и стандартизация фаскаплизина выполнены за средства Российского научного фонда, проект №14-50-00034.
Структура диссертационного исследования. Работа представлена на 379 страницах машинописного текста, состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», 4 глав, отражающих результаты собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Работа
проиллюстрирована 98 рисунками и 28 таблицами, список литературы включает 424 источника, в том числе 402 источника на английском языке.
Благодарности. Автор выражает благодарность д.б.н., профессору Шевченко В.Е., за помощь в проведении исследования клеточных протеомов; д.м.н., Дюйзен И.В., за методологическую помощь; Коллективу кафедры клеточной биологии ШЕН ДВФУ и д.б.н., профессору Анисимову А. П., за помощь в проведении экспериментов in vitro; д.м.н., профессору Брюховецкому А. С. и д.м.н. Баклаушеву В.П., за помощь в организации экспериментальных исследований; к.х.н., Жидкову М.Е. и коллективу НИИ ТИБОХ им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, за образцы синтетического фаскаплизина; д.м.н., профессору Барышникову А.Ю., д.б.н., профессору Полевщикову А.В; член-корр РАН Гельцеру Б.И., д.м.н., профессору Апанасевичу В.И, д.м.н., профессору Чертку В.М. за конструктивную критику. Особая благодарность научным сотрудникам лаборатории МКН ШБМ ДВФУ к.б.н. Мищенко П.В., к.б.н. Манжуло И.В., Милькиной Е.В., м.н.с. Зайцеву С.В. за помощь в проведении экспериментов. Автор выражает глубокую признательность академику РАН Адрианову А.В., всему коллективу НИИ Биологии моря им А.В. Жирмунского ДВО РАН, и научному консультанту д.б.н., профессору Хотимченко Ю.С.
Стволовые клетки в лечении опухолей головного мозга
Проблема патогенеза МГБ пока не имеет однозначного решения, вопросов о причинах канцерогенеза значительно больше, чем научных ответов на них. Единственным фактом, где сходятся взгляды абсолютного большинства исследователей, является особая роль канцерогенов в развитии злокачественных опухолей. В качестве канцерогенов могут быть рассмотрены все перечисленные выше экзогенные поллютанты и эндогенные влияния, ведущие к накоплению изменений в ядре клеток ЦНС как результат сильного однократного или перманентного воздействия канцерогенов [11].
В этом ключе ведущие концепцией патогенеза МГБ является мутационная теория, которая была сформулирована в 1914 г, а в 1960-е гг. была дополнена новыми данными, иллюстрирующими гипотезу о том, как воздействие канцерогенов приводит к нарушению кариотипа, пролиферации, формированию автономности и иммортализации клеток. Именно в свете мутационной теории была сформулированна концепция протоонкогенов и генов-онкосупрессоров [11], формирующих механизмы контроля процессов деления, роста и дифференциации клеток. Нарушения этого механизма связаны с геномной нестабильностью, которая выступает как ведущий фактор патогенеза. Применительно к МГБ изучена активность протоонкогенов группы ras (HRAS, KRAS 2) [156] и MYC [224].
По мнению Bekman [57] геномная нестабильность и как следствие развитие мутаций, ведущих к нарушению эпигенетического контроля экспресии онкогенов и генов- онкосупрессоров, замыкает этот порочный круг. Геномная нестабильность служит одной из главных точек зрения для понимания патогенеза МГБ. Развитием этих взглядов стали теория случайных мутаций и сформулированная синхронно теория ранней хромосомной нестабильности, в значительной мере объясняющей нестабильность генома давлением естественного отбора [4]. Альтернативой этим взглядам стала теория анеуплоидии, сформулированная Duesberg в 2003 г. [102]. Согласно этой теории, злокачественные опухоли, в том числе МГБ, являются следствием исключительно анеуплоидии. С этих позиций, если в клетке оказывается число хромосом не кратное основному набору, либо серьезно изменена их морфология (удлинение, укорочение а также транслокации участков), то у выживших клеток доза тысяч генов оказывается не такой, как у нормальных клеток, а многократно привышенной, что порождает резкую нестабильность генома, а мутации в специфических генах не играют никакой роли в патогенезе, либо их роль вторична. Чем выше степень анеуплоидии, тем нестабильнее клетка, тем выше вероятность, что она сможет расти где угодно. Мутационная теория и теория анеуплоидии подвергались довольно жесткой критике, поскольку не дают ответов на ряд важных вопросов для понимания патогенеза МГБ. Однако дальнейшие исследования показали несомненную связь злокачественных опухолей с анеуплоидией [4, 5], указав при этом на существование еще более сложных патогенетических механизмов.
Близкой, но не родственной теории анеуплоидии, является концепция тканевого онкогенеза, согласно которой причиной появления опухолевых клеток лежит нарушение пролиферации клоногенных клеток, обладающих активированными онкогенами. Как утверждал Васильев [11], независимость возникает не как следствие утраты способности клеток реагировать на воздействие внешней среды, а скорее как результат чрезмерной стимуляции клетки эндогенными онкобелками, имитирующими один из нормальных типов клеточной реакции, а именно «реакции мембраны клетки на лиганды не связанные с субстратом». Данная теория хорошо объясняет два ключевых свойства клеток МГБ - высокую степень независимости и инвазию.
При повышенной пролиферативной активности происходит сдвиг в сторону эмбрионализации, что меняет соотношение между стимуляторами и ингибиторами митоза, в результате возникает «сверхстимуляция» и происходи омоложение клеток, что резко усиливает их генетическую нестабильность и независимость. Высокая скорость пролиферации приводит к конкуренции, что запускает механизмы клональной селекции, отбирающие клоны, обладающие максимальной резистентностью к гипоксии, и, следовательно, максимальной степенью нестабильности генома и независимости от внешних воздействий [10, 18, 230, 334 ].
После геномной нестабильности, нарушение взаимодействия с субстратом является не менее важной точкой для понимания патогенеза МГБ. Поскольку инвазивный рост представляет собой сложную программу, реализация которой позволяет клеткам изменить свою морфологию, получить способность к миграции и проникать в окружающие ткани и органы [16]. Инвазия – ключевое свойство МГБ. Высокие инвазивные свойства МГБ обусловлены активной продукцией опухолью протеолитических ферментов (металлопротеиназы, коллегеназы), а также способностью продуцировать белки экстрацеллюлярного матрикса (тенасцин, ламинин) которые являются благоприятным субстратом для миграции опухолевых клеток в ткань мозга. Данный аспект патогенеза можно без преувеличения считать ключевым.
Установлено, что именно лактат – один из ключевых метаболитов гликолиза – провоцирует миграцию клеток МГБ за счет TGF--зависимой активации MMP2 [53]. Поскольку в клетках МГБ наблюдается избыточная продукция лактата, это позволяет считать его основным промотором TGF опосредованной инвазии. Ранее уже высказывалось предположение о прямом участии этого сигнального пути в механизмах, связанных с злокачественностью глиом. TGF- является членом большого семейства цитокинов, участвующих в регуляции эмбрионального развития и гомеостаза ткани. Свои эффекты TGF- осуществляет через сложную сеть различных лигандов и рецепторов, проводящих соответствующие сигналы. При раке сигнальный путь TGF- выполняет как супрессорные, так и промотирующие функции, что известно как «парадокс TGF-0». Роль этого механизма в канцерогенезе МГБ недостаточно ясна и нуждается в дальнейшем изучении. Особый интерес представляют данные по модуляции TGF- эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), при котором эпителиоциты теряют межклеточные контакты, апикально-базальную полярность, реорганизуют цитоскелет, секретируют белки внеклеточного матрикса (ВКМ) и трансдифференцируются в мезенхимальные подвижные клетки. Молекулярные механизмы индукции ПМП в глиобластомах слабо изучены, но представленные к настоящему времени данные указывают на важную роль TGF- в развития МГБ [260, 272].
Вышесказанное позволяет утверждать, что вызванная воздействием канцерогенов нестабильность клеточного генома является важнейшим фактором патогенеза МГБ. Высокая степень независимости, в сочетании с большой скоростью пролиферации способствует «эмбрионализации» клеток и обретению ими максимальной степени независимости от внешних влияний. Высокая скорость пролиферации клеток МГБ формирует условия локальной конкуренции, формирующую гипоксическую микросреду, которая выступает как фактор клональной селекции, отбирая наиболее независимые и резистентные клоны. В свою очередь, на основании данных литературы, допустимо предположить, что гипоксический тип клеточного метаболизма связан с активизацией TGF--опосредованной продукции ММР, что служит важнейшим фактором качественно-количественной трансформации клеток МГБ и создает условия для миграции и инвазии. Важно отметить, что максимальная степень геномной нестабильности свойственна именно активно пролиферирующим клеткам, что делает их идеальным объектом мутагенеза. Наивысшей скоростью пролиферации обладают нейральные стволовые и прогениторные клетки, которые были описаны в 1962 г Altman и выделены 2009 г Doetsch из мозга приматов и человека [34, 96, 97] . C уникальными возможностями этого типа клеток свзывают одну из основных причин неэффективности стандартных методов лечения МГБ, что более подробно рассмотренов разделе 1.2.
Методы исследования особенностей миграции стволовых клеток человека к клеткам злокачественных опухолей in vitro
Содержание и уход за животными осуществлялИ в соответствии с требованиями стандартов GLP и Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Работа одобрена «Комиссией по биомедицинской этике» Школы биомедицины ДВФУ (протокол № 1 от 15.02.2015).
Работа in vivo выполнена в два этапа: Первый эксперимент выполнен на крысах породы Вистар, массой 220-250 г. Экспериментальную группу составили животные с перевитой глиомой С6, которым на 7 сут после операции внутривенно вводили меченные флуорохромом нейральные стволовые клетки (N=30) и ГСК (N=30). Группу контроля составили животные с перивитой глиомой С6 без последующей гемотрансфузии клеток. Группу сравнения составили крысы без опухоли, которым в/в вводили НСК (N=30) или ГСК (N=30), предварительно окрашенные флуоресцентным красителем.
Через 7 и 14 сут с момента введения СК крыс выводили из эксперимента и получали биологический материал (головной мозг, красный костный мозг, паренхиматозные органы – печень, почки, легкие, селезенка, тимус).
Второй эксперимент выполнен с использованием 60 крыс породы Вистар c перевитой глиомой линии С6, которые были разделены на две группы: 1. Экспериментальнная группы (группа «клетки» (N=30), животным данной группы в/в вводились 2106 аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. 2. Контрольную группусоставили животные, которые в/в получали (в/в) физиологический раствор (N =30);
Моделирование глиобластомы in vivo выполняли с помощью внутримозговой стереотаксической имплантации клеток линии С6. Крыс наркотизировали путем внутрибрюшинного введения смеси содержащей Золетил 100 (Virbac) + Рометар (Bioveta) в соотношении 1:4 из расчета 10 мг/кг. В стерильных условиях рассекали мягкие ткани головы и формировали трепанационное отверстие, используя микродрель (Harvard Bioscience Company, США). Клетки глиомы линии С6 (0,2 106) в объёме 0,3 мкл вводили с помощью гамильтоновского шприца со скоростью 3 мкл/мин в область каудопутамена с помощью стереотаксического аппарата Narishige (Япония) по координатам атласа мозга крысы (Paxinos, 2007): Ар -1; L 3,0; V 4,5, TBS-2,4 мм [280]. Для верификации опухоли и мониторинга динамики неопластического процесса проводили магнитно-резонансную томографию головного мозга (МРТ [3]) и компьютерную томографию (КТ).
МРТ головного мозга проводили на МР-томографе Biospec (Bruker) под общим наркозом с применением специальной магнитной катушки для мелких лабораторных животных. Для усиления изображения проводили катетеризацию центральной хвостовой вены и вводили стандартный раствор Магневиста в дозе 0,2 мл/кг массы тела животного. Объем опухолевого узла определяли по формуле: V=4\3xabc где a,b,c - полуоси эллипсоида. Находили срез с максимальной площадью неопластического очага, на котором определяли большую полуось (а) и малую полуось эллипсоида (б). Затем путем суммирования толщины фронтальных срезов на расстоянии от переднего до заднего полюса опухолевого узла находили переднезаднюю полуось (с) и производили вычисления объема опухоли [3].
Компьютерную томографию проводили на высокоразрешающем томографе SkyScan 1176 (Bruker) с использованием стандартного набора приложений.
На 14 сут после имплантации опухолевых клеток животным в условиях общей анестезии катетеризировали центральную хвостовую вену и вводили 2106 СК в объёме 0,3 мкл. Предварительно клетки были окрашены витальными флуоресцентными красителями (раздел 2.7). Введение клеток выполнялось четырехкратно (с интервалом 24 ч), равное количество клеток (0,5106) вводили в 0,3 мл апирогенного физиологического раствора.
В работе использован синтетический аналог фаскаплизина (12,13-Dihydro-13-oxopyrido[l,2-a:3,4-b] diindol-5-ium chloride) полученный по методу М.Е. Жидкова [422]. Основные спектральные характеристики (ЯМР !Н, ЯМР 13С) данного продукта идентичны природному фаскаплизину, впервые выделенного из морской губки Fascaplisinopsis sp., в 1988 г [51, 153]. Изучали воздействие растворов, содержащих фаскаплизин, на клетки глиомы С6 и ГСК, а также противоопухолевую эффективность эпигенетически модифицированных (путем предшествующей обработки фаскаплизином) стволовых клеток in vitro и in vivo в отношении опухолевых клеток линии С6.
Для установления эффективных концентраций фаскаплизина 5103 клеток глиомы С6 и ГСК культивировали в планшетах, заполненных средой DMEM, содержащей 10% FBS, FGF, EGF и антибиотик-антимикотик «100Х» в течение 5 ч при температуре 37С в атмосфере 5% СО2. В лунки добавляли 2 мкМ; 1,5 мкМ; 1 мкМ; 0,5 мкМ; 0,05 мкМ, и 0,005 мкМ фаскаплизина. Клетки инкубировали 72 ч, 37С и 5% СО2. Подсчет числа клеток проводили с использованием системы Cell-IQ (в сроки 72 и 120 ч ). Клетки окрашивали по методу TUNEL (Click-iT TUNEL Alexa Fluor 488 Imaging Assay, for microscopy & HCS, C10245). Механизмы апоптоза клеток изучали методом проточной ЦФМ с использованием набора специфических реагентов (раздел 2.3.9).
Для сравнительной оценки действия фаскаплизина использовали темозоломид (TemodalShering – Plough Labo N.V., Бельгия) в концентрации 2 мкМ/мл. Цитотоксическое действие этого вещества обусловлено алкилированием гуанина в положении О6 и N7 с последующим запуском механизма аберрантного восстановления метилового остатка. Препарат нарушает структуру и синтез ДНК, клеточный цикл клеток МГБ, и является «золотым стандартом» химиотерапии опухолей головного мозга [13, 14, 17, 161]. Сравнительная оценка проводилась по числу живых клеток в культуре, в течении 57 ч, при стандартных условиях.
Миграция стволовых клеток млекопитающих в сочетанных культурах с клетками различных линий in vitro
Однако заслуживает особого внимания, что продвижность НСК в отношении различных типов клеток линии глиобластомы тоже совсем не одинакова. Так, несепарированные клетки двух типов глиобластомы U87 и U251 в 5 и 6 раз, соответственно, превосходят их подвижность в контроле, однако миграционная активность этого типа клеток в отношении CD133 ОСК превосходит контроль практически на порядок.
Высокая подвижность НСК по отношению к различным типам опухолевых клеток не является неожиданностью. Способность к непрерывной миграции из первичных герминативных зон головного мозга одно из важнейших свойств НСК [24-26] и их прямых потомков – нейральных прогениторных клеток [56, 158]. Мигрируя из субвентрикулярной зоны головного мозга, потоки НСК ориентируются по градиенту концентрации сигнальных молекул [96, 97], продуцируемых эндотелием кровеносных сосудов, что позволяет провести параллели. Периваскулярный способ инвазии клеток МГБ также характеризуется миграцией опухолевых элементов по пространствам Вирхова - Робина, а также распространением вдоль пенетрирующих паренхиму мозга артерий, артериол и вен [375]. В этой связи аргументом в пользу единства механизмов, определяющих специфические взаимоотношения НСК и ОСК, являются указания на способность растущей в мозге МГБ опустошать первичные герминативные 100 центры мозга, что довольно подробно проиллюстрировано в работах Najbauer [263], Walzlein [373], Ярыгина [23], Цимбалюка [22].
Данное обстоятельство свидетельствует в пользу наличия прямой связи ОСК глиобластомы и нормальными НСК головного мозга человека и высших млекопитающих. И, конечно, служит весомым аргументом, позволяющим рассматривать НСК как стратегически важный биотерапевтический инструмент для управления функциями этого типа опухолевых клеток. Безусловно, количество НСК, доступных для целей терапевтического использования сравнительно невелико. Однако по данным Navarro – Alvares [268], и некоторых других авторов [89, 137] популяция CD133+ клеток составляет 1,3±0,7% общего числа клеток линии U87 и 3,4±2,6% от общей популяции клеток линии U251 глиобластомы, что позволяет говорить о реальной перспективе подобных сопоставлений. При этом нельзя исключить, что, зависимость, наблюдаемая между числом ОСК в сочетанной культуре и способностью привлекать СК, наводит на мысль, что запуск и поддержание миграционной активности к опухоли в значительной мере обеспечивается субпопуляцией стволовых клеток/
Относительно слабая способность культур клеток линии МСА-7 рака молочной железы и А 549 рака лёгкого привлекать СК не должна вводить в заблуждение. Рак молочной железы – гормонально зависимая опухоль, которая по распространенности и масштабу летальности уступает только раку легких [13], лидирующему в общемировой статистике онкологической смертности. Не исключено, что способность привлекать стволовые клетки может быть связана с многочисленными пассажами этих линий in vitro, приводящих к потере ряда важных сигнальных механизмов. В свете сказанного, обращает на себя внимание тот факт, что НСК проявляли максимальную тропность в отношении опухолей нейроэпителиального происхождения и значительно уступали ГСК в активности по направлению к опухолям иного тканевого происхождения. ГСК, несколько уступая НСК в способности мигрировать в направлении клеток злокачественных опухолей, тем неменее активно мигрировали к неопластическим клеткам. Этот факт согласуется с данными литературы, указывающими на высокую подвижность стволовых клеток костного мозга в отношении различных линий опухолевых клеток [264, 12]. Их миграционные возможности немногим уступают НСК и демонстрируют принципиальные различия в этой способности с дифференцированными клетками. Нельзя не отметить, что по способности привлекать ГСК сепарированные CD133+ клетки существенно превосходят другие клетки МГБ, что также является аргументом в пользу уже высказанного предположения, что в составе популяции клеток опухоли именно ОСК обеспечивают максимальный вклад в подачу специфического сигнала, запускающего процессы миграции ГСК и клеток других типов. Следуя этой логике, можно предполагать, что онкотехнологии, основанные на создании модифицированных СК, способны обеспечить эффективное управление судьбой опухолевых стволовых клеток.
СК обладают способностью направленно мигрировать к опухолевым клеткам, но роль этого феномена в канцерогенезе МГБ практически не изучена. Идентифицировано множество хемоатрактантов, факторов роста и других сигнальных молекул, управляющих процессами миграции и хоуминга стволовых клеток, о чем сказано в разделе 2.4 литературного обзора. Однако роль описанных выше механизмов в патогенезе глиальных опухолей головного мозга пока неоднократно доказана.
Как следует из эксперимента, первичным источником сигнальных молекул, привлекающих СК, является клетки опухоли. Способность клеток МГБ продуцировать коллаген 4-го типа, лектины и тенасцин доказана. Продукция клетками МГБ матриксных металлопротеаз (MMP1, 2 и 9) способствует разрушению внеклеточного матрикса (ВКМ) и высвобождению фибронектина, витронектина и ряда других молекул, резко повышающих мотильность опухолевых клеток и их способность привлекать стволовые и дифференцированные клетки [53]. Рекрутируя микроглиоциты, астроциты и эндотелиальные клетки МГБ, индуцируют продукцию металлопротеаз [74], что усиливает процессы деградации ВКМ. Поскольку инвазивные свойства МГБ ассоциированы именно с ОСК, то наблюдаемая в эксперименте лучшая подвижность ГСК и НСК относительно ОСК позволяет предположить, что способность привлекать СК не только находится в зависимости от инвазивного потенциала опухоли, но и усиливается в процессе реализации этого потенциала.
Таким образом, в эксперименте in vitro изучены процессы направленной миграции СК к ОК различных типов. Установлено, что способность мигрировать к опухолевым клеткам в большей степени свойственна именно тканеспецифическим СК. Наилучшей способностью индуцировать миграцию СК обладают ОСК, что свидетельствует о прямой зависимости этого феномена от инвазивного потенциала опухоли. Вектор миграционной активности более выражен между клетками, имеющими единый гистогенетический источник, что является весомым аргументом в пользу происхождения ОСК мультиформной глиобластомы от НСК. В этой связи требуется детальный анализ метаболических карт нормальных и опухолевых СК, который может пролить свет на вопрос об источниках онкогенетической трансформации, определить сходства и различия между этими линиями и идентифицировать потенциальные мишени для такого воздействия ОСК.
Иммуногистохимическое исследование ткани опухоли после введения гемопоэтических стволовых клеток
Как следует из эксперимента, трансплантация ГСК крысам с глиомой С6 приводит к увеличению выживаемости животных данной группы, и улучшает их функциональное состояние. При этом морфологический анализ взаимодействия трансплантированных клеток с клетками глиомы выявил ряд важных закономерностей. ГСК оказывают амортизирующее воздействие на течение неопластического процесса, о чем свидетельствует сокращении площади некрозов (Рис. 42, 43). Раннее появление некрозов позволяет отнести глиобластому к самой высокой – четвертой категории злокачественности [66, 165, 173]. Гипоксию принято считать [222] одним из ключевых факторов регулирующих туморогенный потенциал ОСК. В этом ключе сокращение площади некрозов или их более позднее появление может служить важным аргументов в пользу более положительного прогноза для жизни больного, позволяет расчитывать на усиление терапевтического эффекта ионизирующего облучения [246]. В пользу лучшего прогноза такого пациента свидетельствует появление клеточных инфильтратов в опухолевой ткани [14], представленных мелкими округлыми клетками, заполняющими участки гибели опухолевой ткани (Рис. 50).
Заслуживает особого внимания всплеск пролиферативной активности у крыс группы «клетки» с 20 по 30 дни эксперимента (Рис. 53), что может быть связано с пролиферацией мигрировавших в опухоль трансплантированных ГСК трансформирующихся в iba-1 ИР клетки. Косвенным подтверждением этому служит резкое возрастание количества клеток, иммунопозитивных к антителам против Iba1 в области опухоли в эти сроки эксперимента (Рис.47, 48), что не противоречит данным литературы [295]. Как известно, глиомы характеризуется выраженной способностью привлекать различные клетки, при этом до 30% клеток, рекрутируемых МГБ, составляют именно микроглиоциты [123], что нашло подтверждение в нашем исследовании. В естественных условиях основным источником микроглиоцитов/макрофагов до 20 суток являются собственные ресурсы головного мозга [74, 123], а моноциты крови до определенного момента не участвуют в этом процессе. В пользу этого аргумента свидетельствует снижение количества микроглиальных клеток с 20 по 30 сутки эксперимента. Важно, что при этом область их максимального скопления смещаться от центра опухолевого очага к периферии, обнаруживая четкую тенденцию к уплотнению микроглиальных клеток в участках инвазии. В свою очередь, по краям опухолевого очага, как бы препятствуя миграции микроглии, наблюдается уплотнение астроцитов, которые формируют клеточный барьер, препятствующий продвижению инвазивного процесса в ткань мозга.
Трансплантация ГСК значительным образом изменяет архитектуру и естественный стереотип течения опухолевого процесса. Мигрируя в опухоль и взаимодействуя с ее клетками значительная часть ГСК, трансформируется в Iba1– позитивные клетки, которые локализуются в центре опухоли и на ее периферии. Важно, что накопление микроглиоцитов происходит именно в местах локализации мигрировавших сюда трансплантированных клеток (Рис. 27). В литературе описаны два субтипа микроглиоцитов М1 и М2 фенотипа, способные как подавлять, так и стимулировать опухолевый процесс [123], что весьма дискутабельно, и нуждается в дальнейшем, более предметном изучении. Противоопухолевые эффекты глии [174] хорошо известны. Весьма вероятно, что итоговая про- или противоопухолевая функция микроглии определяется влиянием клеточного микроокружения [74], аргументом в пользу этой гипотезы является преимущественная локализация Iba1-ИР микроглиоцитов в зонах инвазии клеток глиомы С6 в вещество мозга, и их тесная колоколизация их с клетками, имеющими признаки других, возможно, мигрировавших сюда стволовых клеток. В свою очередь, этот факт указывает на не последнюю роль стволовых клеток в неопластическом процессе.
Клетки, сосредоточенные на границах опухолевого очага, могут быть нейральными стволовыми или прогенторными клетками [22, 302, 354], стволовыми клетками костного мозга [253, 296, 297] или эндотелиальными стволовыми клетками [144, 255], мигрировавшими сюда в ответ на сигналы растущей опухоли. Противоопухолевые свойства нативных стволовых клеток известны, и в свет данных эксперимента in vitro, описанного в главе 4, такое сосредоточение СК носит регуляторный характер. Однако, с высокой долей вероятности это могут быть ОСК, непосредственно модерирующими процессы инвазивного роста. Вероятно, именно количество стволовых клеток в очаге, и, конечно, их качество, определяет патогенетическое значение микроглиальной реакции, что в данном случае, и определило увеличение продолжительности жизни крыс группы «клетки». Весьма вероятно, что помимо прямого противоопухолевого действия ГСК, трансформация некоторой части мигрировавших клеток в микроглию является важнейшей частью этого довольно сложного саногенетического механизма. Однако кратковременное увеличение количества PCNA-ИР клеток может являться прямым следствием усиления процессов репарации ДНК [256] в клетках глиомы вследствие антигипоксического дейстивия трансплантанта на опухоль. При этом дальнейшего усиления опухолевого роста не происходит, что вероятно связанно с усилением локального воспаления, на что может указывать, изменение продукции соответствующих медиаторов, в частности интерлейкинов 1 и 10.