Введение к работе
Актуальность темы. Одной из важнейших проблем современной клеточной биологии является выяснение механизмов регуляции пролиферации клеток эукариот. Основные исследования в этой области сосредоточены на изучении проведения сигнала, запускаемого действием ростовых факторов. Действие лигандов приводит к активации клеточных рецепторов, которые являются стартовыми точками каскада белок-белковых взаимодействий с участием сигнальных молекул, приводящих к ответу клетки на сигнал - началу процессов пролиферации, дифференцировки, апоптоза.
Недавно открытый путь проведения сигнала в клетке с участием белков семейства STAT привлекает внимание исследователей тем, что эти белки являются транскрипционными факторами, способными активироваться благодаря фосфорилированию единственного в их молекуле тирозина непосредственно клеточными рецепторами. Особенностью STAT-пути проведения сигнала в клетке является отсутствие большого числа промежуточных компонентов между клеточными рецепторами, локализованными на клеточной поверхности, и самими транскрипционными факторами STAT, взаимодействующими со специфическими регуляторными элементами генов.
Несмотря на интенсивные исследования транскрипционных факторов семейства STAT многие вопросы, касающиеся их участия в процессах пролиферации, дифференцировки и апоптоза остаются невыясненными. В настоящее время в литературе появляются данные о том, что STAT-путь передачи сигнала не является полностью автономным. Так, показана связь белков семейства STAT с МАР-киназой - ключевым белком Ras-зависимого пути передачи сигнала в клетке, а также с фосфоинозитндЗ-киназой - белком фосфоинозитидного пути передачи сигнала (David et al., 1995; Pffefer et al., 1997). Вопрос о взаимодействии транскрипционных факторов семейства STAT с другими сигнальными белками и о функциональном значении такого взаимодействия остается открытым.
Известно, что опухолевые клетки выходят из-под контроля организма и
не нуждаются в ростовых факторах для осуществления процесса клеточной пролиферации. Вопросы функционировании транскрипционных факторов STAT в трансформированных клетках: взаимодействие с рецепторами, уровень фосфорилирования, ДНК-связывающая активность, транс-активирующие свойства, взаимодействие с белками других сигнальных путей, а также внутриклеточной локализации пока изучены недостаточно. Адекватной клеточной системой для исследования нарушений сигнальных путей являются трансформанты, полученные из первичных клеток с помощью доминантно-действующих онкогенов с известным механизмом действия. В настоящей работе были использованы первичные эмбриональные фибробласты крысы (REF) и трансформанты, полученные введением комплементирующих онкогенов ElAad5 и cHa-Ras (ElA+Ha-Ras). Как было показано ранее, в клетках ElA+Ha-Ras транскрипционные факторы, принадлежащие Ras-зависимому пути передачи сигнала, дерегулированы (Поспелова и др., 1996). Кроме трансформантов ElA+Ha-Ras, была также использована клеточная линия А-431, имеющая происхождение из опухоли человека и содержащая большое число рецепторов эпидермального фактора роста.
Цель и задачи исследования.
В связи с вышеизложенным, в настоящей работе поставлены следующие основные задачи:
-
Исследовать статус фосфорилирования по тирозину STAT1 в нормальных эмбриональных фибробластах крысы (REF) и клетках REF, трансформированных онкогенами ElA+Ha-Ras.
-
Выяснить возможные механизмы консппугивной активации белков STAT1 и STAT3 в эмбриональных фибробластах крысы, трансформированных онкогенами ElA+Ha-Ras.
-
Исследовать взаимодействие белков STAT1 и STAT3 с цитоплазматическими белками, принадлежащими к другим сигнальным путям, в нормальных и трансформированных клеточных линиях.
-
Проанализировать внутриклеточное распределения белков семейства STAT в клеточных линиях, отличающихся степенью трансформации и уровнем организации цитоскелета.
Научная новизна. Показано, что в клетках, трансформированных онкогенами ElA+Ha-Ras, транскрипционный фактор STAT1 конститутивно фосфорилирован по тирозину, независимо от присутствия или отсугствия ростовых факторов. В нормальных эмбриональных фибробластах крысы и клетках эпидермоидной карциномы человека А-431 STAT1 фосфорилирустся только после воздействия на клетку сыворотки или эпидермального фактора роста (ЭФР). Впервые показано, что в клетках EIA+Ha-Ras конститутивно фосфорилирован по тирозину рецептор ЭФР, что, вероятно является причиной конститутивной активации белка STAT1.
Помимо конститутивного тирозинового фосфорилирования STAT1 в клетках ElA+Ha-Ras, впервые показано конститутивное взаимодействие STATI с МАР-киназой - одним из ключевых компонентов Ras-зависимого пути передачи сигнала. Таим образом в клетках ElA+Ha-Ras имеет место перекрест сигнальных путей: STAT-пути и Ras-зависимого МАР-киназного сигнального каскада.
Во всех исследованных клеточных линиях обнаружена связь STAT1 с фосфоинозитид-специфической фосфолипазой Cyl, что указывает также на пересечение STAT- и фосфоинозитидного путей передачи сигнала.
Впервые показана связь белков семейства STAT с цитоскелетнымн фракциями в клеточных линиях с разным уровнем организации цитоскелета. Теоретическое и практическое значение работы. Анализ функционального состояния белков STAT1 и STAT3 в нормальных и трансформированных клеточных линиях, проведенный в данной работе, позволил выявить механизм конститутивной активации этих транкрипционных факторов в трансформантах ElA+Ha-Ras. Наиболее важным механизмом дерегуляции STAT-пути является конститутивное фосфорнлирование рецептора ЭФР (ЭФР-Р) и связанное с этим фосфорнлирование сигнальных белков, являющікся субстратами ЭФР-Р, в том числе STAT1 и STAT3.
Большое практическое значение для клеточной биологии и молекулярной онкологии имеют полученные данные о способности белков STATI и STAT3 образовывать комплексы с белками других сигнальных путей: МАР-киназой (Ras-зависимый путь) и ФЛСу! (фосфоинозитидным путь).
Отработан метод получения антител против 38 С-концевых аминокислот белка5ТАТ1, основанный на получении слитого белка GST-STAT1.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на 2-ом биохимическом съезде (Москва, 1997) на совместных семинарах лабораторий молекулярных основ дифференцировки клеток, физиологии клеточного цикла и отдела клеточных культур Института цитологии РАН. По теме диссертации опубликовано 4 работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 152 публикации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и иллюстрирована 28 рисунками.
