Введение к работе
І.І.Актуальность проблемы. В основе процессов, обуславливающих современное состояние биосферы, лежат химические превращения веществ. Химические аспекты проблемы охраны окружающей природной среды формируют такой раздел современной химии как экологическая химия, под которой понимают науку об общих принципах химических процессов и взаимодействиях в окружающей среде (экзосфере) и последствиях таких взаимодействий (Скуратов и др., 1994). В ее основу положено исследование процессов в окружающей среде с учетом влияния антропогенных воздействий на биотические и абиотические компоненты экосистем. Это направление рассматривает, как правило, химическое загрязнение окружающей природной среды, дает характеристику основных химических загрязнителей и способов определения уровня загрязнения, разрабатывает физико-химические методы борьбы с подобным загрязнением, проводит изыскание новых экологически чистых источников энергии и т.д. Однако, загрязнение окружающей среды опасно не только прямой токсичностью, но и потенциальной возможностью нарушения информационных потоков и химической коммуникации организмов в экосистемах (Яблоков, Остроумов, 1995). Все это стало предметом нового междисциплинарного направления - химической экологии - науки о роли и функциях химических экорегуляторов (хемомедиаторов), осуществляющих определенные связи между организмами и средой в природных экосистемах, участвующих в обменных процессах и механизмах их регулирования в отдельных организмах, обуславливающих химическую (или биохимическую) стабилизацию (или дестабилизацию) равновесия в экосистемах (Барбье, 1978; Козлов, 1998).
Химический канал связи - единственный общий канал для всех без исключения живых организмов от одноклеточных, до высших позвоночных. Информация, получаемая по химическому каналу зачастую является решающей для поведения животных, которое можно определить как внешне наблюдаемое изменение состояния организма. Знания механизмов обонятельной коммуникации необходимы для понимания не только роли и места обонятельных сигналов (феромонов) в системе коммуникации животных, но и для понимания поведения животных в целом. Это также необходимо для разработки мероприятий по сохранению животного мира и созданию систем управления поведением животных, включая хозяйственно важные виды.
Для поддержания жизнеспособности популяций и обеспечения воспроизводства особей огромное значение имеет внутривидовая химическая коммуникация, осуществляемая и регулируемая феромонами - «веществами, вырабатываемыми и выделяемыми в окружающую среду живыми организмами и вызывающими специфическую ответную реакцию у воспринимающих их особей того же биологического вида» (Karlson, Lusher, 1959). В химической коммуникации исследуют, как правило, влияние обонятельных сигналов на поведение или состояние животных по классической схеме "стимул - реакция". Существенное отличие этой формы коммуникации от оптической и акустической состоит в том, что обонятельный сигнал может быть описан в виде молекулярных структур как дискретный знак, а также искусственно химически воссоздан.
Если феромонам беспозвоночных (главным образом, насекомых) посвящена большая литература (Джекобсон, 1976; Лебедева и др., 1984; Metcalf, 1998 и др.), то к началу ,,поведения наших исследований информация о феромонах и хемомедиаторах позвоночных животных практически отсутствовала.
Выяснение механизмов химической коммуникации млекопитающих предполагает систематических междисциплинарных исследований, включающих физические, мимические, биологические и семиотические подходы, что и было нами предпринято более 30
лет назад. При этом исследования проводили на различных уровнях: организменном,
молекулярно-организменном, молекулярно-клеточном и молекулярном. К настоящему времени показано множество эффектов влияния обонятельных сигналов на ЦНС, нейро-гуморальную и эндокринную системы многих видов млекопитающих, которые описываются как изменение физиологического состояния и поведения животных (Chemical Ecology: Odour Communication in Animals, 1979; Феромоны и поведение, 1982; Химическая коммуникация животных, 1986: Chemical Signals in Vertebrates, 1977-2001). Ключевыми и в значительной степени нерешенными проблемами химической коммуникации млекопитающих являются химическая природа обонятельных сигналов млекопитающих, механизмы их узнавания и условия, при которых феромоны проявляют эффективность. До настоящего времени знание природы феромонов и механизмов их функционирования в популяциях крайне недостаточны, что обусловлено прежде всего чрезвычайно малыми эффективными дозами (пикоіраммьі, фемтограммы) их действия на фоне значительно больших концентраций химического фона. Значительные трудности наблюдаются в выборе изменений адекватных форм поведения животных или физиологических ответов в результате воздействия феромонов на фоне непрерывно меняющихся внешних и внутренних воздействий на объект исследования. Так, практически отсутствуют стандартизованные подходы в поведенческом тестировании млекопитающих. Литературные сведения в этом направлении наполнены многочисленными недостаточно контролируемыми экспериментальными данными, часто не подтвержденными и противоречивыми, что затрудняет проведение обобщений и формализации результатов для создания теоретических моделей.
Исследования феромонов и механизмов химической коммуникации млекопитающих входят в современные основные направления фундаментальных исследований биологической науки - (5): 5.2. Структура и функции низкомолекулярных биорегуляторов. Дизайн и синтез новых биологически активных препаратов. 5.7. Рецепция и клеточная сигнализация. 5.12.Механизмы функционирования сенсорных и двигательных систем. 5.14. Экологические и эволюционные аспекты поведения и коммуникации. 5.28. Научные основы рационального использования и воспроизводства биологических ресурсов (Основные направления фундаментальных исследований, приложение к постановлению Президиума РАН № 233 от 1 июля 2003 г.).
1.2. Цель, задачи и основные направления исследования. Целью настоящей работы являлись систематические междисциплинарные исследования механизмов химической коммуникации млекопитающих, ведущие к пониманию процесса изменения поведения животных и физиологического состояния при действии на них химических компонентов выделений животных; разработка методологии управления поведением и физиологическим состоянием с помощью химических сигналов. Целью также была разработка соответствующих теоретических моделей, позволяющих предсказывать изменение поведения и состояния животных при воздействии обонятельных сигналов в контролируемых условиях.
Исследования осуществлялись по следующим направлениям: 1) теоретический анализ эффектов влияния пахучих веществ па изменение состояния и поведения млекопитающих; разработка основных концепций и стратегии исследований; 2) выбор объектов, форм поведения и уровней физиологических состояний особей, в наибольшей степени подверженных влиянию обонятельных сигналов в контролируемых условиях; выяснение необходимых и достаточных условий для надежного воспроизведения эффектов; выбор соответствующих методов контроля состояния и поведения; выбор подходов и методов изучения природы обонятельных сигналов и механизмов их восприятия. 3) поиск источников и установление химического состава летучих компонентов выделений, а также некоторых их возможных предшественников, у млекопитающих различных видов и выявление компонентов, влияющих на их поведение и физиологическое состояние, а также установление хемо-семантической структуры обонятельного сигнала: поиск информативных признаков в летучих компонентах (вид, пол, индивидуальность, физиологическое состояние) и алгоритмов их кодирования; 4) выяснение молекулярных механизмов восприятия пахучих веществ; 5) разработка физико-химической модели узнавания обонятельного стимула и создание искусственных обонятельных сенсоров; 6) разработка путей синтеза обонятельных стимулов и приготовление искусственных смесей летучих веществ, вызывающих изменения поведения и физиологического состояния особей; 7) выяснение механизмов влияния обонятельных сигналов на физиологическое состояние и поведение животных и разработка технологий практического применения феромонов.
В работе решались следующие задачи:
1) формулирование основных принципов химической коммуникации млекопитающих;
2) установление химического состава основных летучих компонентов секретов различных выделений представителей насекомоядных, грызунов, копытных, хищных и человека
3) разработка методологии поиска сигнальных веществ;
4) выявление и установление химической природы обонятельных сигналов вида у модельных видов грызунов;
5) выяснение химической природы сигналов пола и физиологического состояния у выхухоли, серой крысы, домовой мыши, сирийского хомяка, северного оленя, а также человека;
6) создание искусственных половых феромонов;
7) теоретический и экспериментальный анализ кодирования информации об индивидууме и его физиологическом состоянии летучими компонентами выделений: (а) выяснение онтогенеза индивидуального запаха; (б) исследование возможностей и пределы узнавания индивидуального запаха в смесях многих индивидуальных запахов; (в) выяснение закономерностей химического кодирования и алгоритмов узнавания индивидуумов по их запаху; (г) разработка метода установления давности образования следов индивидуального запаха; (д) физико-химическое исследование "обонятельного портрета" человека;
8) выделение и установление химического строения обонятельных сигналов, вызывающих агрессивное поведение по отношению к сородичам у самцов домовой мыши;
9) установление корреляции между поведенческими реакциями на обонятельные сигналы и биохимическими показателями (на примере серой крысы);
10) создание хемо-семантической модели обонятельного сигнала;
11) выяснение видоспецифичности половых феромонов и изучение релизерного и праймерного их действия;
12) разработка биоритмологического подхода в исследовании влияния обонятельных стимулов на периодически изменяющиеся физиологические состояния особей;
13) изучение эффективности действия феромонов в зависимости от экологических условий на примере ускорения полового созревания и синхронизации половой циклики самок серой крысы при действии химических сигналов самцов;
14) создание теоретической модели узнавания феромонов рецепторной системой; разработка критерия "необходимого и достаточного" в стереохимической модели обонятельного стимула на примере 5а-андрост-16-ен-3-она (андростенона) - полового феромона хряка;
15) разработка путей синтеза компонентов феромонов и их аналогов;
16) изучение роли молекулярного кислорода в рецепции пахучих веществ:
экспериментальное исследование процесса окисления кислородом воздуха пахучих
веществ на обонятельной выстилке и формулирование гипотезы об окислении пахучего
вещества как этапа молекулярных механизмов обонятельной рецепции;
17) анализ физико-химических, биохимических, биофизических и клеточных механизмов
обеспечения чувствительности обонятельной системы и разработка хемо- и биосенсоров с
использованием "обонятельных технологий";
18) изучение влияния обонятельных стимуляторов на воспроизводительные функции
свиней и коров и разработка технологии их применения в воспроизводстве. 1.3. Научная новизна и научно-теоретическое значение. Впервые сформулированы основные принципы, стратегия и основные задачи исследования химической коммуникации млекопитающих.
Установлен химический состав основных летучих компонентов секретов специфических кожных желез и других выделений выхухоли, северного оленя, американской норки, кабарги, большой песчанки, домовой мыши, серой крысы, сирийского хомяка, зубра, лошади, крупного рогатого скота, волка.
Как этологическими, так и физико-химическими методами показано, что видовая принадлежность особи кодируется химическим составом выделений; установлена химическая природа сигналов, по которым может быть определена принадлежность к своему виду у серой крысы, домовой мыши, сирийского хомяка. Найдены химические таксономические признаки млекопитающих.
Показано, что пол особей также кодируется химическим составом выделений и имеет видовую специфику. Найдены половые различия в составах компонентов однотипных выделений выхухоли, северного оленя, домовой мыши, сирийского хомяка и др.
Показана способность серых крыс распознавать по обонятельным сигналам пол и физиологическое состояние сородичей, а также пол чужого вида (черной крысы).
Впервые для млекопитающих (на примере сирийского хомяка) создан искусственный половой феромон самок, вызывающий половое поведение самцов по отношению к модели.
Создана теоретическая модель кодирования индивидуума обонятельными сигналами.
В выделениях поверхности кожи человека идентифицированы свободные высшие жирные кислоты, необходимые и достаточные для его узнавания собаками. Установлена рекордная чувствительность к высшим жирным кислотам у собак, тренированных на индивидуальное узнавание человека, и способность запоминать и различать трехкомпонентные смеси этих кислот по незначительной разнице в их количественном содержании.
Определен химический состав обонятельных сигналов, вызывающих агрессивное поведение по отношению к особям своего вида у самцов домовой мыши.
Проанализированы возможности и ограничения метода, применяемого для выявления феромонов и их компонентов, основанного на разнице времени исследования источников запаха при их парном предъявлении и оценены границы его использования.
Показана зависимость поведенческих и метаболических реакций серых крыс на обонятельные сигналы особей от иерархического положения реципиента в группе.
Разработан биоритмологический подход к оценке влияния обонятельных сигналов на репродуктивное состояние самок и показана важность ритмичности подачи обонятельного стимула для синхронизации, например, половых циклов. Разработан способ оптимизации синхронизации эстральных циклов млекопитающих при воздействии обонятельными сигналами (на примере серой крысы).
Показана возможность выявления и стимулирования охоты у свиней с помощью полового феромона хряка и его структурных аналогов. Установлено, что действие андростенона не является видоспецифическим; т.о. он представляется наиболее подходящим средством, как стандартный обонятельный стимул, в экспериментах по управлению половой циклидой и половым поведением.
Установлено, что одноразовой и кратковременной экспозиции половых обонятельных стимулов достаточно, чтобы вызвать изменение половой циклики, при этом существует, по крайней мере, два чувствительных периода: один укорачивающий цикл (фолликулярная фаза) и другой - удлиняющий (лютеальная фаза).
Изучено нарушение беременности у домовой мыши при действии обонятельных сигналов "чужого" самца и показано, что у 50% самок это происходит при свободном выборе территории с запахом своего и чужого самца. Показано, что обонятельные сигналы, влияющие на физиологическое состояние и поведение млекопитающих, являются мультикомпонентными и представляют собой набор веществ. Выяснение функции, относительной значимости и химической природы каждого из этого набора слагаемых требует постановки специальных экспериментов.
Сформулировано понятие феромона млекопитающих как "обонятельного образа" и разработана теоретическая модель узнавания обонятельного стимула. Сформулировано понятие искусственного феромона.
Обнаружены химические превращения пахучего вещества в процессе обонятельной рецепции, в которых участвует молекулярный кислород. Показано, что ощущение запаха у человека связано с наличием свободного кислорода в газовой фазе.
Разработаны пути синтеза полового феромона хряка и его функциональных аналогов, для которых также обнаружено межвидовое действие.
Показана низкая рецепторная специфичность андростенона: более 20 его неастероидных аналогов имеют тот же запах для человека.
Впервые разделены (Z) и (Е) изомеры 4(4 -трет-бутилциклогексил)-4-метилпентан-2-она - функционального аналога андростенона, и установлены их обонятельные характеристики. На примере стереоизомеров 2-метил-4-[(ІІ)-2-зндо-борнил]-циклогексанона - аналога андростенона по запаху показана зависимость запаха от абсолютной конфигурации вещества.
Получены первые углеводороды - метилиденовые аналоги андростенона, обладающие его специфическим запахом.
Установлено, что 5сс-андрост-16-ен-За-ол - компонент выделений хряка, для которого описан двойной запах - андростенона и сантала после специальной очистки теряет специфический запах андростенона, а приобретает его вновь при взаимодействии с кислородом воздуха в результате частичного образования андростенона как продукта окисления соответствующего спирта.
Сформулированы представления об андростеноновом обонятельном рецепторе и о молекулярных механизмах обонятельной рецепции андростенона как о результате связывания его и его аналогов цитозольной фракцией обонятельной выстилки.
Разработана физическая модель рецептора андростенона и его аналогов и создана смесь из двух компонентов, воспроизводящая запах андростенона, причем каждый из этих компонентов воспроизводит структуру ключевых для узнавания фрагментов стероидной молекулы, но не имеет специфического запаха андростенона. Найдена количественная корреляция структура - активность для веществ с запахом андростенона и предложена частичная ячеечная модель обонятельного андростенонового рецептора человека. 1.4. Практическое значение. Предложена новая экспериментальная модель для изучения влияния обонятельных сигналов на агрессивное поведение самцов серой крысы по отношению к самкам.
На основе обонятельных сигналов разработана комплексная приманка, увеличивающая уловистость стандартных ловушек для серых крыс, а также для некоторых других видов грызунов, эффективная в естественных условиях.
В результате установления влияния полового феромона хряка на скорость и синхронность прихода свиней в охоту разработаны методы определения охоты и стимуляции воспроизводительных функций свиней с помощью феромонов и их аналогов. Разработаны методические указания стимулирования репродукции в условиях промышленной технологии.
Учитывая межвидовой эффект полового феромона хряка и его аналогов, разработаны условия их использования также для стимуляции воспроизводительной функции коров в условиях промышленной фермы. Показано, что сезон года и принятые в хозяйствах технологии содержания и воспроизводства животных не оказывают существенного влияния на эффективность феромона. Улучшение показателей воспроизводства оказываются тем значительнее, чем хуже исходные (контрольные) данные до стимуляции. Найден наилучший режим обработки коров феромоном. Разработан лабораторный способ и устройство эффективного отделения летучих веществ от их носителей, что нашло применение в практике судебной экспертизы при кинологической идентификации личности.
Показана принципиальная возможность создания высокочувствительных биосенсоров на определенные компоненты выделений млекопитающих с использованием "обонятельных технологий".
1.4. Основные положения, выносимые на защиту.
1. Основные принципы химической коммуникации млекопитающих.
2. Стратегия изучения обонятельных сигналов млекопитающих.
3. Химический состав основных летучих компонентов выделений более 20 видов млекопитающих.
4. Химические таксономические признаки млекопитающих. Феромон принадлежности особи к своему виду.
5. Химические признаки пола. Искусственный половой феромон.
6. Химические признаки индивидуального узнавания. Кон специфический феромона агрессивного поведения у самцов домовой мыши.
7. Понятие феромона как "обонятельного образа". Хемо-семантическая структура сигнала.
8. Обонятельная приманка для грызунов.
9. Биоритмологический подход к воздействию химических сигналов на репродуктивное состояние самок.
10. 5а-андрост-16-ен-3-он - как релизер- и праймер-феромон. Технология стимулирования воспроизводительных функций свиней и коров.
11. Пути синтеза андростенона и его неастероидных функциональных аналогов. Качественная и количественная зависимость структура - обонятельная активность.
12. Модель андростенонового обонятельного рецептора. Молекулярные механизмы обонятельной рецепции.
1.5. Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 210 работах, а также доложены на I Всесоюзной конференции по структуре и функции обонятельного анализатора животных и человека и их моделированию (Москва, 1969); II-VI Всесоюзных симпозиумах по механизмам сенсорной рецепции (Пушино, 1971, 1976, 1979,1984, 1988); III Советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений (Ташкент, 1973); II Всесоюзном совещании по развитию исследований и опытно-производственных работ по синтезу и применению аттрактантов, гормональных препаратов и стерилизации для борьбы с вредителями с/х культур (Эчмиадзин, 1973); I-VI International Theriological Congress, (Moscow, 1974; Brno, 1978; Helsinki, 1982; Edmontone, 1985; Rome, 1989; Sydney, 1993); II Всесоюзном симпозиуме по хеморецепции насекомых (Вильнюс, 1975); Work shop seminar on chemical communication (Borgofial, Sweden, 1976); II, III Всесоюзных конференциях по поведению животных (Москва, 1976,1983); lFAC-Symposium on Control Mechanisms in Bio- and Ecosystems (Leipzig, 1977); XXVII International Congress of Physiological Science (Paris, 1977); I-III Всесоюзных совещаниях по химической коммуникации животных (Москва, 1979, 1983, 1990); V Всесоюзном совещании по грызунам (Саратов, 1980); Пленумах научного совета по проблеме "Биологические основы освоения, реконструкции и охраны животного мира" (Ереван, 1981; Фрунзе, 1985); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); I Рабочем совещании по серой крысе (Москва, 1983); I Всесоюзной конференции по организационно-технологическим, селекционно-генетическим и социально-психологическим проблемам управления поведением сельскохозяйственных животных при интенсификации животноводства (Харьков, 1983); VI Всесоюзном совещании по грызунам (Ленинград, 1983); 16 Конференции федерации европейских биохимических обществ (Москва, 1984); I Всесоюзной школе по поведению животных (Звенигород, 1984); Всесоюзном совещании семинаре ВДНХ СССР по воспроизводству свиней при поточной системе производства свинины (Москва, 1985); IX Всесоюзном совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1986); International Symposium on Applied Ethology in Farm Animals (Balatonfured, Hungary, 1986); Республиканская научная конференция "Состояние и перспективы развития биотехнологии в животноводстве" (Харьков, 1988); VIII Symposium ECRO (Coventry, 1988); VI, IX International Symposium on Chemical Signals in Vertebrates (Philadelphia, 1991, Krakow, 2000); XIII, XIV Annual Meeting of AChemS (USA, 1991, 1992); Школах по молекулярной биологии (Черноголовка, 1993, 1995); 2, 3 Международном симпозиуме по механизмам действия сверхмалых доз (Москва, 1995, 2002), Russian-American Work-Shop on Sensory Biology and Biosensors (Санкт-Петербург, 1995); XXV, XXVI International Ethological Conference (Vienna, 1997, Bangalore, 1999 ); II Международном семинаре РФФИ "Результаты фундаментальных исследований в медицине и биотехнологии для инвестиций (Москва, 1998); Euro-American Mammal Congress "Challenges in Holarctic Mammals" (Spain, 1998); II Съезде биофизиков России (Москва, 1999); Conference on Genetics and Molecular Biology (Lviv, Ukraine, 2000); XVIII Съезде физиологического общества имени И.П.Павлова (Казань, 2001); VI, VII Международной междисциплинарной конференции по биологической психиатрии "Стресс и поведение" (Москва, 2001, 2003); Международной научно-практической конференции "Здоровье в XXI веке - 2002" (Москва - Тула); Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2003); VII съезде Териологического общества (Москва, 2003).
В качестве приглашенного докладчика автор представлял результаты своих работ на семинарах и коллоквиумах: в Monell Chemical Senses Center (Philadelphia, US АР A, 1989, 1991), Virginia Commonwealth University (Richmond, VA, 1990), North Carolina State University (Raleigh, NC, 1991), Cornell University (Ithaca, NY, 1992), Московский семинар по компьютерной генетике (Москва, 2002); Institute of Animal Reproduction and Food Research of the Polish Academy of Science (Olsztyn, Poland, 2002).
Личный вклад соискателя. В основу диссертационной работы положены исследования, в которых соискатель ставил проблему, подбирал объекты и методы исследования, планировал эксперимент, принимал участие в обработке и оценке результатов и формулировании выводов.
