Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Микробиота человека 9
1.1.1 Общая характеристика микробиоты человека 9
1.1.2 Микробиота кишечника человека и её состав 11
1.1.3 Взаимодействие кишечной микробиоты с организмом хозяина 13
1.2. Лактобациллы и бифидобактерии - постоянный компонент микробиоты человека 18
1.2.1 Общая характеристика лактобацилл и бифидобактерии 18
1.2.2 Местообитание 19
1.2.3 Таксономическое разделение 19
1.2.4 Лактобациллы и бифидобактерии - пробиотики и психобиотики 25
1.3 Гамма-аминомасляная кислота 29
1.3.1 Общая характеристика свойств гамма-аминомасляной кислоты 29
1.3.2 ГАМКи её рецепторы в организме человека 29
1.3.3 Функции ГАМК в нервной системе человека и её связь с заболеваниями 30
1.3.4 Синтез Г АМК микроорганизмами 31
1.3.5 Характеристика генов и белков, обусловливающих синтез ГАМК 34
1.3.6 Функции ГАМК в кишечнике 39
1.3.7 ГАМК-синтезирующие лактобациллы и бифидобактерии из кишечной микробиоты человека как векторы доставки ГАМК в кищечник 39
1.4 Катехоламины и серотонин 41
1.4.1 Общая характеристика катехоламинов и серотонина 41
1.4.2 Роль катехоламинов и серотонина в нервной системе человека 43
1.4.3 Влияние катехоламинов и серотонина на метаболизм бактерий 45
ГЛАВА 2. Материалы и методы 51
2.1 Микробиологические методы 51
2.1.1 Штаммы бактерий, использованные в работе 51
2.1.2 Среды и условия роста 55
2.1.3 Определение вида лактобацилл
2.2 Использованные в работе животные 57
2.3 Молекулярно-генетические методы
2.3.1 Выделение ДНК 58
2.3.2 Конструирование праймеров и проведение ПЦР 58
2.3.3 Электрофорез ДНК в агарозном геле 59
2.3.4 Секвенирование ДНК 59
2.3.5 Выделение тотальной РНК 59
2.3.6 Обратная транскрипция 60
2.3.7 Количественная ПНР в режиме реального времени 61
2.4 Биохимические методы 62
2.4.1 Тонкослойная хроматография 62
2.4.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) 62
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждения 65
3.1 Идентификация и характеристика штаммов лактобацилл, выделенных из трёх
биотопов человеческого тела 65
3.1.1 Видовая идентификация изолятов лактобацилл, населяющих кишечник, ротовую
полость и влагалище человека 65
3.2 Изучение синтеза ГАМК из лабораторной коллекции штаммами лактобацилл и
бифидобактерий 68
3.2.1 Отбор штаммов лактобацилл и бифидобактерий, синтезирующих и выделяющих в среду ГАМК 68
3.2.2 Определение количества ГАМК, синтезируемой лактобациллами и бифидобактериями.69
3.2.3 Наличие генов глютаматдекарбоксилазы у штаммов лактобацилл и бифидобактерий 72
3.2.4 Характеристика синтеза ГАМК у 4-х штаммов бактерий, отобранных в качестве пробиотиков 75
3.2.5 Характеристика генов, обусловливающих синтез ГАМК 82
3.2.6 Изучение экспрессии гена глутаматдекарбоксилазы gady штаммаL.plantarum 90sk 86
Данный раздел работы был выполнен в Институте морфологии человека РАМН совместно с
Ю.Е. Козловским 90
3.2.7 Определение влияния штамма L.plantarum 90sk на крыс в условиях холодового холода.90 3.3 Изучение влияния катехоламинов и серотонина на рост и транскрипционную активность лактобацилл и бифидобактерий 94
3.3.1 Оптимизация условий опытов по влиянию нейротрансмиттеров на рост лактобацилл и бифидобактерий 94
3.3.2 Изучение влияния норадреналина, адреналина, дофамина и серотонина на рост лактобацилл и бифидобактерий 97
3.3.3 Изучение влияния норадреналина на транскрипционную активность генов L.plantarum 90sk методом ПЦР в реальном времени 108
Заключение 111
Выводы 112
Список сокращений, использованных в работе 114
Список литературы
- Микробиота кишечника человека и её состав
- Синтез Г АМК микроорганизмами
- Определение вида лактобацилл
- Изучение влияния катехоламинов и серотонина на рост и транскрипционную активность лактобацилл и бифидобактерий
Микробиота кишечника человека и её состав
Наибольший интерес для изучения представляет экосистема толстого кишечника, так как она является наиболее значимой по количеству микроорганизмов их разнообразию и по степени влияния на гомеостаз организма хозяина (Sender et al., 2016).
Было охарактеризовано более 1000 видов бактерий, населяющих кишечник человека (Rajilic-Stojanovic et al., 2014). Самыми многочисленными типами являются Firmicutes и Bacteroidetes. (Human Microbiome Project Consortium, 2012; Qin et al., 2010). Количество бактериальных клеток в кишечнике взрослого человека превосходит количество эукариотических клеток в 10 раз и достигает 1014 степень.
Наука, изучающая набор генов всех микроорганизмов, находящихся в образце среды называется метагеномикой (Tringe and Rubin, 2005). В мире было запущено несколько масштабных проектов по изучению метагенома человека: проект "Микробном человека" (Human Microbiome Project) - инициатива национальных институтов здравоохранения США, преследовавшая несколько целей, самыми главными из которых являлись создание базы данных метагеномов, предварительная характеристика метагенома человека и изучение связи между изменениями в составе микробиома человека и заболеваниями. В проекте участвовало 242 здоровых добровольца из США; более 5000 образцов были собраны с 15 биотопов у мужчин и 18 биотопов у женщин; основными из них были ротовая полость, носовая полость, поверхность кожи, содержимое толстого кишечника и вагинальная полость. Бактериальный состав метагеномов определяли по нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК. В результате проекта было опубликовано 190 работ в рецензируемых журналах с июня 2009 года по август 2012 год и сделан ряд открытий; установлено, что количество бактериальных белок-кодирующих генов превосходит количество генов человека в 360 раз (The Human Microbiome Project Consortium, 2012).
Проект "MetaHIT" находится под финансированием европейской комиссии; проект нацелен на создание каталога генов микроорганизмов, обитающих в кишечнике. В проекте учавствовало 124 индивидуума из Дании и Испании. Участники проекта были разбиты на три категории: здоровые люди, люди с избыточным вестом и люди, страдающие болезнью раздражённого кишечника. В результате был сделан вывод, что до 90% всех бактерий в дистальном отделе кишечника относятся к типам Bacteroidetes и Firmicutes. было идентифицировано 1244 метагеномных кластера, играющих критическую роль в поддержании здорового кишечника. У людей с воспалённым кишечником наблюдалось снижение разнообразия бактерий в кишечнике и, соответственно, количество бактериальных генов в кишечнике было на 25% ниже, чем у здоровых людей (Dusko et al, 2010; Din, 2014).
Немаловажный вклад внесло китайское исследование, целью которого было изучение состава кишечной микробиоты людей, больных диабетом 2 типа. В исследовании принимали участие 345 индивидуумов из Китая. В результате было идентифицировано 60 000 маркеров, ассоциированных с диабетом 2 типа. У больных диабетом 2 типа наблюдались умеренный дисбиоз кишечника, снижение количества бутират-продуцирующих бактерий и повышение количества условно-патогенной флоры (Qin et al. 2012).
Сегодня исследовано более 2000 микробиомов, что принесло понимание экологии кишечника: микробном человека содержит 5 миллионов генов, таким образом превосходя количество генов организма хозяина на два порядка (Human Microbiome Project Consortium, 2012). В 2011 году была введена новая классификация микробиомов у людей, называемая энтеротипом (Arumugam et al., 2011). Энтеротип человека не столько зависит от возраста, пола, веса тела или национальности человека, насколько от его преобладающего типа питания. Энтеротип №1 характеризуется преобладанием бактерий рода Bacteroides. Энтеротипу №2 свойственно наличие несколько видов Bacteroides, но преобладает род Prevotella, и энтеротип №3 характеризуется преобладанием бактерий рода Ruminococcus. Однако с появлением новых работ по изучению микробиома людей из разных местобитаний делаются новые открытия; например, в работе (Tyakht et al., 2013) по изучению метагеномов 96 здоровых российских людей, были описаны микробиомы, в которых преобладают виды, относящие к типам Firmicutes и Actinobacteria, а бактерии рода Bacteroides слабо представлены. При этом стоит отметить, что до 80% секвенированных метагеномов в настоящий момент не может быть отнесено к какому-либо виду. До 50% семейств генов из микробиомов остаются функционально охарактеризованными; даже у хорошо изученной Escherichia coli К12 для 18% генов функции не известны (Karp et al., 2007).
Синтез Г АМК микроорганизмами
Воздействие нейрогормонов организма хозяина на рост и поведение населяющих его микроорганизмов является принципиально новой сферой для исследования, которая лежит в русле новой научной дисциплины "микробная эндокринология" (Lyte, 2004; Freestone et al. 2008a 2010, 2013; Lyte & Freestone 2008b; Freestone, 2010, 2013). Центральное место в этой области занимают катехоламины - адреналин, норадреналин и дофамин (Freestone, 2013). Предпосылкой этого направления является предположение, что возникновение стресса у человека и животных приводит к развитию у них инфекционного процесса (Reiche et al. 2004, Glaser & Kiecolt-Glaser 2005). Когда организм подвергается стрессовым факторам, выбрасываются катехоламины и другие стресс-ассоциированные гормоны в кровь, они распознаются иммунными клетками организма с помощью специальных рецепторов, что приводит к падению иммунитета (Reiche et al. 2004, Glaser & Kiecolt-Glaser 2005). Наряду с этим, выбрасываемые в кровь катехоламины попадают в кишечник и усиливают рост (до 5 логарифмических порядов) и вирулентность бактерий, что было показано сначала in vitro на E.coli (Lyte & Ernst, 1992), затем на ряде других видов бактерий (табл.7). Объектом исследования в этих работах служили условно-патогенные бактерии в связи с их большим значением для клинической практики (Vlisidou et al. 2004; Dowd, 2007; Toscano et al., 2007). Влияние катехоламинов на метаболизм бактерий, возможно является одной из причин изменений в составе кишечной микробиоты, наблюдаемых у людей, находящихся в стрессовых условиях (табл.3).
Адреналин, норадреналин и дофамин присутствуют в крови в низких наномолярных концентрациях (Goldstein et al., 2003). В условиях стресса их концентрация в крови возрастает в 1000 раз как это было показано у пациентов в послеоперационном периоде (Thompson et al., 1999). Влияние катехоламинов на рост и вирулентность бактерий проявляется, начиная с микромолярных концентраций (Freestone et al., 2012; Sandrini et al., 2015). Точную концентрацию катехоламинов в кишечнике определить сложно; это связано с такими особенностями, как поступление катехоламинов с пищей, их высокий уровень метаболизма, высокая адсорбирующая способность фекальной массы и т.д. (Pullinger et al., 2010). Есть данные, что при острых стрессах катехоламины попадают в кишечник из кровяного русла, а норадреналин активнее синтезируются симпатическими нервными окончаниями кишечника (Aneman et al, 1996; Lyte & Bailey, 1997). Дофамин синтезируется энтеральными нейронами, локализованными в стенке кишечника (Eisenhofer et al., 1997; Costa et al., 2000; Goldstein et al., 2003). Адреналин же не синтезируется в кишечнике ввиду отсутствия экспрессии необходимого для этого фермента фенилэтаноламин N-метилтрансферазы, что объясняет, почему бактерии чаще отвечают на стресс присутствием в кишечной микробиоте норадреналина и дофамина (Costa et al., 2000; Goldstein et al., 2003). Определённый вклад в синтез катехоламинов может вносить кишечная микробиота включая Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Bacillus spp., Proteus vulgaris, Serratia marcescens и S.aureus (Lyte et al., 2011; Oleskin et al., 2014; Tsavkelova et al., 2006). Есть отдельные немногие данные о синтезе катехоламинов и серотонина бактериями, полученных при высокоэффективной жидкостной хромотографии бактериальных культур (Oleskin, 2014; Ozogul, 2011). Однако выделение и очистка этих веществ из каких-либо бактерий не были описаны. Бутират, синтезируемый кишечными бактериями, индуцирует транскрипционную активность тирозин гидролазы, фермента, лимитирующиего скорость биосинтеза катехоламинов (Patel et al., 2005). Кишечная микробиота экспрессирует бета-глюкуронидазы, ферменты, катализирующие реакции получения свободных молекул норадреналина и дофамина из их связанных форм (Asano et al., 2012). В этом исследовании, авторы измеряли концентрацию норадреналина и дофамина в просвете кишечника стерильных и беспатогенных мышей. Содержание катехоламинов в просвете кишечника был ниже у стерильных мышей чем у беспатогенных мышей. Более того, большинство катехоламинов в просвете кишечника беспатогенных мышей находилось в свободной форме, а у стерильных мышей в связанной неактивной форме. Введение стерильным мышам бактерий видов Streptococcus или кишечной микробиоты беспатогенных мышей, в которых изобилует р-глюкуронидаза, приводило к повышению уровня свободных катехоламинов в кишечнике. Введение E.coli стерильным мышам приводило также к увеличению уровня свободных катехоламинов в кишечнике; введение мышам штамма E.coli, мутантного по гену, кодирующему р-глюкуронидазу, не влияло на уровень катехоламинов в кишечнике мышей. Концентрация норадреналина и дофамина в просвете кишечника беспатогенных мышей составили 48±7 и 132±19 нг/г соответственно (Asano et al., 2012). На сегодняшний день не удаётся разграничить вклад энтеральной системы и кишечной микробиоты в синтез катехоламинов.
Хотя влияние катехоламинов на метаболизм бактерий уже доказано, данные о наличии у бактерий адрено- и дофаминергических рецепторов, подобных тем, что обнаруживаются у эукариот, пока отсутствуют (Freestone, 2013). Двухкомпонентные сенсорные киназы являются потенциальными рецепторами катехоламинов, так как у E.coli 0157:Н7 была показана способность системы QseC связывать норадреналин и адреналин (Clarke et al., 2006). Однако в работе (Pullinger et al., 2010 a,b) было показано, что нокаут системы QseC у E.coliO\57:W7 не имел никаких последствий на способность штамма к узнаванию норадреналина и адреналина. Система QseC связывается с другим микробным метаболитом, именуемом автоиндуктор З (АИ-3), который является продуктом работы ключевого фермента в системе quorum sensing АИ-2 и кодируемого геном luxS (Waters et al., 2005; Clarke et al., 2006; Walters et al., 2006). Однако нокаут гена luxS также не сказывался на способности штамма E.coli реагировать на норадреналин и адреналин усилением роста и вирулентности (Haigh et al., 2013). Эти исследования позволяют предположить, что существуют дополнительные бактериальные системы распознавания катехоламинов, отличные от системы Qsec у E.coli и независимые от АИ-2.
Определение вида лактобацилл
Для исследования влияния на лактобацилл и бифидобактерий были выбраны 3 нейротрансмиттера, относящихся к семейству катехоламинов (норадреналин, адреналин и дофамин), продукция которых организмом человека значительно увеличивается в стрессовых условиях. Действие серотонина на рост бактерий мы рассматривали как некий контроль, так как серотонин присутствует постоянно в кишечнике и никак не связан с реакцией организма на стресс.
Опыты по оптимизации условий были проведены со штаммом L.plantarum 90sk. Выращивание штамма L.plantarum 90sk в среде MRS с норадреналином и дофамином не приводило ни к стимуляции, ни к ингибированию роста. Поэтому мы выбрали другую питательную среду, SAPI, на основе сыворотки крови крупного рогатого скота, которая была использована в аналогичных опытах с другими бактериями (Freestone et al., 2000).
На первом этапе были определены оптимальные концентрации норадреналина, длительность выращивания бактериальной культуры и исходная концентрация клеток (Freestone et al., 2000), необходимые для определения влияния нейротрансмиттеров на рост лактобацилл.
Влияние различных концентраций норадреналина на рост штамма L.plantarum 90sk. в среде SAPI (48 часов). На рисунках 22 и 23 видно, что добавление норадреналина в среду SAPI стимулирует рост штамма L.plantarum 90sk, начиная с концентрации 25 мкМ. Штамм L.plantarum 90sk характеризовался слабым ростом или отсутствием роста в среде SAPI без норадреналина. При концентрации 25 мкМ, рост культуры увеличивался на 3 порядка за 48 часов, а при концентрации норадреналина 200 мкМ число КОЕ составило 106 в мл. Пропорциональная зависимость между ростом штамма L.plantarum 90sk и количеством норадреналина в среде говорит о его дозозависимом эффекте. Исходя из представленных данных, мы выбрали концентрацию 100 мкМ как оптимальную для проверки влияния норадреналина и других нейротрансмиттеров на рост лактобацилл. Log числа КОЕ 6 5 4 3 2 1 0 24 72 НА(ЮОмкМ) без НА Время роста в часах
Рост штамма L.plantarum 90sk в среде SAPI в присутствии норадреналина отличался продолжительной экспоненциальной фазой, которая длилась до 72 часов, в то время как без норадреналина штамм не был способен к росту в данной среде (рис. 24). Количество исходно добавленных клеток составило 102-103. К 72 часам, рост штамма достигает стационарной фазы. Нужно сказать, что характер роста штамма отличался от опыта к опыту, различия проявлялись в сдвигах в скорости роста. Поэтому в дальнейших опытах, мы регистрировали окончание опыта в различных временных промежутках (48-96 часов).
Целью изучения влияния катехоламинов и серотонина на рост различных штаммов лактобацилл и бифидобактерий было установить, как реагируют штаммы на присутствии этих веществ (стимуляция/ингибирование) и имеются ли отличия между видами и штаммами одной видовой группы. Результаты по отдельным видам представлены на рисунках 25-33, суммарные данные представлены в табл. 18-19.
Влияние нейромедиатов на рост различных штаммов вида Lactobacillus plantarum. NA-норадреналин, А-адреналин, D-дофамин, S-серотонин. Влияние различных нейротрансмиттеров на рост штаммов вида L.plantarum варьировало от одного штамма к другому. Некоторые штаммы данного вида чувствительны к действию катехоламинов {L.plantarum 90sk, L.plantarum 29sk), а такие штаммы, как L.plantarum 46k, оказались неспособными к росту в среде SAPI.
Наибольшую чувствительность к катехоламинам и серотонину проявили штаммы вида L.fermentum. Все изученные штаммы данной видовой группы, кроме L.fermentum 439, L.fermentum 253 и L.fermentum 311, были неспособны расти в среде SAPI без добавления нейромедиаторов. Число КОЕ некоторых штаммов в присутствии норадреналина, адреналина и дофамина достигало 105 и 106. Влияние серотонина на рост большинства штаммов было менее значительным, за исключением штамма L.fermentum 253. Штамм L.fermentum 102sk оказался нечувствительным к действию нейромедиаторов. К
Влияние нейромедиатов на рост различных штаммов вида Lactobacillus rhamnosus. NA-норадреналин, А-адреналин, D-дофамин, S-серотонин.
Штаммы L.rhamnosus отличались относительно хорошим ростом в среде SAPI. Наибольшее влияние на рост оказали норадреналин и дофамин, в меньшей степени адреналин и серотонин. Число КОЕ большинства штаммов достигало 106.
Влияние нейромедиатов на рост различных штаммов вида Lactobacillus salivarius. NA-норадреналин, А-адреналин, D-дофамин, S-серотонин. Все штаммы вида Lactobacillus salivarius были чувствительными к норадреналину, в частности штамм L.salivarius 44st, который также был чувствительным к дофамину и адреналину.
Влияние нейромедиатов на рост различных штаммов вида Lactobacillus casei. NA-норадреналин, А-адреналин, D-дофамин, S-серотонин.
Один штамм L.casei 131 из трёх изученных был чувствителен ко всем нейротрансмиттерам в равной степени. Остальные штаммы не были способны расти в минимальной среде SAPI.
Штамм B.adolescentis km-4 был способен расти в среде SAPI вне зависимости от добавления нейротрасмиттеров, число КОЕ достигало 107. Штамм B.adolescentis 48 не был способен к росту в среде SAPI без нейромедиаторов и число КОЕ достигало 106 в их присутствии. Штамм B.adngulatum GT102 был способен давать 104 КОЕ без нейромедиаторов; все нейротрасмиттеры стимулировали его рост в 10 раз. Штамм B.adolescentis 150 не был способен к росту в среде SAPI вне зависимости от добавления нейротрансмиттеров.
Изучение влияния катехоламинов и серотонина на рост и транскрипционную активность лактобацилл и бифидобактерий
Норадреналин достоверно стимулировал транскрипционную активность генов, участвующих в транспорте железа (feoA, feoB), антиоксидантной активности (trxB) и адгезии (mub) у штамма L.plantarum 90sk. Влияния норадреналина на транскрипционную активность генов gshAB и сер А не было. В дальнейшем планируется проведение транскриптомного анализа для идентификации генов лактобацилл, реагирующих на норадреналин, в частности, предполагаемых генов рецепторов, вовлечённых в узнавании норадреналина.
Активация генов feoA и feoB согласуется с данными раздела (см. литературный обзор) об участии НА в транспорте железа в клетки бактерий. Активация двух других генов говорит о более широком влиянии норадреналина на метаболизм клетки. Для функционирования L.plantarum 90sk в ЖКТ важна активация генов адгезии, т.е. генов, обусловливающих прикрепление бактерий к стенке кишечника. Возможно, при увеличении концентрации НА в ЖКТ происходит активация генов, участвующих в адгезии, что способствует лучшей адаптации L.plantarum.
В литературе описано влияние норадреналина и адреналина на экспрессию генов преимущественно у патогенных бактерий. К таким бактериям относятся энтерогеморрагическая E.coli, Porphyromonas gingivalis, Salomonella enterica, Streptococcus penumoniae, Haemophilus influenzae, C.rodentium, Pseudomonas aeruginosa и другие. Влияние норадреналина и адренлина выражается в активации генов вирулентности (гены гемагллютнации, протеолиза, фимбрий, адгезинов и липополисахаридов), антиоксидантной активности (гены биосинтеза глютатиона, тиоредоксина, линолевой кислоты), биоплёнкообразования (гены синтеза внеклеточного полисахаридного матрикса), метаболизма Сахаров (гидролазы, галктокиназа, пируват оксидаза) и железа (гены транспорта железа и восстановления трёхвалентной формы до двухвалентной) (Graziano et al., 2014). Данные по влиянию нейротрансмиттеров на экспрессию генов у лактобацилл отсутствуют.
Полученные нами результаты говорят о том, что НА увеличивает транскрипционную активность также и генов лактобацилл (L.plantarum 90sk) -т.е. подобные симбиотические бактерии в стрессовых условиях могут составить конкуренцию патогенам.
В работе были исследованы штаммы лактобацилл и бифидобактерий (144 в одной части работы и 61 - в другой). Показано, что исследованные бактерии способны синтезировать и секретировать в среду ГАМК - основной тормозной медиатор нервной системы человека. В наших опытах это свойство было видоспецифичным и присущим всем штаммам видов L.plantarum, L.brevis, B.adolescentis, B.angulatum, B.dentium, всего 58 штаммам; по литературным данным, это свойство может быть обнаружено и у отдельных штаммов других видов. Количество секретируемой ГАМК колеблется в широких пределах, однако оно ниже, чем у штаммов лактобацилл, выделенных из пищевых продуктов. Опыты по введению штамма-продуцента ГАМК животным, находящимся в условиях стресса, показали, что в крови животных увеличивается количество ГАМК и уменьшается - гормона пролактина. Более 80% проверенных штаммов реагировали усилением роста (в 10-104 раз по числу КОЕ) на присутствие в среде катехоламинов и серотонина. Это свойство было штаммоспецифичным. Для штамма L.plantarum 90sk было показано, что адреналин увеличивает экспрессию ряда генов.
Подобное исследование большого количества штаммов лактобацилл и бифидобактерий было проведено впервые. Полученные результаты позволяют утверждать, что ГАМК, катехоламины и серотонин участвуют в коммуникации бактерий-симбионтов (лактобацилл и бифидобактерий) и организма человека. Способность синтезировать ГАМК, и активация роста и транскрипции ряда генов под действием катехоламинов и серотонина являются важными свойствами бактерий и должны быть использованы при селекции пробиотических штаммов. Исследованные нами штаммы L.plantarum 90sk, L.brevis 15f, B.adolescentis 150, B.angulatum GT102, обладающие подобными свойствами, являются потенциальными пробиотиками.