Введение к работе
Бурное развитие новой и современные направления класси
ческой биотехнологии стазчт перед специалистами по коллоидной
химии задачи исследования бнотехнологических дисперсных
систем, которые широко реализуются на различных
технологических стадиях или. являются формой готового продукта Поскольку вода является дисперсионной средой большого числа под^бчых систем, для управления их свойствами особую актуальность имеют нссдедоззкия с использованием методов магнитного резонанса. Кроме того, методы магнитного резонанса позволяют детально изучить процессы формирования и факторы стабилизации таких дисперсий.
Использование методов магнитного резонанса позволяет
существенно дополнить системные характеристики классических
биотехнологических дисперсий. Прежде всего это относится к
оценке состояния стабилизатора и компонентного состава
межфазных адсорбционных слоев (МАС) в эмульсиях,
стабилизированных за счет структурно-механического барьера. Для
дисперсных систем на основе интерполимерных комплексов (ИПК)
кал носителей лекарственных веществ в препаратах
пролонгированного действия важнейшими вопросами являются
получение количественных оценок межмолекулярных
ііїзкмпдеиствнй (з системзл полимер-полимер, пол и мер-вода, полимер-лекарственное вещество} и закономерностей регулируемой доставки активных компонентов.
Высокая эффективность методов магнитного резонанса позволяет существенно продвинуться в разработке актуальных вопросов, связанных с эксплуатацией и повышением качества ряда биотехнологических дисперсий. К ним относятся: повышение устойчивости клеточных суспензий к экстремальным факторам воздействия (низкие температуры, циклы замораживания-высушивания, низкие влажности и другие), управление ДНК-мембранными контактами (при разработке генных лекарственных средств), целенаправленное использование солей-плавителей в технологии приготовления плавленых сыров (управление структурными переходами с целью получения продуктов ст.? ци (Ь и чес кого назначения)
ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Целью работы является систематическое
исследование методами магнитного резонанса состояния
стабилизатора и компонентного состава межфазных
стабилизирующих слоев в эмульсиях, целостности ИПК и особенностей взаимодействия в полимерных матрицах, процессов разрушения и факторов стабилизации липидных бислоев клеточных мембран, а также изучение механизмов образования ДНК-мембранных контактов для разработки научных основ повышения устойчивости биотехнологических дисперсий к экстремальным факторам воздействия и улучшения свойств носителей биологически активных веществ и при создании лекарственных препаратов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Для различных программ
низкотемпературных воздействий, моделирующих основные стадии
технологического цикла обработки биопрепаратов, обнаружено
повышение устойчивости лиофильных коллоидных систем
(везикул) при введении дисахаридов (трегалозы и сахарозы).
Предложен механизм стабилизации бислоя мембран,
заключающийся в вытеснении дисахаридами молекул воды с
поверхности бислоя и предотвращении кристаллизации воды
вблизи его поверхности. Полученные ЯМР-данные позволили
оценить нарушения мембран при различных режимах
замораживания биотехнологических клеточных систем.
Методами радиоспектроскопии установлены функциональные изменения крови (активирование процессов окисления липидов и изменения водопроницаемости мембран эритроцитов) в условиях стрессовых воздействий, а также снятие этих эффектов под действием адаптогенных препаратов.
Выявлено изменение распределения молекул воды по подвижности в процессах инактивации спор в препаратах и высушенных образцах концентратов клеточной биомассы.
Впервые показано, что клатратообразовакие ксенона в воде при давлении -0.2 МПа и температуре -275 К сопровождается образованием дисперсных систем, в которых частицы дисперсной фазы представлены разветвленной решеткой кристаллогидратов с характеристическими размерами ~1-ь10 мкм. Показано, что на концентрацию дисперсной фазы влияют добавки третбутилового спирта и макромолекул белков. Предложен способ замораживания клеточных систем, альтернативный низкотемпературным режимам обработки.
Методами магнитного резонанса показано, что устойчивый контакт ДНК или полинуклеотидов с бислойной липидной мембраной (БЛМ) зависит от липидного состава бислоя и присутствия ионов магния. Выявлена степень возмущения молекул в бислое при образовании тройных комплексов.
Впервые ксмітіекс ЯМР-методов (ЯМР-релаксация, ЯМР-ВЫСОКОГО
разрешения, CP'M.AS ЯМР-спектроскопия и метод импульсного
градиента) использован для характеристики различных типов ИПК
в водных дисперсиях, а также в мягких (гели) и твердых
(таблетки) лекарственных формах Выявлена связь структуры ИПК <. кинетическими характеристиками активного компонента в лекарственных препаратах. По данным времен релаксации и коэффициентов еамодиффузии воды а гелях релкоешитой полиакриловой кислоты (ПАК) показано, что подвижность молекул ecav.i в рецептурах мягких лекарственных форм определяется соотношением пропиленгликоля v триэтанолзмина.
Впервые на примере межфазных адсорбционных слоев (МАС) желатины, формирующихся на границе раздела бензол-водный раствор желатины в условиях сильной стабилизации эмульсий за счет структурно-механического барьера по Ребиндеру показано включение бензола в состав МАС. Получены данные о конформационном переходе желатины (клубок-коллагеноподобная спираль) при образовании МАС.
В рамках модели ЯМР-релаксаиии воды в гетерогенных системах определено распределение воды в белковой структуре сычужных сыров и в связнодиспереной системе плавленых сыров.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Практическое
значение имеют разработанные способы стабилизации
бноколдоидных дисперсий (везикулы. клетки) добавками
днсахаридов (сахароза, трегалоза) или с помощью дисперсий
клатратов ксенона Предложен экспресс-метод (на основе ЯМР-
парамагнитного допинга) оценки клеточных повреждений
(нарушений мембранной проницаемости) при двухэтапном
замораживании микрорганизмов.
Разработаны принципы экспресс-анализа крови при стрессовых воздействиях с помощью методов магнитного резонанса
На основе метода CP/MAS разработан способ определения
структуры ИПК из комплементарных полимеров в твердых
лекарственных формах. При подборе водорастворимых компонентов
адя мягких лекарственных форм предлагается использовать данные
времен релаксации и коэффициентов еамодиффузии как
позволяющие обнаружить противоположное влияние добавок (поопиленгликоль к триэтаноламин в гелях редкосшитой ПАК) на подвижность молекул воды
Практическое значение для фармакологии, офтальмологии.
пищевой промышленности и производства кино-фотоматериалов
имеют результаты изучения устойчивых эмульсий.
стабилизированных синтетическими или природными полимерами (редкосшитой ПАК или желатиной). Показаны: управление состоянием воды, анализ многокомпонентности MAC, а также кокформационного состояния и структуры стабилизирующей пленки биополимера.
Полученные данные по распределению воды в структуре сычужных и плавленых сыров позволили уточнить механизм плавления и имеют практическую важность как для контроля процесса получения плавленых сыров, так и для надежного подбора солей-плавителей на предприятиях молочной промышленности.
-
Результаты системной характеристики комплексом ЯМР-методов различных типов ИПК в водных дисперсиях, а также в мягких (гели) и твердых (таблетки) лекарственных формах. Метод контроля стабильности ИПК в твердых формах. Характеристики взаимодействия лекарственное вещество-полимерная матрица и подвижности воды в мягких лекарственных формах.
-
Специфическое изменение воды в эмульсиях типа масло/ вода, стабилизированных редкосшитой ПАК в зависимости от объемной доли масляной фазы. Включение в состав MAC компонента масляной фазы, конформационный переход желатины (стабилизатора) при формировании MAC.
-
Закономерности изменения бислойных мембран, установленные методом ЯМР-спектроскопии высокого разрешения, в различных программах низкотемпературного воздействия. Стабилизирующее действие дисахаридов. Оптимизированные режимы замораживания.
-
Образование дисперсных систем кристаллогидратов ксенона в воде, закономерности изменения состояния воды в них в присутствии добавок различной природы. Разработанный новый способ замораживания клеточных культур, альтернативный низкотемпературному замораживанию.
5 Подходы методов магнитного резонанса в изучении свойств мембран эритроцитов и белков плазмы крови при стрессе и изменения подвижности воды при инактивации спор в условиях низкой влажности биотехнологических дисперсий.
-
Установленные методами магнитного резонанса закономерности, определяющие связывание ДНК и полинуклеотидов с БЛМ.
-
Закономерности изменения свойств воды в дисперсной системе сыров при их плавлении. Особенности образования структур плавленого сыра как концентрированных эмульсий.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы докладывались и обсуждались на Всесоюзном семинаре "Изменение структуры и свойств воль: и водных систем под влиянием физико-химических воздействии" (Киев. 1980), на Всесоюзном отраслевом совещенип "Методы радиоспектроскопии в биофизике клетки" (Оболенск, I'l.S'J). на 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 19S2), на 5-й и б и Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1984, 1938), 2-й Всесоюзной конференции по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии (Харьков, 1984), на 2-й Всесоюзной конференции по анабиозу (Рига, 1984), конференциях Молодых ученых химического факультета МГУ (Москэа, 1984, 1985), научной конференции Казанского института биологии (Казань, 1985), Международном симпозиуме по гидратации биополимеров (Пущино, 1988), на 5-й конференции Молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии (Пушино, 1988), 2-м и 7-ом Всесоюзных симпозиумах "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1981, 1989). Всесоюзной конференции "Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений" (Велигож, 1989), Всесоюзно;': отраслевой конференции "Методы радиоспектроскопии ч биотехнологии" (Оболенск, 1990V 4-й Всесоюзной конференции ''Водорастворимые полимеры и их применение" (Иркутск, 1991), 9-м Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Звенигород, 1991). на Всесоюзной конференции 'Современные направления рзззития биотехнологии" (Москва. 1991), Международной школе-семинаре "Современные проблемы физической химии макромолекул" (Москва-Пущино. 1991), на Российской научной конференции "Создание лекарственных средств" (Купавна, 1992), на Международном научном семинаре "Достижения 'Н-ЯМР спектроскопии мозга" (Оксфорд, 1992), на 13-й и 16-й Международных конференциях по магнитному резонансу 8 биологических системах (Израиль. 1992; Голландия. 1994), на 11-й и 12-й конференциях Международного общества магнитного резонанса (Берлин, 1992; Нью-Йорк, 1993), на 10-й Межденародкой конференции Европейского общества магнитного резонанса й медицине и биологии (Рим, Италия, май 1993), на Международной конференции "Liposomes as Biomirnetics" (Рим. Италия, июнь 1993). на 13-й Европейской конференции по химии поверхностей (Киев. 1994). на 10-м и П-м Международных симпозиумах по поверхностно-активным веществам в растворе (Каракас, Венесуэла, 1994; Иерусалим, Израиль. 1996). на Песковских чтениях (Москва, РГХТУ им. Д.И.Менделеева, 1994), на Ломоносовских чтениях (Москва, МГУ им. М.В.Ломоносова,
апрель 1994), на научной конференции "Коллоидная химия в
странах СНГ" (Москва, июнь 1994), на научной сессии физико-
химии поверхностно-активных веществ научного совета по
коллоидной химии и физико-химической механике (Санкт-
Петербург, апрель 1995), на Международной мемориальной
(памяти Зимкина) конференции по фотографической желатине
(Казань, 1995), на Международной конференции "Biocolloid-95"
(Киев, 1995), на 11-й Международной конференции по
Поверхностным силам (Москва, июнь 1996), на 13-й
Международной конференции Европейского общества (магнитного резонанса в медицине и биологии (Прага, Чехия, сентябрь 1996), на 7-й Международной конференции по коллоидной химии (Эгер, Венгрия, сентябрь 1996), на семинарах лаборатории коллоидной химии и кафедры коллоидной химии химического факультета МГУ.
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 72 работы.
ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ автора являлось основополагающим на всех стадиях работы и состояло в формировании научного направления, постановке задач и целей исследования, разработке экспериментальных и теоретических подходов и механизмов, выполнении эксперимента и формулировании выводов.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, б глав, выводов и библиографии из 291 ссылки. Работа изложена на 278 страницах, содержит 16 таблиц и 52 рисунка.
