Введение к работе
Актуальность проблемы. В соматических клетках животных организмов хромосомный и центриолярный циклы состоят из событий, обеспечивающих удвоение числа данных клеточных компонентов. Существующая в диплоидных клетках корреляция между числом хромосомных наборов и числом центриолей обеспечивается взаимосвязанностыо хромосомного и центриолярного циклов, включащей не только одновременность удвоения хромосом и центриолей, но одновременность распределения ЭТИХ компонентов в митозе ( Murray e.t al.,1965i Kuriyama, Borisy,19S1; Vorobjev,Chentaovt1982; Alvey,1986 ).
В клетках животных организмов с центриолями, как правило, ассоциирована центросома, которая состоит из фибриллярного материала и выполняет функцию центра организации микротрубочек ( Ьиукх, 1970, Pulton, 1971). В клеточном цикле наблюдаит морфофункциональ-ные преобразования центросомы, которые называют центросомным циклом ( Mazia, 1984). В норме в диплоидных клетках центриолярный и центросомный циклы сопряжены друг с другом ( Brillkley,1985 ), а также С хромосомным'циклом ( Mazia, 1986 ).
Однако до настоящего времени отсутствует детальный анализ характера сопряжения трех циклов друг о другом и последствий разобщения этих циклов для диплоидных'клеток, имеющих разный тип диф-ференцировки, как в норме, гак и при патологическом состоянии клеток. Данная проблема является еще менее изученной для клеток, плоидность которых отлична от диплоидной.
Изменение плоицности клеток - широко распространенное явление. Снижение плоидности клеток происходит при появлении половых клеток и осуществляется путем специального типа деления клеток -мейоза. Умножение числа геномов наблюдается при дифференпировке таких клеток, как гепатоциты, кардиомиоциты, остеокласты, мега-кариоциты, поперечно-полосатые мышечные волокна, трофобласты и т.д. Основными механизмами увеличения числа геномов олужат поли-плоидязирующил митоз, блокирование клеток в 2 -периоде, эндоре-дупликация, политенизация и слияние клеток (Бродский,Уриваева,1981).
Кроме того, изменение плоидности клеток происходит при таких патологических процессах, как воспаление, опухолевый рост, вирусные инфекции, а также в ответ на различные воздействия (радиационное поражение, гипо- и гипертермия, химические агенты типа анти-тубулиновых, алкиллиругощих, энергетических ингибиторов, ингибиторов синтеза нуклеиновых кислот и белка и т.д.). При этом к сниже-
юта числа хромосом наиболее часто ведет многополгасный митоз,увеличение плоидности осуществляется с участием тех же механизмов, которые описаны для дифференцированных клеток в норме (Каудри, 1958; Алов,1972; Блюмкин,Жданов, 1972; Еродский,Урываева,1Э81).
Различные клеточные и тканевые культуры в настоящее время широко используются как в качестве моделей для фундаментальных исследований, так и в качестве материала для биотехнологического производства. В клеточных культурах изменения плоидности клеток могут происходить спонтанно, при изменении условий культивирования и при тех. же воздействиях, которые приводят к снижению или увеличения плоидности клеток в организме.
Таким образом, исследование центриолярного и центросомного циклов при изменении плоидности клеток является ванной и актуальной проблемой, тесно связанной с вскрытием механизмов изменения плоидности клеток п биологического смысла таких изменений при диф-ференцировке клеток, в ходе важнейших патологических процессов (воспаление, опухолевый рост, вирусная инфекция), а .также при поранении клеток различными физическими и химическими воздействиями как in vivo, так и in vitro.
Целью настоящего исследования было изучение особенностей центриолярного цикла при изменении плоидности клеток. Центриоляр-ный цикл был изучен для полиплоидных клеток, умножение геномов, в которых осуществлялось с помощью различных механизмов. Центриоляр-ный цикл в условиях снижения плоидности клеток был исследован на примере мейоза, ведущего к образованию гаплоидных яйцеклеток, а также на примере многополюсных митозов, возникающих в популяции диплоидных клеток (спонтанній и индуцированных К-митотическим агентом), в популяции полиплоидных одноядерных клеток и имеющих различное происхождение многоядерных клеток (образующихся в результате слияния или в результате нарушения цитотомли). Кроме того, цель работы состояла в изучении поведения хромосом при разных типах многополюсных митозов, что должно было позволить проанализировать особенности сопряжения и разобщения центриолярного и хромосомного циклов при снижении плотности клеток. И, наконец, денное исследование было направлено на выявление роли различных элементов цитоскелета (в том числе и немикротрубочковых), в поддержании коррекции между числом ценгриолей и числом хромосомних наборов при процессах, ведущих к изменению плоидности клеток.
Для решения поставленной проблемы необходимо решить следуй-
щие задачи;
-
Исследовать соотношение между числом ценгриолей и плоид-ностьп в клетках, умножение геномов в которых происходило в результате: а) полиплоидизиругащего митоза; б) блокирования клеток в G2 -периоде; в) политенизации; г) слияния клеток.
-
Исследовать центриолярный цикл в полиплоидных клетках.
-
Исследовать соотношение между числом хромосомных наборов и центриолей при снижении плоидности в процессе мейоза и после восстановления диплоидного состояния в результате оплодотворения.
-
Исследовать роль многополюсного митоза в изменении числа хромосом и центриолей: а) определить причины возникновения много-полюсных митозов в популяциях диплоидных и разного происхождения полиплоидных клеток; б) определить этапы перехода к многополюсному митозу в популяциях диплоидных и полиплоидных клеток; в) исследовать характер распределения хромосом и центриолей при индукции многополюсности в диплоидных и полиплоидных клетках; г) исследовать локализацию промежуточных филаментов при редукционных и патологических многополюсных митозах.
Научная новизна полученных результатов состоит в том, что впервые доказана корреляция между числом центриолей и хромосомных наборов в полиплоидных клетках, увеличение числа геномов в которых происходит путем полиплоддизирующего митоза in Vivo и in vitro или слияния клеток in vitro . Выявлено, что при полиплои-дизации клеток путем о„-блока не нарушается репродукция ценгриолей, по происходит разобщение центриолярного и хромосомного циклов, при политенизации - наблюдается исчезновение центриолей из клеток. Обнаружено, что при обратимой утрате пролиферативной активности сохраняется целостность центриолярного комплекса, при необратимой - как после полиплоидизации путем полиплоидизиругащего митоза, так и при умножении геномов без митоза (политенизация), происходит распад центриолярного комллекса. Отсюда сделан вывод о том, что если процесс умножения геномов включает любые формы Мй-тотической активности, в клетке поддерживается корреляция между плоизностью и числом центриолей, если при полиплоидизации митоти-ческая активность отсутствует, то корреляция нарушается вплоть до полного исчезновения центриолей.
На основании собственных результатов и анализа данных литературы продемонстрировано, что мейоз является процессом, при котором происходит нарушение корреляции между число хромосомных нвбс-
_ 4 -ров и числом центриолей в дифференцированных половых клетках, вое-' становление же корреляции между плоианостью и числом центриолей осуществляется на начальных этапах эмбриогенеза.
Исследование центр полярного комплекса и поведения хромосом в многополюсных митозах позволило впервые показать, что существует широкое разнообразие в структурной организации, механизме возникновения и биологическом значении многополюсных митозов. Впервые доказано, что многопопгасные веретена с диплосомами в полюсах появляются при делении полиплоидных клеток, с одиночными центриолями -при делении ди--и полиплоидных клеток, прошедших стадию К-метафа-зы; с дополнительными бесцентриолярными полюсами - при делении диплоидных клеток, подвергшихся К-митотическому воздействии.
Выявлено, что как в диплоидных, так и в полиплоидных клетках многополюсние митозы могут обеспечивать как эуплоидное, так и ане-уплоидное распределение хромосом. При эуплоидном распределении хромосом может быть пропорциональное или непропорциональное распределение центриолей. В зависимости от характера распределения хромосом и центриолей многополюсние митозы следует относить к патологическим, редукционным ели смешанного типа. Получены данные о том, что характер распределения хромосомных наборов и центриолей может быть связан с целостностью сети промежуточных филаментов, обеспечивающих в интерфазе и в начальных фазах митоза структурную целостность ядерно-центриолярного комплекса.
Практическое значение. Полученные в работе данные о разнообразии вариантов взаимосвязи между центриолярным и хромосомным циклами при образовании полиплоидных и гаплоидных клеток, а также при патологических делениях клеток носят фундаментальный характер и расширяют наши представления о механизмах, включенных в дифферен-цировку клеток или участвующих в развитии патологических процессов. Изучаемый в работе круг вопросов является составной частью проблем биологии развития и медицины, касающихся регуляции размножения и дифференцировки клеток.
. В настоящей работе дана характеристика особенностей пролиферации многоядерных клеток* индуцированных в культуре различными способами. Эти исследования могут служить основой для проведения анализа механизмов возникновения и пролиферативных возможностей многоядерных клеток, наблюдаемых в тканях животных организмов в норме и при самых различных патологических процессах, таких как воспаление, опухолевый рост, вирусные инфекции, радиационное по-
ражение, т.е# процессах, которым уделяется огромное внимание в области медицины ив первую очередь онкологии.
К этому же кругу проблем относятся полученные в работе данные о механизме возникновения и биологической роли таких распространенных форм патологии митоза, как К-митоз и многополюсные митозн. Обнаруженное разнообразие в структурной организации и причинах возникновения многополюсных митозов, а также в вариантах взаимосвязи между К- и многополюсники митозами не только углубляют наши знания в области, касающейся регуляции делений клеток. Представленные данные ставят вопрос о роли К- и многополгоеннх митозов в возникновении потомков, несущих различные черты патологии, в том числе и такие, которые ведут к трансформации клеток. В конечном итоге, вопрос об участии потомков патологических митозов, возникающих в различных тканях и при различных воздействиях, в опухолевой прогрессии может быть тесно связан с важнейшей онкологической проблемой гистогенеза опухолей.
В настоящей работе проведен анализ возможных путей нарушения между хромосомным и центриолярным циклами, приводящих к дестабилизации хромосомных наборов. Такой анализ тлеет практический интерес при решении одной из актуальных биотехнологических задач, связанной с поиском методов стабилизации геномов гибридных клеток.
В заключение следует отметить практическое значение предлагаемого в работе радиоавтографического метода идентификации клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла, с помощью двойного мечения клеток. Этот метод нашел свое применение в исследованиях, проводимых на кафедре цитологии и гистологии биологического факультета МУ,' в лабораторий молекулярной биологии и биоорганической химии им.А.Н.Беяозерского МГУ и в других научно-исследовательских учреждениях»
Апробация работы. Основные материалы работы были представлены автором на X, ХП, ХШ Всесоюзных конференциях по электронной микроскопии (Ташкент,1976; Суш,1982; Звенигород,1988), на Ш и 17 Всесоюзных конференциях по патологии клетки (Москва, 1982,1987), на Симпозиуме по Соматической полиплоидии (Ереван,1977), на Всесоюзных совещаниях: "Мнтотический цикл" (Ленинград, 1978), "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1983,1987), "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград, 1984), на Всесоюзном симпозиуме "Реакция клеток на внешние воздействия" (Киев,1982), на УП, XI, ХП школах по биологии развития (Эвенигород,197Э; Пущино,1Э85;
- 5 -Рига,1388), заседании МОИП (КоскваД983).
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из
введения, 3 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литера
туры. Работа изложена на страницах машинописного текста, из
них 3 таблицы, 105 рисунков и список литературы, включающий
работ, в том числе иностранных.