Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Система «ПОЛ - антиоксиданты» 11
1.1.1. Перекиснос окисление ненасыщенных жирных кислот липидов мембран как регуляторний процесс 11
1.1.2. Антиоксидантная защита липидов биологических мембран 19
1.1.2.1. Ферменты-антиоксиданты 21
1.1.2.2. Низкомолекулярные антиоксиданты 22
1.2. Роль проиессов процессов избыточного перекисного окисления липидов при различных патологиях органов и тканей 25
1.3. Антиоксидантная система защиты растений 34
1.3.1. Эволюция антиоксидантных механизмов 34
1.3.2- Антиоксиданты растительной клетки 35
1.3.3. Флавоноиды и их биосинтез в растениях 38
1.3.3.1. Классификация флавоноидов 38
1.3.3.2. Физико-химические и химические свойства флавоноидов 42
1.3.3.3. Биосинтез флавоноидов 43
1.3.4. Аскорбиновая кислої а в растениях и се участие в метаболизме 48
1.3.4. Биогенез в растениях 48
1.3.4.2. Участие АК в метаболических процессах 49
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ, ВЫТЕКАЮЩИЕ ИЗ ЛИТЕРАТУРНОГО ОБЗОРА 52
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДИКИ
2.1. Объект и методика проведения физиологических исследований 55
2.1.1. Краткая характеристика растения 55
2.1.2. Методы подготовки растительного материала 57
2.1.3. Влияние способов подготовки проб па сохранность рутина 57
2.1.4. Изучение влияния недостаточного водообсспсчсния и низких положительных температур па биосинтез БАВ в проростках 60
2.1.5. Характеристика препаратов «Эпсорин» и «Родиола розовая» 60
2.1.6. Объект и методика эксперимента по изучению влияния экзохекного рутина при иммобилизациошюм стрессе 62
2.1.7. Объект и методика эксперимента для изучения влияния экзогенного комплекса антиоксидантов при сахарном диабете 63
2.2. Методики проведения биохимических исследований 64
2.2.1. Методика определения суммы флавоноидов 64
2.2.2. Методика определения содержания рутина 65
2.2.3. Методика определения содержания АК в растениях 66
2.2.4. Методика определения содержания антиоксидантов 67
2.2.5. Методика определения интенсивности ПОЛ с помощыоТБК 67
2.2.6. Методика подготовки ткани печени для анализа 68
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1.Рутин в растениях Якутии 69
3.1 1. Содержапие рутина в различных органах некоторых дикоросов Якутии и его биологическая роль 69
3.1.2. Накопление рутина в чависимости от погодных условия 72
3.2. Флавоноиды и аскорбиновая кислота в растениях Якутии 78
3.2. Е Флавоноиды в некоторых видах дикорастущих растений Якутии 78
3.2.2. Аскорбиновая кислота в некоторых видах дикорастущих растений Якутии 92
3.2.3. Влияние почвенно-влажпостнмх условий на накопление флавоноидов и аскорбиновой кислоїы в растениях 106
3.2.4. Изучение влияния низких положительных температур и недостаточного водообеепечения на биосинтез БАВ в проростках в камеральных условиях 110
3.3. Протекторное действие рутина при иммобилизационном стрессе белых мышей 114
3.4. Снижение интенсивности в крови больных сахарным диабетом природными комплексами антиоксидантов 119
3.4.1. Изменение уровня ПОЛ и антиоксидаитиой активности при сахарном диабете по сравнению с патологиями печени 120
3.4.2. Результаты комплексной терапии препаратами «Эпсорин» и «Родиола розовая» больных сахарным диабетом 122
ВЫВОДЫ 128
ЛИТЕРАТУРА J34?
ПРИЛОЖЕНИЯ 147
- Перекиснос окисление ненасыщенных жирных кислот липидов мембран как регуляторний процесс
- Влияние способов подготовки проб па сохранность рутина
- Накопление рутина в чависимости от погодных условия
Введение к работе
За последнее время область медико-биологических знаний расширила
свои пределы и достигла глубин понимания фундаментальных процессов,
происходящих в живом и, в частности, в человеческом организме. Одним из
таких универсальных процессов является перскисное окисление липидов
(ПОЛ), цепное окисление ненасыщенных жирных кислот с участием
молекулярного кислорода, обеспечивающее расширенное воспроизводство
свободных радикалов [1 ], Известно, что умеренная активация I ЮЛ в ответ на
действие поражающего фактора является одним из адаптационных
механизмов и направлена на увеличение проницаемости клеточной
мембраны, облегчение работы мембранных белков. Однако, выходя за
определенные пределы, эти сдвиги приобретают самостоятельное
патогенетическое значение, которое проявляется денатурацией и
инактивацией белка, делипидизацией мембраны, нарушением деления и
роста клетки [2]. Т.е. в нормальной физиологии клетки процессы ПОЛ
играют важную роль как элемент регуляторной системы. л ^
Уровень протекания процессов ПОЛ контролируется антиоксидантной системой (ДОС). Антиоксиданты - это вещества, которые относятся к различным классам химических соединений, но объединены способностью переводить свободные радикалы в неактивное состояние. Механизмы их действия могут быть весьма различны - от непосредственного связывания свободнорадикальных групп, до повышения устойчивости клеточных структур и макромолекул к их повреждающему воздействию [3],
АОС и ПОЛ образуют единую систему, которая в норме находится в динамическом равновесии [2],
Антиоксиданты могут быть синтезированы самим организмом или поступают извне. К ним относятся биологические активные вещества (БАВ) антиоксидантного действия растительного и животного происхождения. БАВ осуществляют гармоническую взаимосвязь и взаимозависимость всех физио-
логических и биохимических процессов в организме. Нормализуя, регулируя все жизненные функции, они играют существенную роль в формировании стрессоустойчивое и адаптации организмов. Основными источниками БАВ являются растения.
Флавопоиды - полифенолы, синтезируемые только растениями, давно привлекли внимание исследователей как широко распространенные антиоксиданти с высокой активностью. Антиоксидантная активность этих соединении сравнима с активностью самых сильных аптиоксидантов. например, а-токоферола [4,5]. Механизм защитного действия флавопоидов от свободпорадикальиых процессов, в часгиосги от ПОЛ. заключается в способности этих соединений хелатировать ионы металлов (Fe21", Си2") [6,7], перехватывать липидные радикалы ("ловушки" СР) [3,5,6,8,9], ингибировать действие оксигеназ (липооксигепазы) [6]? миелопероксидазы [10]. Таким образом, флавоноиды способны прерывать как неферментативное так и ферментативное ПОЛ. Основываясь на отих свойствах, флавоноиды обладают различным терапевтическим действием: антиатеросклеротическим [11], противоопухолевым [12,13,14], антимугагенньш |4], противорадиационным [15,16], противовирусным [17], иммунорегулирующим и противовоспалительным [18,19]. При таком разнообразном фармакологическом эффекте преимущество флавопоидов перед другими физиологически активными веществами заключается в их низкой токсичности, т.к. флавоноиды не являются для человека кееногеппыми веществами 116]. Таким образом, флавоноиды являются доступными антиоксидантами, обладающими сильной антирадикальной активностью и многообразием терапевтического действия, низкой или отсутствием токсичности.
Биохимические и физиологические особенности растений формируются под воздействием условий произрастания. Как известно, экстремальные экологические условия Якутии способствуют повышенному синтезу БАВ в растениях этого региона [20]. Рекогносцировочные работы по содержанию
алкалоидов [21,22], сапонинов [23,24], эфирных масел [25,26], флавоноидов [27], танидов [28], кумаринов [29] в дикорастущих растениях Якутии показали, что в целом природные условия Якутии благоприятствуют биосинтезу в растениях БАВ. Наиболее подробные исследования химического состава растений были предприняты А.Д.Егоровым и его учениками- Были выявлены закономерности накопления витамина С и каротина в растениях в зависимости от конкретных экологических условий произрастания [30]. Многолетние исследования А.Д.Егорова и других показали, что химический состав растений является интегральным отражением действия на них экстремальных условий Севера- В настоящее время проводятся исследования по изучению влияния условий произрастания на биосинтез антиоксидантних ферментов и низкомолекулярных антиоксидантов в растениях Якутии в области радиобиологии [31,321, а также на культурных растенкях [33], Однако влияние экстремальных условий Севера на биоеитез БАВ, в частности, флавоноидов в дикорастущих видах якутских экоформ по-прежнем> остается наименее изученным.
Актуальность и значимость изучения песпеиифической антиокендант-ной системы организмов к экстремальным условиям Севера позволили нам сформулировать цель данной диссертации.
Цель работы - изучить накопление некоторых нижомояеку.іярньїх антиоксидантов в растениях Якутии в зависимости от климатических, погодных условий произрастания, в межвидовом и межорганном отношении, а также их влияние на стрессоустойчивость растительных и животных организмов, включая человека.
Научная новизна. Впервые приводятся количественные данные о содержании флавоноидов в цветках и листьях некоторых дикорастущих растений в условиях Якутии, Показано влияние почвенно-влажностных и темпера-
турных условий, солнечной инсоляции на биосинтез комплекса флавоноидов и флавонолового гликозида рутина, а также аскорбиновой кислоты.
Показано, что рутин снижает интенсивность ПОЛ при иммобилизаци-онном стрессе белых мышей. При этом антиоксидантное действие рутина реализуется при стрессе не столько за счет непосредственного взаимодействия с липидными радикалами, сколько, по-видимому, за счет опосредованного действия в протективпом эффекте по отношению к ферментам-антиокси-дантам печени.
Показано достоверное снижение уровня ПОЛ у больных сахарным диабетом при коррекции препаратами местного производства «Эпсорин» и «Родиона розовая» па фоне традиционного лечения.
Практическая значимость. Выведены зависимости накопления рутина, суммы флавоноидов, аскорбиновой кислоты в 5 видах дикорастущих растений Якутии от конкретных условий произрастания - инсоляции, температуры воздуха, влагообеспеченш. Эти зависимости дают основу для практического использования и прогнозирования накопления данных БАВ в изученных лекарственных растениях при интродукции.
На основе проведенных исследовании по коррекции ПОЛ у больных сахарным диабетом препаратами «Эпсорин» и «Родиола розовая» данные препараты рекомендуются для комплексной терапии сахарного диабета.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на научно-практических конференциях молодых ученых и аспирантов (г.Якутскэ 1996, 1997, 2000), VII Молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2000), Международной конференции «Флора, растительность и растительные ресурсы Забайкалья» (Чита, 2000), на научных конференциях Института биологических проблем криолитозоны СО РАН и БГФ ЯГУ.
Личный вклад соискателя. Основные результаты диссертационной работы были получены лично соискателем. Его же проведена аналитическая
обработка, основная интерпретация полученных результатов и подготовка
публикаций, ^
Основные положения, выносимые на зашиту.
L Климатические и погодные (почвенно-влажностные, температурные, солнечная инсоляция) условия произрастания растений формируют их неспецифический физиолого-биохимический адаптивный потенциал, включающий уровень антиоксидантной защиты с участием НМАО.
2. Эффективная стабилизация процессов ПОЛ при формировании антистрессовой реакции или при лечении патологий, связанных с нарушением системы «ПОЛ - аптиоксиданты», происходит при действии комплекса низкомолекулярных антиоксидантов.
Перекиснос окисление ненасыщенных жирных кислот липидов мембран как регуляторний процесс
Витамин А и его предшественники - карогиноиды - являются полиненасыщенными соединениями, для которые характерно чередование простых и сопряженных двойных связей. Природная форма витамина А - ретинол (вит. А) и реіинолпальмиїат. Витамин А влияет на метаболизм мембранных фоефо-липидов и лот стабилизирующий эффект его физиологических концентраций определяется способностью регулировать ПОЛ. С наличием сопряженных связей в молекуле витамина А и с его участием в обмене тиоловых соединений связано свойство нормализовать структурно-функциональные свойства мембран. Т.о. пит, А имеет прямое отношение к архитектуре и функционированию биомембран [44].
Витамин Д? в водной среде при физиологических значениях температуры и рН быстро подвергается автоокислению. Изучение механизма этих превращении показало, что автоокисление витамина Д2 сопровождается интенсивной хемилюминсспенцией [45]. Антиоксиданті, в частности [3-ионол (бутштокситолуол), подавляют хемилюминесиенцию витамина Д? и аутоокисление. Легкость, с которой витамин Д2 подвергается аутоокислению, его способность образовывать свободные радикалы и ускорять перекисное расщепление ненасыщенных липидов, позволяет высказать предположение о возможной роли СР процессов в превращениях и механизме действия этого витамина, в частности его влияния на проницаемость липопротеидных мембран [46].
Эстрогены. В силу своей бифильности стероидные гормоны (особенно эстрогены) обладают мембранотропными свойствами. Поэтому они могут накапливаться в биомембраиах и непосредственно влиять на их структуру и функцию. При патологических состояниях, сопровождающихся чрезмерной активацией процессов ПОЛ, эстрогены могут противодействовать повреждению биомембран и предупреждать нарушение микросомального оксиления стероидных гормонов, холестерина и многих других веществ [47],
Самая активная группа антиоксидантов среди фенольных соединений - флавоноиды. Наиболее распространенными пигментами у высших животных и человека являются меланины. Они образуются путем СРО-полимеризации пирокатехинов, диоксифенола, тирозина и фенилаланина. Важным свойством многих фенольных соединений является способность к обратимому окислению, т.е. переходу из фенольных форм в хиноидные, и восстановлению последних в хиноны. Этот процесс рассматривается многими исследователями как способ регулирования СРО липидов мембран [48]. Благодаря способности препятствовать фотоокислительному эффекту солнечной радиации, фенольные антиоксиданты часто вводят в состав эмульсий и кремов, применяемых в качестве средств защиты кожи от загара.
Убихинон (коэнзим-О) содержится во всех клетках,и необходим для протекания в них процессов окисления. Биологическое действие его основано на способности к обратимым окислительно-восстановительным реакциям, антиоксидантной активности. Активность убихипона, как было показана в эксперименте, оказалась сопоставимой с активностью токоферола, в особенности в реакции блокирования перекисных соединений. Различия в том, что токоферол осуществляет первичную защиту от ПОЛ, убихинон же в этих реакциях участвует на более глубоких стадиях процесса. [49]. Наиболее важным при реіулирокании перекисного окисления липидов в биологических мембранах является жирорастворимый витамин Е - гс-токо-ф. ШЬ Существует несколько природных токоферолов. Вес они являются 6-гидроксихроманами или токолами с изопреноидными заместителями, а-токоферол наиболее широко распространен и имеет наибольшую биологическую активность как витамин. Витамин Е выполняет по крайней мере две метаболические функции. Во-первых, он служит наиболее сильнодействующим природным антиоксидантом, во-вторых, выполняет специфическую, хотя и не до конца понятную роль в метаболизме селена [50].
Витамин Е, по всей видимости, является «первым эшелоном защиты» клеточных и субклеточных мембранных фоефолипидов от перекисного окисления. Фосфолнпиды митохондрий, : пдоплазматического ретикулума и плазматических мембран обладают специфическим сродством к а-токоферолу, поэтому витамин, по-видимому, концентрируется в составе этих мембран [50].
Токоферолы действуют как антиоксиданты, прерывающие цепи окисления благодаря их способности переносить фенольный водород на перок-сидньтй радикал.
Влияние способов подготовки проб па сохранность рутина
Подготовка растений для количественного определения в них фла-воноидов и рутина была сделана двумя методами: медленная сушка на воздухе и немедленное погружение в 80% этанол-Ферментативный распад гликозндов флавоноидов начинается уже в только что срезанных растениях, В едязи с этим собранное сырье лекарственных растений необходимо как можно быстрее подвергнуть сушке. Недо-лусхямо глшозндсодержащее сырье держать в скученном виде, ябо это приводит к повышению температуры внутри биомассы и созданию благоприятных условий для разложения гликозидов. Нельзя допускать отсыревания высушенных растений при хранении. В сухом материале активность ферментов незначительна и они своего действия не проявляют. Повышение влажности способствует возобновлению активности ферментов [98].
Т.к. гликозиды флавоноидов не подвергаются ступенчатому распаду при медленной сушке, наше сырье сушили в хорошо проветриваемом помещении при температуре 20-25С примерно 7 дней. Затем растения разделяли по органам - цветки, листья, стебель - и помещали в бумажные пакеты. При другом методе перед погружением в этанол свежесобранные растения разделяли по органам и измельчали ножницами до 0,5-1см, взвешивали и заливали 80% этанолом.
Растительный материал был собран в окрестностях Ботанического сада ЯФ СО РАН г.Якутска в конце июля 1995, 1997, 1998, 1999 годов, в Нюр-бинском улусе по левобережью реки Марха в конце июля 1994, 1995, 1997, 1998, 1999 годов, в Усть Алданском улусе в окрестностях с.Бэйдингэ в конце июля 1997, 1998, 1999 годов.
Влияние способов подготовки проб па сохранность рутина. Первым этапом при количественном анализе, обеспечивающим полное использование растительного материала, является подготовка проб для анализа. В большинстве известных нам работ количественный анализ флавонои-дов проводили, используя высушенные растения.
По изучению влияния способов подгоювки проб на сохранность фла-воноидов нам известно несколько работ.
Т.А.Жанаевой и сотр. [99] было проведено сравнение выхода флавонолов при экстракции их из свежих и высушенных листьев Buplerium multinerve. Результат показал, что экстракция свежих листьев обеспечивает значительно больший выход (более чем вдвое) флавонолов. В работе В.Г.Минаевой [75] по выяснению влияния подготовки проб на количество флавонолов был лримсненен еще один способ. Листья культивированных растений разных видов володушки, собранные в фазе цветения, обрабатывали следующими способами: I) сушка на воздухе при 21-23С; 2) немедленное погружение в 80% этанол. При этих двух способах качественный состав флавонолов оставался одинаковым, а количество показало большую разницу: выход флавонолов при фиксации этанолом в разных органах был выше в 1,6-3 раза.
В полевых условях сбора лекарственных растений можно использовать только 2 способа подготовки проб: воздушная сушка и немедленное погружение в этанол. Мы сравнили эти способы в наших условиях сбора растений для определения сохранности рутина при хранении. Для анализа наиболее флавоноидоносные и распространенные растения: кровохлебку лекарственную, герань луговую. Собранные в одно время растения фиксировали разными способами. Количественное определение рутина было проведено через 5 месяцев после сбора.
Результаты исследований показали наибольший выход рутина при фиксации 80% этанолом растений во время сбора по сравнению с воздушной сушкой (табл,2). В цветках кровохлебки лекарственной в цветках количество рутина при фиксации 80% этанолом выше в 1,9 раза, в листьях - 2,8, стеблях - в 6,4 раза; в цветках герани луговой - в 1,5 раза, листьях - 1,6, стеблях - в 1,5 раза.
Накопление рутина в чависимости от погодных условия
При анализе содержания БАВ большой интерес представляет вопрос влияния условий произрасіания растений на их накопление. Показанный выше широкий диапазон количественных изменений рутина в период вегетации растений позволяет полагать, что этот антиоксидант играет определенную ро;іь в приспособлении растений к изменяющимся условиям внешней среды. Для выявления влияния условий произрастания на накопление флавоноидов рутина в растениях мы провели исследования в растениях, произраставших в одном и том же месте в разные годы (левый берег р.Марха в с. Малыкай Нюрбинского улуса. 1994 и 1995 г). Условия произрастания различались только метеорологическими условиями. Изменения погодных условий мы характеризовали по средним показателям июля: суммой осадков и среднемесячной температурой (табл.5) [120,121]. Погодные условия в целом в период сбора растений более наглядно выражаются коэффициентом экстремальности (к), который равен отношению среднемесячная температура сумма осадков [32]. Коэффициенты экстремальности в июле в с.Малыкай Нюрбинского улуса 1,76 (в 1994 г) и 0,28 (в 1995г). При таких достоверных различиях погодных условий формируется тенденция к повышению содержания рутина в исследованных растениях по мере увеличения экстремальности условий произрастания (табл,5).
При этом наиболее заметные изменения в содержании рутина в зависимости от фактора экстремальности наблюдается в цветках и наименее
- в листьях. Так в цветках содержание рутина с ростом экстремальности было повышено: у кровохлебки - в 1,7 раз, тысячелистника обыкновенного
- 1,8 раз, тысячелистника хрящеватого - 2,5 раз, колокольчика круглолистного - 1,9 раз. герани - 1,6 раз. Существенных изменений не наблюдается лишь в цветках колокольчика скученного. В листьях получены следующие сравнительные данные: у кровохлебки количество рутина было повышено в 1,2 раза, тысячелистника обыкновенного - в 1,9 раз, тысячелистника хрящеватого и очитка - почти на уровне, а у герани было повышено в 1,2 раза.
Другая картина наблюдалась при анализе растений, собранных в один и тог же год (1995 г), но в разных климато-географичееких районах, характеризующихся различиями по многим экологическим параметрам: в Нюрбинском улусе и окрестностях г.Якутска. В Нюрбинском улусе растения были собраны близко от берега реки Марха в зарослях и опушке ивняка, а в г. Якутске - на открытой местности окрестностей Ботанического сада. В период сбора растений погодные условия можно считать благоприятными для этих районов (табл.5). Интересным на наш взгляд является показатель гораздо более низкого содержания рутина в тех же видах растений, но произрастающих в окрестностях г.Якутска, где коэффициент экстремальности был выше (к- 0,43), чем в том же году в Нюрбе (к=0,28 ). Это дает основание предполагать, что основной причиной повышения сип-теза рутина в более экстремальных условиях (в 1994 г. в Нюрбинском улусе) является увеличение количества ясных дней, т.е. интенсификация УФ рутина в верхнем эпидермисе листьев [113]. Это указывает па то, что именно этот флавонолгликозид играет роль защитного экрана от УФ-облучения. В других тканях, где выявлена относительно высокая активность специфических катаболизирующих ферментов (гликозидазы и фла-вонолоксидазы), содержание рутина намного ниже [112]. Вероятно, это показывает важную роль рутина как запасного дыхательного субстрата [48]. Влияние свега на синтез рутина было показано на модельных опытах с проростками гречихи [78п 114]. Повышение образования рутина в семя долях и эпикотилях гречихи происходило при длительном освещении белым светом.
Количество безоблачных дней было больше в 1994 г в ІІюрбинском улусе (табл.5). Значит, высокое содержание рутина в этот период здесь может быть объяснено, в основном, преобладанием ясных безоблачных дней во время сбора по сравнению с последующим годом сбора растений, т.е. активизацией синтеза рутина под действием УФ лучей. Это видно по высокой степени положительной корреляции накопления рутина с количе ством безоблачных дней
